3.微生物代謝調(diào)節(jié)的基本類型及應(yīng)用.ppt

1、,微生物調(diào)節(jié)模式及其應(yīng)用,2020/9/5,2,圖1 微生物細(xì)胞氨基酸、核苷酸的調(diào)節(jié)機(jī)制,2020/9/5,3,圖2 酶的生物合成和活性的控制,2020/9/5,4,(1)通過控制基因的酶生物合成的控制機(jī)制 誘導(dǎo)促進(jìn)酶的合成。 阻遏抑制酶的合成，包括： 1)終產(chǎn)物阻遏。 2)分解代謝物阻遏。 (2)酶活性的控制機(jī)制 終產(chǎn)物抑制或激活。 通過輔酶水平的活性調(diào)節(jié)。 酶原的活化。 潛在酶的活化。 (3)通過細(xì)胞滲透性的控制,2020/9/5,5,微生物體內(nèi)代謝過程的各種生物化學(xué)反應(yīng)，都是由各種酶來催化的。按各種酶在代謝調(diào)節(jié)中作用的不同，又可將酶分為： 調(diào)節(jié)酶(常稱關(guān)鍵酶，與代謝調(diào)節(jié)關(guān)系密切)：包括以

2、下3種： 1)變構(gòu)酶：一般是具有多亞基四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。 2)同功酶：具有同一種酶的底物專一性，但分子結(jié)構(gòu)不同的一類酶。 3)多功能酶：能夠催化兩種以上不同反應(yīng)的酶。 靜態(tài)酶：一般與代謝調(diào)節(jié)關(guān)系不大。 潛在酶：指酶原、非活性型或與抑制劑結(jié)合的酶。,2020/9/5,6,圖3 氨基酸生物合成途徑中的關(guān)鍵酶 M多價阻遏 -KB-酮丁酸 DAHP2-酮-3-脫氧-D-阿拉伯糖型庚糖酸-7-磷酸 -AL-乙酰乳酸,2020/9/5,7,一、代謝的調(diào)節(jié)模式,1. 影響酶活性的調(diào)節(jié)模式（反饋抑制或激活）（共 11種）2. 影響酶合成（酶分子數(shù)）的調(diào)節(jié)模式（反饋阻遏）（共 10 種）,2020/9/5,8,

3、圖 例,1. 化學(xué)反應(yīng)的標(biāo)示：雙線箭頭。 2. 調(diào)節(jié)機(jī)制的標(biāo)示：帶箭頭的單線。 酶活力的調(diào)節(jié)：實線標(biāo)示。 帶空心箭頭的實線標(biāo)示激活， 帶實心箭頭的實線標(biāo)示抑制。 酶水平的調(diào)節(jié)：虛線標(biāo)示。 帶空心箭頭的虛線標(biāo)示誘導(dǎo)， 帶實心箭頭的虛線標(biāo)示阻遏。,2020/9/5,9,1. 影響酶活性的調(diào)節(jié)模式(共 11 種),只有一個終端產(chǎn)物的（沒有分支的）途徑的調(diào)節(jié)模式（共 3 種） 多個終端產(chǎn)物的（有分支的）途徑的調(diào)節(jié)模式（共 6 種） 代謝途徑的橫向調(diào)節(jié)（共 2 種）,2020/9/5,10,只有一個終端產(chǎn)物的（沒有分支的）途徑的調(diào)節(jié)模式（第 1 種）,2020/9/5,11,只有一個終端產(chǎn)物的（沒有分支

4、的）途徑的調(diào)節(jié)模式（第 2 種）,2020/9/5,12,只有一個終端產(chǎn)物的（沒有分支的）途徑的調(diào)節(jié)模式（第 3 種）,UMP-5-尿苷酸；UDP-二磷酸尿苷；UTP三磷酸尿苷,2020/9/5,13,多個終端產(chǎn)物的（有分支的）途徑的調(diào)節(jié)模式（第 1 種）,2020/9/5,14,多個終端產(chǎn)物的（有分支的）途徑的調(diào)節(jié)模式（第 2 種）,2020/9/5,15,多個終端產(chǎn)物的（有分支的）途徑的調(diào)節(jié)模式（第 3 種）,2020/9/5,16,多個終端產(chǎn)物的（有分支的）途徑的調(diào)節(jié)模式（第 3 種, 實例）,2020/9/5,17,多個終端產(chǎn)物的（有分支的）途徑的調(diào)節(jié)模式（第 4 種）,Orn-鳥氨酸

