《發(fā)育生物學(xué)第五周》PPT課件.ppt

1、胚胎發(fā)育與程序性細胞死亡,湘雅醫(yī)學(xué)院組胚教研室 張彬,第 八 章,一、程序性細胞死亡PCD（programmed cell death）,又稱細胞凋亡 (apoptosis) （在體內(nèi)外因素誘導(dǎo)下，由基因嚴格調(diào)控而發(fā)生的自主性細胞有序死亡。）,1、概念 一個固有的遺傳程序即生物鐘，在一個受控制的時間和空間內(nèi)激活，從而導(dǎo)致細胞死亡。,細胞凋亡與程序性細胞死亡,意義大致相同，二者可交互使用。 比較說來程序性細胞死亡側(cè)重于發(fā)育學(xué)功能上描述；強調(diào)死亡發(fā)生的時間；適用于胚胎細胞。 細胞凋亡偏重于病理形態(tài)描述；強調(diào)細胞死亡的方式；適用于所有細胞。,蝌蚪尾的消失 脊椎動物的神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育 發(fā)育過程中手和足的

2、成形過程,2、簡史,1885年，F(xiàn)lemming第一個描述有關(guān)細胞凋亡的 特征；（染色質(zhì)濃縮形成半月形） 1914年，Graper用這種死亡現(xiàn)象解釋胚胎發(fā)育 中器官收縮等現(xiàn)象 1951年，Glucksmann發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育中存在這 種死亡，并詳細描述； 60年代，Lockshin和Williams首次提出程序性細胞死亡這一概念,1986年， RobertHorvitz等發(fā)現(xiàn)線蟲中ced3 （caspase），ced4 （Apaf-1） 是促凋亡基因。,1980年，Wyllie等發(fā)現(xiàn)細胞凋亡與內(nèi)源性核酸 內(nèi)切酶激活有關(guān)。 “DNA ladder”是細胞凋亡發(fā)生的標(biāo)志；,1965年，John Ke

3、rr提出“固縮性壞死”概念； 1972年，Kerr，Wyllie，Currie提出“細胞凋 亡” （apoptosis）的概念；,Sydney Brenner H. Robert Horvitz John Sulston,THE 2002 NOBEL PRIZE WINNER,王曉東：最年輕美國科學(xué)院院士,從事的是細胞凋亡機制的研究。 1996年，發(fā)現(xiàn)線粒體釋放細胞色素C, 引起細胞凋亡; 2000年，發(fā)現(xiàn)線粒體釋放Smac，可促細胞凋亡.,Smac: Second mitochondria-derived activator of caspase,二、 PCD/細胞凋亡的形態(tài)變化,(1)細胞

4、皺縮變圓，微絨毛、復(fù)合體消失； 出芽(budding),膜空泡化（blebbing),出芽(budding),(2)胞質(zhì)濃縮、細胞器結(jié)構(gòu)保留,(3)核濃縮；染色質(zhì)凝聚,（4）形成凋亡小體,(4) 凋亡小體形成 胞膜皺縮內(nèi)陷，分割包裹胞質(zhì)(內(nèi)含DNA物質(zhì)及細胞器)，形成的膜包顆粒即凋亡小體（apoptosis body）,(5) 吞噬,巨噬細胞吞噬凋亡小體,巨噬細胞,凋亡小體,三、PCD/細胞凋亡的生理和生化變化,磷脂酰絲氨酸外翻：annexin V 基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成： 與細胞骨架降解有關(guān)的酶 谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、組織蛋白酶D、 組織型纖維蛋白酶原激活劑等 與細胞和凋亡小體形態(tài)維持有關(guān)的蛋白質(zhì)

