免疫學(xué)原理★第11章生物素-親合素放大技術(shù).ppt

1、第十一章 生物素-親合素放大技術(shù),第二節(jié) 親合素、鏈霉親合素的理化性質(zhì)與標(biāo)記 一、理化特性 二、親合素（或鏈酶親合素）的標(biāo)記,第一節(jié) 生物素的理化性質(zhì)與標(biāo)記一、活化生物素二、活化生物素標(biāo)記蛋白質(zhì),第三節(jié) 生物素-親合素系統(tǒng)的特點(diǎn)一、靈敏度二、特異性三、穩(wěn)定性四、適用性五、其他,思考題 小結(jié),第四節(jié) 生物素-親合素系統(tǒng)的應(yīng)用一、生物素-親合素系統(tǒng)基本類型及原理二、生物素-親合素系統(tǒng)在酶免疫測(cè)定中的應(yīng)用三、生物素-親合素系統(tǒng)在熒光免疫技術(shù)中的應(yīng)用四、生物素-親合素系統(tǒng)在放射免疫測(cè)定中的應(yīng)用五、生物素-親合素系統(tǒng)在分子生物學(xué)中的應(yīng)用,維生素H 動(dòng)、植物組織中廣泛 分布,卵黃和肝含量高 MW 244.

2、31kD.,I環(huán)為咪唑酮環(huán)，可與親合 素結(jié)合 環(huán)為噻吩環(huán)，C2上戊酸 側(cè)鏈的未端羧基是結(jié)合生 物大分子的唯一結(jié)構(gòu),I 咪唑酮環(huán), 噻吩環(huán),羧基,第一節(jié) 生物素理化性質(zhì)與標(biāo)記,一、活化生物素,生物素側(cè)鏈的末 端羧基經(jīng)化學(xué)修 飾后制成帶各種 活性基團(tuán)的衍生 物活化生物素 (生物素化衍生物),生物素活化,活化生物素易 與抗原、抗體 酶及核酸分子 中相應(yīng)基團(tuán)偶 聯(lián)形成生物素 化標(biāo)記物,標(biāo)記蛋白質(zhì)氨基的活化生物素,標(biāo)記蛋白質(zhì)醛基的活化生物素,標(biāo)記蛋白質(zhì)巰基的活化生物素,標(biāo)記核酸的活化生物素,活化生物素,標(biāo)記蛋白質(zhì)氨基的活化生物素,BNHS分子可與蛋白質(zhì) 賴氨酸的氨基形成肽鍵 BNHS適用標(biāo)記抗體和 中性

3、或偏堿性的蛋白質(zhì),生物素,N-羥基丁二酰胺,碳二亞胺,生物素羥 基琥珀酰 亞胺酯（ BNHS ）,如何減小空間位阻？ 長臂活化生物素（BCNHS）： 生物素和N-羥基丁二酰亞胺之間添 加了兩個(gè)6-氨基已糖分子基團(tuán)，形 成連結(jié)臂，生物素與大分子基團(tuán)的 距離,標(biāo)記蛋白質(zhì)醛基的活化生物素,生物素酰肼(BHZ)：水合肼與生物素的合成物 主要用于標(biāo)記偏酸性糖蛋白 肼化生物胞素(BCHZ) ：生物素與賴氨酸連接 后，再與無水肼反應(yīng)而成。 除醛基外， BCHZ還可標(biāo)記氨基,標(biāo)記蛋白質(zhì)巰基的活化生物素,馬來酰亞胺-丙酰-生物胞素（MPB) 能特異地與蛋白質(zhì)巰基結(jié)合的活化 生物素,標(biāo)記核酸的活化生物素,光生物素

4、(photobiotin) 側(cè)鏈上連接的芳香基疊氮物基團(tuán), 經(jīng)光照后, 變?yōu)榉枷?基硝基苯，可直接與腺嘌呤氨基結(jié)合, 形成B-核酸探針,生物素脫氧核苷三磷酸（Bio-dUTP） 作為TTP的結(jié)構(gòu)類似物，可采用缺口移 位法摻入到雙鏈DNA中。,BNHS和BHZ 可直接標(biāo)記核酸， 但對(duì)堿基配對(duì)有影 響。,活化生物素通過側(cè)鏈與蛋白分子連接； 一個(gè)蛋白分子可被多個(gè)生物素標(biāo)記多價(jià)性； 對(duì)BNHS多標(biāo)記抗體, BHZ則多標(biāo)記微酸性抗原； 抗原、抗體標(biāo)記后活性不變； 可對(duì)標(biāo)記材料（如酶）標(biāo)記：堿性磷酸酶標(biāo)記后 活性將降低；,二、生物素標(biāo)記蛋白質(zhì),選擇活化生物素：依抗原或抗體分子所帶可標(biāo)記基團(tuán) 的種類（氨基、

5、醛基或巰基）以及分子的酸堿性； 控制生物素：蛋白質(zhì)比例 生物素：IgG 用量比(mg/mg)宜為2:1, IgG應(yīng)用濃度 0.55g/ml; 生物素13個(gè)/Ag，35個(gè)/Ab； 使用交聯(lián)臂減少空間阻力,第二節(jié) 親合素、鏈霉親合素的理化性質(zhì)與標(biāo)記,親合素(avidin, AV) 和鏈霉親合素(streptavidin, SA)是生物素的天然特異性結(jié)合物。而且，二者均為大分子蛋白，因此幾乎所有用于標(biāo)記的物質(zhì)均可以同親合素（AV）或鏈酶親合素（SA）結(jié)合。,結(jié)構(gòu) 四亞基糖蛋白 四肽鏈蛋白 無糖基 PI 10.5 6 結(jié)合位 色氨酸 色氨酸 生物素 4 4 Ka 1015 1015 活性 1315 1

