基因芯片chapter8.ppt

1、生物信息學(xué)在基因芯片中的應(yīng)用,第一節(jié) 概述,. 基因芯片簡介,生物信息學(xué)和基因芯片是生命科學(xué)研究領(lǐng)域中的兩種新方法和新技術(shù)，生物信息學(xué)與基因芯片密切相關(guān)，生物信息學(xué)促進(jìn)了基因芯片的研究與應(yīng)用，而基因芯片則豐富了生物信息學(xué)的研究內(nèi)容,（）基因芯片的基本原理及生物信息學(xué)的作用,基因芯片（gene chip），又稱DNA微陣列（microarray），是由大量DNA或寡核苷酸探針密集排列所形成的探針陣列，其工作的基本原理是通過雜交檢測信息。 基因芯片把大量已知序列探針集成在同一個(gè)基片上，經(jīng)過標(biāo)記的若干靶核酸序列通過與芯片特定位置上的探針雜交,便可根據(jù)堿基互補(bǔ)匹配的原理確定靶基因的序列。,根據(jù)探針的類

2、型和長度，基因芯片可分為兩類。 其中一類是較長的DNA探針（100mer）芯片 這類芯片的探針往往是PCR的產(chǎn)物，通過點(diǎn)樣方法將探針固定在芯片上，主要用于RNA的表達(dá)分析。 另一類是短的寡核苷酸探針芯片 其探針長度為25 mer左右，一般通過在片（原位）合成方法得到，這類芯片既可用于RNA的表達(dá)監(jiān)控，也可以用于核酸序列分析。,原理 - 通過雜交檢測信息,一組寡核苷酸探針,TATGCAATCTAG,CGTTAGAT,ACGTTAGA,ATACGTTAGATC,TACGTTAG,由雜交位置確定的一組,核酸探針序列,GTTAGATC,雜交探針組,TATGCAATCTAG,重組的互補(bǔ)序列,靶序列,TA

3、CGTTAG,ACGTTAGA,ATACGTTA,CGTTAGAT,GTTAGATC,ATACGTTA,基因芯片,熒光標(biāo)記的樣品,共聚焦顯微鏡,獲取熒光圖象,雜交結(jié)果分析,探 針 設(shè) 計(jì),雜交,（）基因芯片制備,基因芯片的制備主要有兩種基本方法: 一是在片合成法， 在片合成法是基于組合化學(xué)的合成原理,它通過一組定位模板來決定基片表面上不同化學(xué)單體的偶聯(lián)位點(diǎn)和次序。在片合成法制備DNA芯片的關(guān)鍵是高空間分辨率的模板定位技術(shù)和固相合成化學(xué)技術(shù)的精巧結(jié)合。 另一種方法是點(diǎn)樣法。 基因芯片點(diǎn)樣法首先按常規(guī)方法制備cDNA（或寡核苷酸）探針庫，然后通過特殊的針頭和微噴頭, 分別把不同的探針溶液，逐點(diǎn)分配

4、在玻璃、尼龍或者其它固相基底表面上不同位點(diǎn),并通過物理和化學(xué)的結(jié)合使探針被固定于芯片的相應(yīng)位點(diǎn)。,（）靶基因樣品的制備及芯片雜交,根據(jù)基因芯片的檢測目的不同,可以把樣品制備方法分為 用于表達(dá)譜測量的mRNA樣品制備 用于多態(tài)性(或突變)研究的基因樣品的制備,（）雜交信號(hào)檢測,對(duì)于用熒光素標(biāo)記經(jīng)擴(kuò)增（也可用其他放大技術(shù)）的序列或樣品，與芯片上的探針進(jìn)行雜交，然后沖洗，采集熒光圖像。 圖像的采集用落射熒光顯微鏡 或電荷偶聯(lián)裝置照相機(jī) 非共聚焦激光掃描儀等進(jìn)行。,. 基因芯片對(duì)于生物分子信息檢測的作用和意義,在生命科學(xué)領(lǐng)域中，基因芯片為分子生物學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等研究提供了強(qiáng)有力的手段。 利用基因芯片技術(shù)

