NGS測(cè)序技術(shù)與分析流程圖ppt課件

1、第一代測(cè)序技術(shù),Sanger測(cè)序,1977年，桑格測(cè)定了第一個(gè)基因組序列，是噬菌體X174的，全長(zhǎng)5375個(gè)堿基,1,Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2和3都不含羥基，其在DNA的合成過程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以用來中斷DNA合成反應(yīng)，在4個(gè)DNA合成反應(yīng)體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標(biāo)記的ddNTP（分為：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通過凝膠電泳和放射自顯影后可以根據(jù)電泳帶的位置確定待測(cè)分子的DNA序列,2,新一代測(cè)序介紹,三大測(cè)序平臺(tái)的前世今生,Lynx MPSS,Solexa,ABI SOLiD,454,Ion Torrent,Helicos

2、,SMRT,Illumina Solexa,Roche 454,Polony Seq,ABI Ion Torrent,Pacific Biosciences,3,Roche-454,454公司可謂新一代測(cè)序技術(shù)的奠基人。2005年底，454公司推出了革命性的基于焦磷酸測(cè)序法的超高通量基因組測(cè)序系統(tǒng)Genome Sequencer 20 System，被Nature雜志以里程碑事件報(bào)道，開創(chuàng)了邊合成邊測(cè)序（sequencing-by-synthesis）的先河。之后，454公司被羅氏診斷公司以1.55億美元收購(gòu)。 454測(cè)序原理,4,測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：,1、文庫(kù)制備：根據(jù)樣品的種類和實(shí)驗(yàn)?zāi)康模瑢⒒?/p>

3、組DNA/cDNA片段化處理至400-800bp間，經(jīng)末端修復(fù)與特異性接頭連接等修飾后變性處理回收單鏈的DNA（sstDNA）；然后和兩個(gè)44個(gè)堿基長(zhǎng)的銜接子（adaptor）A、B進(jìn)行平端連接。A、B 銜接子各自含有20個(gè)堿基的PCR 引物序列、20個(gè)堿基的測(cè)序引物序列和4個(gè)堿基的對(duì)照序列（TACG），除此之外，B銜接子的5端還標(biāo)記有一個(gè)生物素基團(tuán)，供后續(xù)的分離合適的測(cè)序模板使用。,5,測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：,2、Emulsion PCR：特定比例的單鏈DNA文庫(kù)被固定在特別設(shè)計(jì)的DNA捕獲磁珠上，使大部分磁珠磁珠攜帶了一個(gè)獨(dú)特的單鏈DNA片斷。磁珠結(jié)合的文庫(kù)被擴(kuò)增試劑乳化，形成油包水的混合物，每個(gè)

4、獨(dú)特的片斷在自己的微反應(yīng)器里進(jìn)行獨(dú)立的擴(kuò)增，而不受其他的競(jìng)爭(zhēng)性或者污染性序列的影響。整個(gè)片段文庫(kù)的擴(kuò)增平行進(jìn)行。擴(kuò)增后產(chǎn)生了幾百萬個(gè)相同的拷貝。隨后，乳液混合物被打破，擴(kuò)增后仍結(jié)合在磁珠上的片段既可被回收純化用于后續(xù)的測(cè)序?qū)嶒?yàn)；,6,測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：,3、測(cè)序反應(yīng)：攜帶DNA的珠子與其他反應(yīng)物混合物，隨后放入PTP板中進(jìn)行后繼的測(cè)序。 PTP孔的直徑（29um）只能容納一個(gè)珠子（20um）。然后將PTP板放置在GS FLX中，測(cè)序開始。每一個(gè)與模板鏈互補(bǔ)的核苷酸的添加都會(huì)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的信號(hào)，并被CCD照相機(jī)所捕獲；,7,測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：,4、數(shù)據(jù)分析：GS FLX系統(tǒng)在10小時(shí)的運(yùn)行當(dāng)中可獲得10

5、0多萬個(gè)讀長(zhǎng)，讀取超過4-6億個(gè)堿基信息，通過GS FLX系統(tǒng)提供兩種不同的生物信息學(xué)工具對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。,8,454 Pyrosequencing,9,10,454 的特點(diǎn)與主要應(yīng)用,讀長(zhǎng)較長(zhǎng)，400600bp 通量較低，1Run 1M 序列，400600Mb 相對(duì)成本較高 主要應(yīng)用：de novo測(cè)序,11,Illumina solexa,Solexa 測(cè)序原理,12,Illumina solexa,13,Illumina Solexa 橋式PCR,diol,diol,1st cycle denaturation,14,Illumina Solexa Base Calling,T T

6、T T T T T G T ,T G C T A C G A T ,15,Solexa 的特點(diǎn)與主要應(yīng)用,讀長(zhǎng)較短，100150bp 通量高，25G每天，120-150G每Run 主要應(yīng)用：RNA測(cè)序、表觀遺傳學(xué)研究,16,ABISOLiD,SOLiDSequencing by Oligo Ligation/Detection Oligo連接測(cè)序：通過連接酶連接，再對(duì)oligo上熒光基團(tuán)進(jìn)行檢測(cè),SOLiD 5500 xl,17,ABI SOLiD測(cè)序前期制備,A 樣品片段化 磁珠連接,B 乳化PCR 3末端修飾,C 磁珠富集 轉(zhuǎn)到測(cè)序玻片,18,ABI SOLiD測(cè)序原理,19,ABI SO

7、LiD熒光結(jié)合和結(jié)果示例,SRR029969.1 VAB_5551_12_381_F3 length=35 T11.0203.3.1113211010332111302330201 +SRR029969.1 VAB_5551_12_381_F3 length=35 !36!8/8:!:!4626=(8.)43),(95,A. SOLiD Oligo熒光基團(tuán)模式圖,B. SOLiD 測(cè)序結(jié)果示例（Color Space),20,21,SOLiD 的特點(diǎn)與主要應(yīng)用,讀長(zhǎng)較短，50-75bp 精度高，可達(dá)Q40 通量高， 20-30G每天，1Run 可達(dá)120G 主要應(yīng)用：基因組重測(cè)序、SNP檢測(cè)等

8、,22,Ion torrent,Ion Torrent 測(cè)序原理,23,精度,Examples: 90%condence(10%errorrate)=Q10 99%condence(1%errorrate)=Q20 99.9%condence(.1%errorrate)=Q30,24,三種平臺(tái)的技術(shù)差異,25,三種平臺(tái)的效能參數(shù)差異,26,轉(zhuǎn)錄組測(cè)序測(cè)序流程,27,轉(zhuǎn)錄組主要分析內(nèi)容,28,小RNA測(cè)序,29,果蠅三種組織中MiRNA表達(dá)情況,30,MiRNA表達(dá)模式分析,31,新miRNA預(yù)測(cè),32,miRNA編輯情況分析與統(tǒng)計(jì),33,分析軟件介紹,質(zhì)量控制軟件 (Quality Contr

9、ol) 定位軟件 (Mapping the reads) 已知基因（差異）表達(dá)評(píng)估軟件 (Differential Expression) 新基因鑒定軟件 (New gene identification) 可視化展示軟件 (Virsulization) 基因功能注釋軟件 (GO term or KEGG pathway analysis),34,數(shù)據(jù)格式示例,Fastq 格式,Color Space 格式,35,Phred score,36,質(zhì)量控制,37,利用galaxy進(jìn)行原始數(shù)據(jù)處理,/,38,Galaxy History VGN FASTQ,https:/main.g2.bx.psu