5、；Cit-瓜氨酸；UMP-尿苷酸,2020/9/5,18,多個終端產(chǎn)物的（有分支的）途徑的調(diào)節(jié)模式（第 5 種）,2020/9/5,19,多個終端產(chǎn)物的（有分支的）途徑的調(diào)節(jié)模式（第 6 種）,2020/9/5,20,代謝途徑的橫向調(diào)節(jié)（共 2 種，第 1 種）,2020/9/5,21,代謝途徑的橫向調(diào)節(jié)（共 2 種，第 2 種）,2020/9/5,22,單個終產(chǎn)物的生物合成途徑的調(diào)節(jié)模式（共 2 種） 多個終產(chǎn)物的生物合成途徑的調(diào)節(jié)模式（共 3 種） 分解代謝途徑的調(diào)節(jié)模式（5 種）,影響酶合成（酶分子數(shù)）的調(diào)節(jié)模式 （共 10 種）,2020/9/5,23,單個終產(chǎn)物的生物合成途徑的調(diào)節(jié)模

6、式（共 2 種，第 1 種）,2020/9/5,24,單個終產(chǎn)物的生物合成途徑的調(diào)節(jié)模式（共 2 種，第 2 種）,2020/9/5,25,多個終產(chǎn)物的生物合成途徑的調(diào)節(jié)模式（共 3 種，第 1 種）,2020/9/5,26,多個終產(chǎn)物的生物合成途徑（共 3 種，第 2 種）,2020/9/5,27,多個終產(chǎn)物的生物合成途徑（共 3 種，第 3 種）,2020/9/5,28,分解代謝途徑的調(diào)節(jié)模式（共 5 種，第 1 種）,2020/9/5,29,分解代謝途徑的調(diào)節(jié)模式（共 5 種，第 2 種）,2020/9/5,30,分解代謝途徑的調(diào)節(jié)模式（共 5 種，第 3 種）,2020/9/5,31,

7、分解代謝途徑的調(diào)節(jié)模式（共 5 種，第 4 種）,2020/9/5,32,分解代謝途徑的調(diào)節(jié)模式（共 5 種，第 5 種）,2020/9/5,33,二、酶合成及酶活性的調(diào)節(jié)機(jī)制,微生物的代謝調(diào)節(jié)具有多系統(tǒng)、多層次的特點，通過調(diào)節(jié)酶合成的量來控制微生物代謝速度是其中的一個方式。酶合成的調(diào)節(jié)主要有兩種，即酶的阻遏和酶的誘導(dǎo)。,2020/9/5,34,1 末端代謝產(chǎn)物阻遏（End-product repression）,這是酶合成阻遏中的一種。它是指由于末端產(chǎn)物的過量積累而引起代謝途徑中酶合成的阻遏，是一種反饋阻遏，末端代謝產(chǎn)物阻遏的特點是同時阻遏合成途徑中所有酶的合成。 對于分支代謝途徑的末端代謝

8、產(chǎn)物阻遏，每種末端產(chǎn)物只專一地阻遏合成它自身那條分支途徑的酶，而分支點的酶則受所有分支途徑末端產(chǎn)物的共同阻遏。這種幾個終產(chǎn)物，共同協(xié)調(diào)阻遏某一個酶的生物合成稱為多價阻遏（multivalent repression）。,2020/9/5,35,對于直線式代謝途徑，末端產(chǎn)物阻遏情況較為簡單。末端產(chǎn)物將引起代謝途徑中各種酶的合成終止。 末端代謝產(chǎn)物阻遏的機(jī)制可以用操縱子學(xué)說解釋。如大腸桿菌色氨酸操縱子模型。,2020/9/5,36,2 酶合成的分解代謝物阻遏（Catabolite repression）,所謂分解代謝阻遏，是當(dāng)細(xì)胞中具有一優(yōu)先利用的底物時，很多其他分解反應(yīng)途徑受到阻遏的現(xiàn)象。由于這