5、，可研究生命體系中不同部位、不同生長發(fā)育階段的基因表達(dá)，比較不同個(gè)體或物種之間的基因表達(dá)，比較正常和疾病狀態(tài)下基因及其表達(dá)的差異。 基因芯片技術(shù)也有助于研究不同層次的多基因協(xié)同作用的生命過程，發(fā)現(xiàn)新的基因功能，研究生物體在進(jìn)化、發(fā)育、遺傳過程中的規(guī)律。,. 基因芯片研究和應(yīng)用中所涉及到的生物信息學(xué)問題,提取什么信息 如何提取信息 如何處理和利用信息,確定芯片檢測目標(biāo) 芯片設(shè)計(jì) 數(shù)據(jù)管理與分析,探針設(shè)計(jì) 解決雜交條件一致性問題,芯片優(yōu)化 提高芯片制備效率,公共 數(shù)據(jù)庫,專用 數(shù)據(jù)庫,確定目標(biāo) 選擇待檢測的目標(biāo)序列,數(shù)據(jù)分析 分析雜交檢測結(jié)果及可靠性,基因芯片 數(shù)據(jù)庫,圖像處理,數(shù) 據(jù) 庫 查 詢

6、 序 列 分 析,生 物 信 息 學(xué) 數(shù) 據(jù) 挖 掘 數(shù) 據(jù) 可 視 化,雜交檢測圖像,基因芯片數(shù)據(jù)流圖,（）生物信息學(xué)在基因芯片中的應(yīng)用,生物信息學(xué)在基因芯片中的應(yīng)用主要體現(xiàn)在三個(gè)方面: 確定芯片檢測目標(biāo) 芯片設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)管理與分析,（）基因芯片研究與應(yīng)用中 所要解決的信息學(xué)問題,在基因芯片信息學(xué)方面要解決以下幾個(gè)關(guān)鍵的問題: 第一是芯片設(shè)計(jì)問題 第二是可靠性分析問題 第三是數(shù)據(jù)挖掘問題,第二節(jié) 基因芯片設(shè)計(jì),. 基因芯片設(shè)計(jì)的一般性原則 基因芯片設(shè)計(jì)主要包括兩個(gè)方面: (1)探針的設(shè)計(jì) 指如何選擇芯片上的探針 (2)探針在芯片上的布局 指如何將探針排布在芯片上。,確定芯片所要檢測的目標(biāo)對(duì)

7、象 查詢生物分子數(shù)據(jù)庫 取得相應(yīng)的DNA序列數(shù)據(jù) 序列對(duì)比分析 找出特征序列，作為芯片設(shè)計(jì)的參照序列。 數(shù)據(jù)庫搜索 得到關(guān)于序列突變的信息及其它信息。,在進(jìn)行探針設(shè)計(jì)和布局時(shí)必須考慮以下幾個(gè)方面： (1)互補(bǔ)性 (2)敏感性和特異性 (3)容錯(cuò)性 (4)可靠性 (5)可控性 (6)可讀性,. DNA變異檢測型芯片與基因表達(dá)型芯片的設(shè)計(jì),對(duì)于DNA序列變異分析，最基本的要求是能夠檢測出發(fā)生變異的位置，進(jìn)一步的要求是能夠發(fā)現(xiàn)發(fā)生了什么樣的變化。 從雜交的單堿基錯(cuò)配辨別能力來看，當(dāng)錯(cuò)配出現(xiàn)在探針中心時(shí)，辨別能力強(qiáng)，而當(dāng)錯(cuò)配出現(xiàn)在探針兩端時(shí)，辨別能力非常弱。所以，在設(shè)計(jì)檢測DNA序列變異的探針時(shí)，檢測

8、變化點(diǎn)應(yīng)該對(duì)應(yīng)于探針的中心，以得到最大的分辨率。,. cDNA芯片與寡核苷酸芯片的設(shè)計(jì),cDNA芯片設(shè)計(jì)的關(guān)鍵在于數(shù)據(jù)庫的建立和數(shù)據(jù)庫信息的利用以及各種文庫的建立。 cDNA芯片制備方法一般采用點(diǎn)樣法，多用于基因表達(dá)的監(jiān)控和分析。 寡核苷酸芯片制備一般采用在片合成方法。優(yōu)化是寡核苷酸芯片設(shè)計(jì)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，包括探針的優(yōu)化和整個(gè)芯片設(shè)計(jì)結(jié)果的優(yōu)化。,. 寡核苷酸探針的優(yōu)化設(shè)計(jì),. 基因芯片布局,雜 交 模 式,探 針 布 局 圖,Target T C C G T T A G C T G A C T G C,AGCT,TG變異,. 基因芯片布局,基于Tm值梯度場的布局方法,凸點(diǎn)均勻分布布局方法,（