5、簇因子、r-谷丙轉(zhuǎn)氨酶等 Ca2+、Mg2+依賴性的核酸內(nèi)切酶活化： 降解DNA，形成180-200bp或其倍數(shù)的DNA片段,PCD/細胞凋亡與壞死的區(qū)別,細胞壞死(necrosis),指由于某些外界毒性刺激（如局部缺血、高熱、物理和化學(xué)損傷或生物的侵襲等），直接作用于細胞導(dǎo)致的細胞急速死亡，一般伴有炎癥反應(yīng)。,一般過程：因補體反應(yīng)或烈性病毒感染破壞了質(zhì)膜，或者能量依賴性離子泵被破壞產(chǎn)生的鈉鉀等離子沿著各自的濃度梯度進入細胞，從而導(dǎo)致細胞吸水膨脹，最終破膜而死。,細胞凋亡與細胞壞死是多細胞生物細胞死亡的兩種不同形式，在形態(tài)學(xué)、生化代謝、分子機制、結(jié)局和意義等方面都有本質(zhì)的區(qū)別。,細胞壞死特征：

6、溶酶體釋放酶，細胞器瓦解，細胞骨架降解，細胞核破裂、降解，蛋白質(zhì)合成終止，由于膜破裂，出現(xiàn)炎癥反應(yīng),圖82 細胞凋亡與細胞壞死的比較,表81 細胞凋亡與細胞壞死的比較,三、胚胎發(fā)育中的程序性細胞死亡（PCD） （一） PCD參與了各器官的形態(tài)發(fā)生和發(fā)育。 1、肢體的發(fā)生 2、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生、發(fā)育 3、腭的發(fā)生 4、管（腔）道的形成 5、晶狀體的發(fā)育 6、心的發(fā)育 7、生殖細胞的發(fā)生 8、免疫、造血系統(tǒng)的發(fā)生 9、無用結(jié)構(gòu)的退化消失（弓動脈、前腎、中腎、尾芽、鰓膜等）,實 驗,將17期的雞胚翅芽后緣的細胞移植到另一不同胚齡雞胚的體節(jié)中，發(fā)育至24期時仍發(fā)生死亡。 將17期的雞胚翅芽后緣以外的

7、細胞移植到另一不同胚齡雞胚的體節(jié)中，發(fā)育至24期時不發(fā)生死亡。 證明雞胚翅芽后緣細胞的死亡有著預(yù)定的時間和空間程序。,（二）胚胎發(fā)育中PCD的意義 1、系統(tǒng)匹配 淘汰沒有作用或不再起作用的細胞，以確保有 功能細胞的營養(yǎng)和空間。 2、除去短暫結(jié)構(gòu)：人胚尾芽 3、雕刻軀體 從而形成正常、精細復(fù)雜的生物體。 4、保護機體：如胸腺的發(fā)育、損傷的胚胎細胞,四、PCD/細胞凋亡的調(diào)節(jié),（一）激素水平的調(diào)節(jié)： 甲狀腺素（蝌 蚪）、糖皮質(zhì)激素（胸腺cell）、苗勒抑制物質(zhì)（中腎旁管）等誘導(dǎo)PCD 雌激素及卵泡刺激素（顆粒細胞）、胰島素（晶狀體上皮細胞）等抑制PCD （二）細胞因子調(diào)節(jié) 主要是生長因子：NGF，

8、FGF，TGF， G-CSF等缺乏導(dǎo)致PCD,（三）PCD相關(guān)基因/蛋白的調(diào)節(jié) 1、TNF死亡受體超家族 （1）死亡受體：Fas、TNFR I等 （2）與死亡受體有關(guān)的含死亡結(jié)構(gòu) 域的信號蛋白：FADD（FAS相關(guān)死亡蛋白）、TRADD（TNFR I相關(guān)死亡蛋白）等,（1）死亡受體：Fas、TNFR I等 結(jié)構(gòu)特點： 胞內(nèi)C-端：胞內(nèi)功能區(qū)由80個氨基酸構(gòu)成的死亡結(jié)構(gòu)域 （death domain，DD） 跨膜區(qū) 胞外N-端：胞外功能區(qū)內(nèi)含數(shù)個半胱氨酸,（2）含有死亡結(jié)構(gòu)域的信號蛋白 TRADD （TNFR相關(guān)死亡蛋白）：34kD，C端 的DD與TNFR I， FADD的DD結(jié)合 FADD （