9、種阻遏并不是優(yōu)先利用底物及作用的結(jié)果，而是有底物分解過程中產(chǎn)生的中間代謝物引起的，所以稱為分解代謝物阻遏。這種阻遏效應(yīng)最早在1942年由Monod在研究大腸桿菌混合碳源生長時發(fā)現(xiàn)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在微生物的生長體系中，外加CAMP（環(huán)腺苷酸）可解除分解代謝物阻遏，這表明分解代謝物阻遏的實質(zhì)是由于細(xì)胞內(nèi)缺少CAMP。分解代謝物阻遏作用是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上的，因而屬于轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)。Monod提出的乳糖操縱子模型可以較好地解釋分解代謝物的阻遏機(jī)制。,2020/9/5,37,3 酶的誘導(dǎo)與酶的合成,當(dāng)環(huán)境中存在誘導(dǎo)劑時才產(chǎn)生的酶稱為誘導(dǎo)酶。而這種環(huán)境物質(zhì)促使微生物細(xì)胞中酶合成的現(xiàn)象稱為酶的誘導(dǎo)。 操縱子學(xué)

10、說可以較好的說明酶的誘導(dǎo)產(chǎn)生的機(jī)制，操縱子指一組功能上相關(guān)的基因，它們由啟動基因、操縱基因和結(jié)構(gòu)基因構(gòu)成。啟動基因是一種能被依賴于DNA的RNA聚合酶所識別的堿基序列，它既是RNA聚合酶的結(jié)合位置，又是轉(zhuǎn)錄的起始位置。操縱基因是位于起動基因與結(jié)構(gòu)基因之間的堿基序列，它能與阻遏物（Repressor）相結(jié)合，從而決定結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄能否進(jìn)行。結(jié)構(gòu)基因是確定酶蛋白氨基酸序列的模版DNA，可根據(jù)它的堿基序列轉(zhuǎn)錄成mRNA，然后再通過翻譯合成相應(yīng)的酶。,2020/9/5,38,在操縱子附近還有調(diào)節(jié)基因，它是編碼調(diào)節(jié)蛋白的基因，調(diào)節(jié)蛋白是一類變構(gòu)蛋白，它有兩個特殊的位置，一個位置能與操縱基因結(jié)合，另一個能

11、與效應(yīng)物（誘導(dǎo)物）結(jié)合。在沒有誘導(dǎo)物存在時，調(diào)節(jié)蛋白（阻遏物）與操縱基因相結(jié)合，使得RNA聚合酶無法從起始點滑向結(jié)構(gòu)基因，轉(zhuǎn)錄無法進(jìn)行，結(jié)構(gòu)基因處于休眠狀態(tài)。而當(dāng)誘導(dǎo)物出現(xiàn)時，阻遏物與誘導(dǎo)物結(jié)合，使得結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯過程能夠順利進(jìn)行，也即誘導(dǎo)酶產(chǎn)生。酶的誘導(dǎo)可有兩種情況，其一是加入一種誘導(dǎo)劑后，微生物能同時或幾乎同時合成幾種酶，另一種是一種酶的底物誘導(dǎo)第一種酶的合成，而第一種酶的產(chǎn)物又可誘導(dǎo)第二種酶的合成，依此類推合成一系列的酶。因而，前者可稱為同時誘導(dǎo)，后者可稱為順序誘導(dǎo)。,2020/9/5,39,4 酶活性的調(diào)節(jié)機(jī)制,改變酶分子的活性來調(diào)節(jié)微生物代謝速度的辦法稱為酶活性的調(diào)節(jié)。一般的方

12、法是用一特異的小分子代謝物與酶的可逆性結(jié)合。與酶合成調(diào)節(jié)方式相比，這種調(diào)節(jié)方式更直接，并且見效快，是一種發(fā)生在蛋白質(zhì)水平上的調(diào)節(jié)。 這些酶的活性受到底物或產(chǎn)物或其結(jié)構(gòu)類似物的影響，其活性發(fā)生改變的酶稱為調(diào)節(jié)酶（Regulatory enzyme）。調(diào)節(jié)酶也稱關(guān)鍵酶，包括變構(gòu)酶、同功酶和多功能酶，通常為變構(gòu)酶，一般具有多個亞基，包括催化亞基和調(diào)節(jié)亞基。,2020/9/5,40,在微生物代謝調(diào)節(jié)中比較常見的是反饋調(diào)節(jié)，尤其是末端產(chǎn)物對酶活性的反饋抑制，抑制劑與調(diào)節(jié)亞基結(jié)合引起變構(gòu)酶的酶構(gòu)象發(fā)生變化，使催化亞基的活性中心不再能與底物結(jié)合，酶的催化性能隨之消失。調(diào)節(jié)酶的抑制劑通常是代謝終產(chǎn)物或其結(jié)構(gòu)類