9、a） (b) 凸點(diǎn)均勻分布優(yōu)化結(jié)果示意 (a)優(yōu)化前； (b)優(yōu)化后。,. 基因芯片優(yōu)化,高密度寡核苷酸芯片設(shè)計(jì)的結(jié)果是形成芯片合成方案和步驟，產(chǎn)生制作掩膜板的CAD文件。高密度基因芯片制備的一個(gè)關(guān)鍵是掩膜板技術(shù)，利用掩膜板進(jìn)行定位并控制探針的在片合成，從而得到很高的探針密度。 但是制作掩膜板的代價(jià)較高，為了盡可能地提高基因芯片制備效率，需要對(duì)設(shè)計(jì)好的基因芯片進(jìn)行優(yōu)化，以減少制備芯片所需要的掩膜板個(gè)數(shù)，同時(shí)也減少芯片探針循環(huán)合成次數(shù)，這對(duì)于基因芯片應(yīng)用有著重要的意義。,第三節(jié) 基于芯片的序列分析,. 測定未知序列 早期基于芯片雜交的序列分析實(shí)驗(yàn)中，芯片上的探針是長度為k（一般為8）的所有寡核苷

10、酸的組合。這是一種完備的探針集合，根據(jù)互補(bǔ)關(guān)系，通過各個(gè)探針的雜交結(jié)果確定DNA靶序列中存在的所有k長度片段，形成靶序列的k長度片段譜，然后根據(jù)這些片段重構(gòu)靶序列。,. 直接檢測目標(biāo)序列,在同一塊芯片上設(shè)計(jì)多組探針，每一組探針分別檢測一條目標(biāo)序列，探針的長度在20到30之間。一般要求同一組探針之間相互獨(dú)立，盡可能不重疊或少重疊，以提高探針的敏感性和特異性。,. DNA序列突變檢測分析,有兩種方法可以進(jìn)行已知突變點(diǎn)的分析: 一種方法是對(duì)于目標(biāo)序列上已知的突變點(diǎn)，以該點(diǎn)為中心，從目標(biāo)序列選取一個(gè)片段，作為設(shè)計(jì)探針的參考序列。根據(jù)參考序列，分別設(shè)計(jì)四個(gè)高度特異的探針，這四個(gè)探針除中心位置外均相同并與

11、參考序列互補(bǔ) 另一種方法是對(duì)于目標(biāo)序列上已知的突變點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)四組探針，其中每一組探針分別檢測一種核苷酸替換。同一組中的各個(gè)探針長度相同，相互之間交疊，并且每個(gè)探針均覆蓋對(duì)應(yīng)的突變點(diǎn)。,. 基因型和多態(tài)性分析,在同一物種不同種群和個(gè)體之間，有著多種不同的基因型，這往往與個(gè)體的不同性狀和多種遺傳性疾病有著密切的關(guān)系。通過對(duì)大量具有不同性狀的個(gè)體的基因型進(jìn)行比較，就可以得出基因與性狀的關(guān)系。,為了進(jìn)行SNPs研究，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)序列上可能出現(xiàn)的變化，最直接的方法就是根據(jù)已知的目標(biāo)序列設(shè)計(jì)一系列寡核苷酸探針，其中每一個(gè)探針用于檢測目標(biāo)序列特定位置上的核苷酸是否發(fā)生變化，探察位置位于探針的中心。這種方法又稱

12、等長等覆蓋移位法,第二種方法為單核苷酸分析法。針對(duì)目標(biāo)序列每個(gè)位置上所有可能出現(xiàn)的變化設(shè)計(jì)相應(yīng)的探針。,第四節(jié) 基于芯片的基因功能分析,. 基因表達(dá)分析 基因表達(dá)是根據(jù)基因的DNA模板進(jìn)行mRNA和蛋白質(zhì)合成的過程，各種基因的表達(dá)存在差異，一種組織中基因表達(dá)水平的差異可達(dá)1萬倍。功能基因研究的一種重要的方法就是采用高通量基因表達(dá)檢測技術(shù)，全面分析基因的表達(dá)水平，了解基因的功能。,. 高密度基因表達(dá)芯片,. 基因表達(dá)圖譜,基于芯片的表達(dá)監(jiān)控實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生大量的數(shù)據(jù)，在這些數(shù)據(jù)背后隱藏著豐富的基因相互作用、基因功能信息，需要通過細(xì)致的數(shù)據(jù)分析揭示這些信息，得到有益的結(jié)果 這種根據(jù)基因芯片獲得的新的表達(dá)圖