9、Fas相關(guān)死亡蛋白） （MORT-1）： 23kD，C-端含有一個DD(death domain )，可與Fas結(jié)合；N-端含有 MORT結(jié)構(gòu)域或死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（DED : death effector domain ），可與 proCaspase-8（FLICE）的DED結(jié)合,Fas(Apo-1,CD95): 43kD （三聚體FasL-Fas-FADD（Fas 相關(guān)死 亡蛋白）-proCaspase-8）( DISC/死亡 誘導(dǎo)信號復(fù)合物): 活化Bid、caspase-3 DED: death effector domain TNFR I（ TNFR55）：55-60kD， TNFR I

10、- -TRADD（TNFR相關(guān)死亡蛋白）- FADD- proCaspase-8,DD,DED,DD,DD,DED,Fas/FasL,DD: death domain,凋亡誘導(dǎo)因素,死亡受體（Fas)配體（FasL)的表達、結(jié)合,Caspase-8活化,Caspase-3活化,apoptosis,FADD,FADD,2. 凋亡蛋白酶,Caspase: cysteine-containing aspartate-specific protease （含半胱氨酸的天冬氨酸特異蛋白水解酶）,一組對底物的天冬氨酸部位有特異水解作用，其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶。,(1) 定義,（2）Caspase

11、的分類及功能 凋亡啟動亞類 (DED、CARD) 凋亡效應(yīng)亞類 細胞因子加工亞類（ICE亞類）,Caspases 激活的瀑布學(xué)說(級聯(lián)反應(yīng)),(3) 結(jié)構(gòu)特征,以無活性的 酶原形式存在；,N端均含有一 段前區(qū)域（內(nèi)含 DED、CARD)；,CARD: Caspase Activation and Recruitment Domain,在大亞基的C端含有一活性中心，其中半胱氨酸是必需氨基酸。,活性形式由2個大亞 基和2個小亞基組成 的雜四聚體；,(4) Caspase的作用底物, 凋亡蛋白酶激活的DNA酶抑制物(ICAD),CAD: Caspase Activated DNase 由Caspas

12、e激活的核酸酶(具有內(nèi)切酶活性),ICAD,CAD,DNA,Caspase, 核纖層（lamina）蛋白,細胞核,lamina,染色體, 細胞骨架蛋白：導(dǎo)致細胞解體， 形成凋亡小體 其他的caspases 滅活細胞凋亡的抑制物,3、凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1) 130kD，N-端含有一半胱氨酸蛋白酶募集域（CARD），C-端由12個WD-40重復(fù)片段組成。 凋亡體/死亡復(fù)合體： Cytc -Apaf-1-dATP （閉合的單體聚合成開放的七聚體） Cytc -Apaf-1-dATP-proCaspase-9,凋亡復(fù)合體,CARD: Caspase Activation and Rec

13、ruitment Domain,4、線粒體膜間隙蛋白（線粒體釋放的凋亡相關(guān)因子） 細胞色素C，凋亡誘導(dǎo)因子， Apaf-1 , Ca2+ , Smac/DIABLO等 5、自由基 活性氧自由基（超氧陰離子自由基、羥自由基及單線態(tài)氧，H2O2等）：誘導(dǎo)PCD的發(fā)生。 活性氮自由基：NO高濃度促PCD，低濃度抑制PCD,6、P53基因,阻滯細胞G1期，修復(fù)受損的DNA，如修復(fù)失敗則通過多種途徑誘導(dǎo)細胞凋亡。,（射線、毒素）,分子警察,P53的促凋亡機制：,（1） DNA結(jié)合蛋白，調(diào)控基因（BAX等)轉(zhuǎn)錄（細胞核途徑）,（2）激活線粒體途徑 （3）誘導(dǎo)Fas增加 （4）誘導(dǎo)溶酶體的不穩(wěn)定性,7、Bc