13、似物，起抑制酶活性的作用。 變構(gòu)酶經(jīng)特定處理后，不喪失酶活性而失去對變構(gòu)效應(yīng)物的敏感性，稱為脫敏作用。為變構(gòu)酶編碼的結(jié)構(gòu)基因的突變可引起脫敏作用，如誘變育得的抗結(jié)構(gòu)類似物突變株中多發(fā)生這種變化。在氨基酸和核苷酸發(fā)酵育種上，現(xiàn)已作為突破微生物代謝控制的一個重要手段來利用。此外，利用加熱、加尿素或汞鹽等物理或化學(xué)因素處理變構(gòu)酶后，也可以產(chǎn)生脫敏作用。,2020/9/5,41,三、代謝調(diào)節(jié)的應(yīng)用,微生物在正常生理條件下，其代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)進(jìn)行著的生長和繁殖是最經(jīng)濟(jì)的，不多消耗原料及能量，也不會積累中間代謝產(chǎn)物。人工打破微生物的這種固有代謝模式，就可以增加或減少某種人們所希望的產(chǎn)物。工業(yè)發(fā)酵的目的就是大量

14、的積累人們所需要的微生物代謝產(chǎn)物，這也是代謝工程在發(fā)酵工業(yè)中應(yīng)用的目的。,2020/9/5,42,1 營養(yǎng)缺陷型突變株的應(yīng)用,對于營養(yǎng)缺陷型菌株，由于代謝途徑中某一步驟發(fā)生缺陷，在直線式的代謝途徑中，則只能累積中間代謝物而不能累積末端代謝產(chǎn)物，但末端代謝產(chǎn)物對菌體的生長仍是必需的，在分支代謝途徑中，就可以累積另一分支途徑的末端代謝產(chǎn)物。,2020/9/5,43,圖1 所示是某菌的D缺陷型菌株。末端產(chǎn)物E對代謝途徑中的第一個酶有反饋抑制，由于菌株失去了將C轉(zhuǎn)化為D的能力，使得末端產(chǎn)物E得不到積累，考慮到末端產(chǎn)物對于維持菌體生長之必需，因此，只要在培養(yǎng)基中適量添加E，就可以在菌體正常生長的同時，大

15、量積累C產(chǎn)物，即目的產(chǎn)物。,圖 1 利用營養(yǎng)缺陷型菌株（直線式代謝途徑）生產(chǎn)目的產(chǎn)物“.” 表示營養(yǎng)缺陷突變位置；“” 表示解除反饋調(diào)節(jié),2020/9/5,44,圖2 利用營養(yǎng)缺陷型菌株（分支代謝途徑）生產(chǎn)目的產(chǎn)物 “.” 表示營養(yǎng)缺陷突變位置；“” 表示解除反饋調(diào)節(jié) 圖2是分支代謝途徑營養(yǎng)缺陷菌株生產(chǎn)目的產(chǎn)物的一種情況。分支途徑因E和G對途徑第一個酶有協(xié)同反饋控制，而突變株失去了將C轉(zhuǎn)變成D的能力，產(chǎn)物E無法正常生成，從而解除了E和G的協(xié)同反饋控制。若在培養(yǎng)基中限量補(bǔ)充E，由于末端產(chǎn)物G對C到F反應(yīng)的控制，就會造成中間產(chǎn)物C的積累。,2020/9/5,45,在賴氨酸發(fā)酵生產(chǎn)中，為了解除正常的

16、代謝調(diào)節(jié)的獲得賴氨酸的高產(chǎn)菌株，人們選育了谷氨酸棒桿菌的高絲氨酸缺陷型菌株作為賴氨酸的發(fā)酵菌種。該菌種由于不能合成高絲氨酸脫氫酶（HSDH）,故不能合成高絲氨酸，也不能合成蘇氨酸和蛋氨酸，在補(bǔ)充適量高絲氨酸（或蘇氨酸和蛋氨酸）條件下，該菌株就能大量產(chǎn)生賴氨酸（見圖3）。,2020/9/5,46,采用青霉菌（Penicillum chrysogonum）生產(chǎn)青霉素時，次級代謝產(chǎn)物青霉素與初級代謝產(chǎn)物賴氨酸是同一分支代謝途徑的兩個產(chǎn)物（見圖4）。它們的共同前體是-氨基己二酸，賴氨酸對合成-氨基己二酸的酶有反饋阻遏或抑制，當(dāng)賴氨酸達(dá)到一定濃度后，抑制-氨基己二酸的合成，也抑制了青霉素的合成。選育賴氨