6、518,親合素（A）,鏈霉親合素(SA),一、理 化 特 性,二、親合素/鏈霉親合素標(biāo)記,標(biāo)記物：酶、膠體金 異硫氰酸熒光素（FITC） HRP-AV(SA) 過碘酸鈉、戊二醛 ABC/SABC 預(yù)制AV(SAV)-Biotin,第三節(jié) 生物素-親合素系統(tǒng)的特點(diǎn),一、靈敏度 二、特異性 三、穩(wěn)定性 四、適用性 五、其他,第四節(jié) 生物素-親合素系統(tǒng)的應(yīng)用,生物素與親合素之間結(jié)合的親合力高、特異性強(qiáng)，各自均可以與各型大小分子結(jié)合，以及二者在結(jié)合反應(yīng)時(shí)具有的多級(jí)放大作用等優(yōu)越性，使BAS及其相關(guān)技術(shù)被廣泛應(yīng)用在各種標(biāo)記免疫分析技術(shù)領(lǐng)域中，尤其為標(biāo)記免疫檢測(cè)自動(dòng)化分析做出了極大的貢獻(xiàn)。,一、生物素-親

7、合素系統(tǒng)基本類型及原理,BAB法： Ag+BAb Ag-AbB A Ag-AbB-A BE Ag-AbB-A-BE 特點(diǎn)：以游離A分別連接B-Ab和B-E,BA法 Ag+BAb Ag-AbB AE Ag-AbB-A-BE 特點(diǎn)：以A-E/SA-E代替BAB法中的A，省 卻了加B-E的步驟,3.,ABC法 A+BE A- BE-ABC Ag+BAb Ag-AbB ABC Ag-AbB-ABC 特點(diǎn):將BAB法中的A先與B-E結(jié)合，制備成復(fù)合物ABC,二、生物素-親合素系統(tǒng)在酶免疫測(cè)定中的應(yīng)用,BAS在ELISA中的應(yīng)用 生物素-親合素系統(tǒng)在均相酶免疫測(cè)定,三、生物素-親合素系統(tǒng)在熒光免疫技術(shù)中的

8、應(yīng)用,BAS用于熒光抗體技術(shù)，通常采用BA法，即用熒光素直接標(biāo)記親合素（或鏈酶親合素）；也可采用游離親合素（或鏈酶親合素）搭橋，兩端分別連接生物素化抗體和熒光素標(biāo)記的生物素（BAB法）或熒光標(biāo)記的抗親合素（或鏈酶親合素）抗體的夾心法。,四、生物素-親合素系統(tǒng)在放射免疫測(cè)定中的應(yīng)用,BAS主要與免疫放射分析(IRMA)檢測(cè)體系偶聯(lián)，用于對(duì)終反應(yīng)的放大（BA法） BAS也可用于IRMA反應(yīng)后B、F成分的分離,五、生物素-親合素系統(tǒng)在分子生物學(xué)中的應(yīng)用,以生物素標(biāo)記核酸探針進(jìn)行的定位檢測(cè) 用BAS制備的親和吸附劑進(jìn)行基因的分離純化 將免疫測(cè)定技術(shù)與PCR結(jié)合建立免疫-PCR(immuno-PCR)用

9、于抗原的檢測(cè),思考題,生物素的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是什么？ 生物素通過什么結(jié)構(gòu)、形式與生物大分子相連結(jié)？ 親合素或鏈霉親合素的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)有何特點(diǎn)？ 為什么親合素、鏈霉親合素具有“橋聯(lián)”作用？ 親合素、鏈霉親合素可以被哪些示蹤劑標(biāo)記？ 為什么生物素親合素系統(tǒng)具有放大作用？ 生物素與親合素或鏈霉親合素的結(jié)合是否與抗原抗體結(jié)合相同？ 生物素親合素系統(tǒng)放大的是反應(yīng)過程還是單一檢測(cè)信號(hào)的能量？ 生物素、親合素或鏈霉親合素如何與標(biāo)記免疫技術(shù)聯(lián)接？ 如何將生物素鏈霉親合素放大系統(tǒng)用于所有雙位點(diǎn)ELISA?,小 結(jié),生物素親合素（鏈霉親合素）系統(tǒng)具有的多級(jí)放大獨(dú)特效應(yīng)，可極大地提高分析測(cè)定的靈敏度；二者之間的高親和、高特異結(jié)合以及既可偶聯(lián)生物大分子，又可連接標(biāo)記材料的特性，使該系統(tǒng)在標(biāo)記免疫分析技術(shù)領(lǐng)域中的應(yīng)用具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性和適用性。該系統(tǒng)有二種基本類型：以游離親合素為中間物，分別連接包含生物素化大分子的待檢反應(yīng)體系和標(biāo)記生物素的BAB法或ABC技術(shù)；另一類是直接用標(biāo)記親合素連接生物素化大分子反應(yīng)體系進(jìn)行檢測(cè)的BA法或LAB。,在生物素親合素（鏈霉親合素）放大系統(tǒng)應(yīng)用中，無論采用