13、譜有別于以前的物理圖和功能圖，它能夠更為直接地揭示基因組中各基因相互關(guān)系。,. 尋找基因功能,DeRisi等應(yīng)用酵母cDNA基因芯片研究在有絲分裂和孢子狀態(tài)下基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平的差異。 Affymetrix公司制備的酵母基因表達(dá)型芯片，包括酵母基因組開放讀碼框中的260 000個(gè)25mer探針陣列。Wodicka 等采用這種基因芯片對(duì)不同生活狀態(tài)下酵母細(xì)胞的基因表達(dá)進(jìn)行了研究。,第五節(jié) 基因芯片檢測結(jié)果的分析,. 熒光檢測圖像處理 基因芯片與樣本雜交以后，用圖像掃描儀器捕獲芯片上的熒光圖像。在計(jì)算機(jī)中，一幅圖像由二維象素點(diǎn)所組成，通常用一個(gè)8-bit的整數(shù)存貯象素點(diǎn)的灰度值，取值范圍為0,25

14、5，其中0代表“黑”，255代表“白”。,一個(gè)理想的基因芯片圖像具有以下幾個(gè)性質(zhì)： （1）芯片單元的形狀和尺寸相同； （2）每個(gè)單元的中心位于象素點(diǎn)上； （3）無灰塵等引起的噪聲信號(hào)； （4）最小和均勻的圖像背景強(qiáng)度。,網(wǎng)格定位結(jié)果,背景濾除,熒光信號(hào)提取,. 檢測結(jié)果分析,如果芯片檢測的目的是測定樣本序列，則需要根據(jù)芯片上每個(gè)探針的雜交結(jié)果判斷樣本中是否含有對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)序列片段，并利用生物信息學(xué)中的片段組裝算法連接各個(gè)片段，形成更長的目標(biāo)序列。,如果芯片檢測的目的是進(jìn)行序列變異分析，則要根據(jù)全匹配探針以及錯(cuò)配探針在基因芯片對(duì)應(yīng)位置上的熒光信號(hào)強(qiáng)度，給出序列變化的位點(diǎn)，并指明發(fā)生什么變化。,如果

15、芯片檢測的目的是進(jìn)行基因表達(dá)分析，則需要給出芯片上各個(gè)基因的表達(dá)圖譜，定量描述基因的表達(dá)水平，進(jìn)一步的分析還包括根據(jù)基因表達(dá)模式進(jìn)行聚類，尋找基因之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)協(xié)同工作的基因,. 檢測結(jié)果可靠性分析,可靠性分析可以從兩個(gè)方面進(jìn)行： 一是根據(jù)實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)誤差（如探針合成的錯(cuò)誤率、全匹配探針與錯(cuò)配探針的誤識(shí)率等），計(jì)算出基因芯片最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。 二是對(duì)基因芯片與樣本序列雜交過程進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)研究，建立芯片雜交過程的計(jì)算機(jī)仿真實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，以便在制作芯片之前分析所設(shè)計(jì)芯片的性能，預(yù)測芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。,. 數(shù)據(jù)分析,基因芯片數(shù)據(jù)分析包括實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)管理、數(shù)據(jù)質(zhì)量控制、數(shù)據(jù)處理等 進(jìn)一步將基因芯片實(shí)

16、驗(yàn)數(shù)據(jù)與公共數(shù)據(jù)庫中的信息相關(guān)聯(lián)，利用數(shù)據(jù)挖掘方法進(jìn)行分析處理，揭示各種數(shù)據(jù)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)新的生物學(xué)知識(shí)。,第六節(jié) 基因芯片信息的管理和利用,. 芯片信息管理 目前已出現(xiàn)一些芯片信息管理數(shù)據(jù)庫，這些數(shù)據(jù)庫主要收集、管理表達(dá)型基因芯片的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。與基因芯片相關(guān)的信息包括芯片功能的描述、芯片的描述、實(shí)驗(yàn)對(duì)象的描述、實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析結(jié)果的描述。,以基因表達(dá)型芯片為例，數(shù)據(jù)庫至少含有下列信息： (1)數(shù)據(jù)來源 (2)雜交目標(biāo)序列 (3)目標(biāo)對(duì)象 (4)mRNA轉(zhuǎn)錄的數(shù)量 (5)統(tǒng)計(jì)的顯著性,.數(shù)據(jù)集成和交叉索引,基因組信息是相互關(guān)聯(lián)的，合理地解釋實(shí)驗(yàn)檢測數(shù)據(jù)依賴于將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與其它相關(guān)數(shù)據(jù)庫的集成。 對(duì)于基因表達(dá)數(shù)據(jù)，通過用戶定義的或缺省的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行數(shù)據(jù)鏈接，經(jīng)分析可以得到關(guān)于基因調(diào)控的概貌。,常用的表達(dá)譜分析軟件General Microarray Analysis Software,ArrayTools DChip（DNA-Chip Analyzer） SAM