蛋白質(zhì)芯片技術(shù)

1、.,蛋白質(zhì)芯片技術(shù),.,目 錄,一 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)產(chǎn)生的背景 二 蛋白質(zhì)芯片的概念 三 蛋白質(zhì)芯片的主要特點 四 蛋白質(zhì)芯片的分類 五 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的簡要操作步驟 六 蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用,.,一 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)產(chǎn)生的背景,隨著人類和其他生物的全基因組序列的完成，人們開始認(rèn)識到基因僅僅是生物體遺傳信息的載體，而生命活動的執(zhí)行者、表觀性狀的體現(xiàn)者則由基因編碼的產(chǎn)物蛋白質(zhì)所行使?；蛑皇且环N編碼，由它指導(dǎo)細(xì)胞合成蛋白質(zhì)，而幾乎所有的生物化學(xué)反應(yīng)均發(fā) 生在復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子之間或有蛋白質(zhì)參與，所有的外在表現(xiàn)均由種類繁多的蛋白質(zhì)所決定。,.,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，生物芯片技術(shù)研究工作不斷深入，DNA芯

2、片技術(shù)被逐漸用于對生物樣品中核酸序列表達的檢測和比較研究。 隨著DNA芯片技術(shù)的不斷成熟，以及基因研究所取得的令人矚目的成果，進一步推動蛋白質(zhì)功能的研究及相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)芯片技術(shù)因此應(yīng)運而生。,.,二 蛋白質(zhì)芯片的概念,蛋白質(zhì)芯片是將各種微量純化的蛋白質(zhì)陣列在一種高密度的固相載體上，并與待測樣品雜交，以測定相應(yīng)蛋白質(zhì)的性質(zhì)、特征以及蛋白質(zhì)與生物大分子之間的相互作用的方法。,.,三 蛋白質(zhì)芯片的主要特點,1.高通量 2.靈敏度較高 3.重復(fù)性好 4.操作自動化,.,四 蛋白質(zhì)芯片的分類,按蛋白質(zhì)性質(zhì)分類 1.無活性芯片：將已經(jīng)合成好的蛋白質(zhì)以高密度陣列點樣在芯片上，進行雜交反應(yīng)。 2.有活

3、性芯片：把生物體直接點在芯片上，并原位表達蛋白質(zhì)。 按形式分類 1.玻璃載玻片芯片（在玻璃表面構(gòu)建） 2.3-D膠芯片（在多孔凝膠墊上構(gòu)建） 3.微孔芯片（在微孔板上構(gòu)建）,.,不同種類的蛋白質(zhì)芯片的特點,.,五 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的簡介,操作步驟,提出生物學(xué)問題 （實驗?zāi)康模?樣品預(yù)處理 （重組蛋白，制備一、二級抗體， 熒光標(biāo)記，配蛋白印記緩沖液）,生化反應(yīng) 化學(xué)偶合，加底物， 反應(yīng)溫度和時間， 沖洗條件,檢測 （熒光和比色掃描或拍照， 參數(shù)設(shè)置）,數(shù)據(jù)分析和建模 （圖象量化，標(biāo)準(zhǔn)化， 采集蛋白信息，建立模型）,3,蛋白質(zhì)芯片制備,6,1,.,（一）蛋白質(zhì)芯片的制備,一 固相載體及其處理載體（滴

4、定板、濾膜、凝膠、載玻片）二 蛋白質(zhì)的預(yù)處理 選擇具有較高純度和完好生物活性的蛋白進行溶解三 點制微陣列可使用點制基因微陣列的商品化點樣儀或噴墨法等四 固定微陣列上的蛋白樣點膜為載體：芯片放入濕盒,37C 1h載玻片為載體：化學(xué)修飾產(chǎn)生醛基固定蛋白 五 微陣列的封閉主要封閉試劑：BSA,.,（二）抗原抗體的固化,1 化學(xué)性固定 化學(xué)性配基包括疏水基團、陰離子、陽離子、金屬離子、混合離子等 2 生物性固定 生物性配基包括受體、配體、酶、抗體-抗原等,.,（三）捕獲分子,1 抗體 由于具有高度的特異性和親和性，單克隆抗體是比較好的一種探針蛋白質(zhì)。用其構(gòu)筑的芯片可用于檢測蛋白質(zhì)的表達豐度及確定新的蛋