17、酸營養(yǎng)缺陷型，就可解除賴氨酸反饋調(diào)節(jié)，使青霉素大量地合成。,2020/9/5,47,2 抗反饋控制突變株的應(yīng)用,抗反饋調(diào)節(jié)突變株也稱為代謝拮抗物抗性突變株，是指對反饋抑制不敏感或?qū)ψ瓒粲锌剐缘木?。由于反饋調(diào)節(jié)已解除，所以能大量積累末端代謝產(chǎn)物。 抗反饋抑制突變株可以從結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株和營養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變株中獲得。谷氨酸產(chǎn)生菌如果誘變獲得抗蘇氨酸（-氨基-羥基丁酸）和異亮氨酸的結(jié)構(gòu)類似物AHV（-氨基-羥基戊酸）突變株，進(jìn)行發(fā)酵，就能分泌較多的蘇氨酸或異亮氨酸，這是因為該菌的關(guān)鍵酶（或稱調(diào)節(jié)酶/變構(gòu)酶）的結(jié)構(gòu)基因發(fā)生了突變，不再受蘇氨酸或異亮氨酸的反饋調(diào)節(jié)，使得蘇氨酸或異亮氨酸大量積累。,

18、2020/9/5,48,采用由營養(yǎng)缺陷型選育回復(fù)突變株的方法，也可以用來選育高產(chǎn)菌。當(dāng)一個菌株由于突變而失去某一性狀后，經(jīng)過回復(fù)突變可以再回復(fù)其原有的遺傳性狀。此時，該酶的活性中心結(jié)構(gòu)可以復(fù)原，而調(diào)節(jié)部位的結(jié)構(gòu)常常并沒有恢復(fù)，也即獲得了解除反饋抑制的菌株，從而提高發(fā)酵產(chǎn)量。例如，先將金霉素產(chǎn)生菌產(chǎn)綠鏈霉菌誘變成蛋氨酸缺陷型，然后再回復(fù)突變成原養(yǎng)型，結(jié)果其中有85%的回復(fù)突變株的金霉素產(chǎn)量提高了1.2-1.3倍。,2020/9/5,49,3 組成型突變株和超產(chǎn)突變株的應(yīng)用,所謂組成型突變是指某微生物細(xì)胞內(nèi)某種調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變，產(chǎn)生無效的阻遏物而不能與操縱基因結(jié)合，或操縱基因突變而使結(jié)構(gòu)基因不受控

19、制的轉(zhuǎn)錄，酶的生成將不再需要誘導(dǎo)劑或不再被末端產(chǎn)物或分解代謝物阻遏。在少數(shù)情況下，組成型突變株可產(chǎn)生大量的、比親株高得多的酶，這就叫超產(chǎn)突變。,2020/9/5,50,選育組成型突變菌株的辦法可以低濃度的底物誘導(dǎo)劑在恒化培養(yǎng)器中連續(xù)培養(yǎng)細(xì)菌。此外，如果某種化合物是誘導(dǎo)酶的良好底物，但不是好的誘導(dǎo)劑，那么，以這種物質(zhì)做碳源，就可選出組成型突變株，例如，利用乙酰-半糖苷可選出-半糖苷酶的組成型突變株。 在添加或不添加誘導(dǎo)酶的培養(yǎng)中交替培養(yǎng)，也可以從群體中篩選出抗反饋調(diào)節(jié)的菌株。,2020/9/5,51,4 控制細(xì)胞膜的通透性的應(yīng)用,微生物細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物常以較高濃度積累在細(xì)胞內(nèi)，改變細(xì)胞膜滲透性，把屬反饋控制因子的終產(chǎn)物迅速不斷地排出到細(xì)胞外，消除反饋控制，就可提高發(fā)酵產(chǎn)量。,2020/9/5,52,控制生物素的含量可以改變細(xì)胞膜的通透性。在谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)中，只有把生物素的濃度控制在亞適量情況下，細(xì)胞才能大量分泌谷氨酸，若過量供給生物素，菌體內(nèi)雖有大量谷氨酸積累，但不能分泌到細(xì)胞外。生物素（biotin）又名維生素H，溶于水和乙醇，是