5、白質(zhì)。 2 寡聚核苷酸 適配體,即寡聚核苷酸 能夠作為捕獲分子用于連接蛋白質(zhì)，并且有很高的特異性和親和力。 3 肽樣寡聚體 鑒于多肽具有小分子和蛋白質(zhì)的雙重優(yōu)勢，在蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)中，多肽是另一種具有發(fā)展前景的捕獲分子。,.,4 小分子配體 制備捕獲分子最為有效的方式 小分子配體的鑒定主要通過組合文庫的方法進行 5 重組蛋白 純化或重組蛋白是另一種類型的捕獲分子，特別是應(yīng)用于在蛋白質(zhì)功能分析方面，如蛋白質(zhì)相互作用、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)-小分子間相互作用和自身抗體。重組蛋白可以以融合蛋白的形式，從體外表達的細(xì)菌系統(tǒng)中分離純化。,.,（四）微陣列設(shè)計與制備,1 人工制備芯片 主要有兩種,即手工點樣和免

6、疫打點印跡裝置。 存在著的明顯問題是不能夠建立高密度芯片、樣品和捕獲分子消耗大和敏感性較低 2 微陣列制備儀 主要有直接接觸式和非接觸式兩種類型,也是目前市場上常用的兩種方法,.,（五）抗原或抗體的標(biāo)記,1 酶標(biāo)記 常用的標(biāo)記酶有辣根過氧化物酶(HRP) 、堿性磷酸酶(AP)等. 2 熒光物標(biāo)記 熒光免疫分析中常用的熒光物質(zhì)有異硫氨酸熒光素、丹磺酰氯、羅丹明-異硫氰酯等。,.,（六）蛋白質(zhì)芯片檢測方法,1 以質(zhì)譜技術(shù)為基礎(chǔ)的直接檢測法 如表面增強激光解析離子化飛行時間質(zhì)譜技術(shù) (SELDI-TOF-MS),可以使吸附在芯片表面的靶蛋白離子化,在電場力的作用下飛行,通過檢測離子的飛行時間計算出質(zhì)

7、量電荷比,用以分析蛋白質(zhì)的分子量和相對含量。 2 蛋白質(zhì)標(biāo)記法 常用的芯片信號檢測是將芯片置入芯片掃描儀中,通過采集各反應(yīng)點的熒光位置、熒光強弱,再經(jīng)相關(guān)軟件分析圖像,即可以獲得有關(guān)生物信息。,.,六 蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用,1 用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-核酸、蛋白質(zhì)-脂類等相互作用研究；特異性蛋白質(zhì)的篩選；功能蛋白質(zhì)組研究。 例如，應(yīng)用酵母蛋白質(zhì)芯片進行鈣調(diào)蛋白的研究；應(yīng)用磷脂酰肌醇來篩選磷脂酰肌醇的結(jié)合蛋白。,.,2 疾病診斷的研究。目前，臨床上應(yīng)用的蛋白質(zhì)芯片主要是用于檢測腫瘤標(biāo)志物的蛋白質(zhì)芯片。它的應(yīng)用范圍主要在以下幾個方面： （1）用于腫瘤患者的輔助診斷、療效判斷、病情監(jiān)測、預(yù)后評估及判斷腫瘤有無復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等。 （2）用于腫瘤高危人群的定期篩查。高危人群主要是指45歲以上的人群、患各種慢性炎癥和各種慢性疾病的患者、有腫瘤家族史和腫瘤高發(fā)區(qū)居民等。 （3）用于