14、L-2家族,3個亞家族,抗凋亡蛋白亞家族（BcL-2亞家族）,含多區(qū)域的促凋亡蛋白亞家族（Bax亞家族）,僅含BH3區(qū)域的促凋亡蛋白亞家族（BH3亞家族）,基本結(jié)構(gòu)特征：跨膜結(jié)構(gòu)域 BcL-2同源結(jié)構(gòu)域（BH）,BcL-2基因家族成員自身或彼此之間有形成二聚體或多聚體的能力，BcL-2家族通過蛋白與蛋白相互作用調(diào)節(jié)著細胞的存活與凋亡。,Bcl-2 （B cell lymphoma/leukemia-2） ： Bcl-2 是第一個被確認有抗凋亡作用，由 229aa構(gòu)成（鼠236）分布在線粒體膜, 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，核膜等處。 Bcl-2 和C. elegans 中的ced-9 有很高的同源性，具有促進細胞

15、存活的功能。,BcL-2抗凋亡機制：,直接抗氧化； 調(diào)節(jié)PTP（線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔）開放； 抑制Bax，Bak的促凋亡作用； 抑制Caspases激活； 維持細胞鈣穩(wěn)態(tài)。,8、凋亡抑制蛋白家族（IAP家族）,IAP家族是一組抑制凋亡的蛋白。IAP家族蛋白的主要結(jié)構(gòu)域：BIR （baculoviral IAP repeat),鋅指結(jié)構(gòu)域、CARD。 BIR2是IAP 抑制凋亡的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。 作用機制：抑制caspase-3,7,9等的活性。,Figure 1 Schematic diagram of domain structure in representative IAPs,凋亡細胞DNA的斷

16、裂,形成高分子量的DNA大片斷（50kb),形成180200bp整數(shù)倍的DNA小片斷,非Caspase依賴的內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活,Caspase依賴的內(nèi)源性核酸酶激活(CAD),9. 核酸內(nèi)切酶,Caspase 8,Caspase 3,Caspase 9,Cleavage of substrates,Nucleus,Degradation of DNA,CAD激活方式,細胞膜,DNA斷裂與“梯狀條帶”,DNA“梯”狀條帶,（二）、PCD的主要途徑 1. 膜受體通路(死亡受體通路/外源性通路),腫瘤壞死因子死亡受體(TNFR)家族中的,死亡受體：FasCD95，TNFR,Fas/FasL,DD

17、: death domain,死亡受體通路,凋亡誘導(dǎo)因素,死亡受體（Fas)配體（FasL)的表達、結(jié)合,Caspase-8活化,Caspase-3活化,apoptosis,FADD,FADD,2. 線粒體通路（內(nèi)源性途徑） 線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）：由內(nèi)膜的腺苷轉(zhuǎn)位因子和外膜的電壓依賴性陰離子通道）構(gòu)成的蛋白復(fù)合體。,R,1、線粒體跨膜電位（m）的破壞與細 胞凋亡的一致性； m 下降時PTP開放導(dǎo)致細胞凋亡 m 正常時無細胞凋亡2、線粒體跨膜電位（m）的破壞早于核DNA的斷裂。,?,?,線粒體信號通路,smac,Smac: second mitochondria-derived act

18、ivator of caspase,IAPs,(-),Apoptosis inducing factor,Inhibitors of apoptosis protein,apoptotic protease activiation factor,凋亡誘導(dǎo)因素,死亡受體/配體的表達、結(jié)合,Caspase-8活化,Caspase-3活化,apoptosis,Bid活化,線粒體通路 活化,死亡受體通路與線粒體通路的聯(lián)系,Caspase-3活化,3、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)性途徑,損傷因素-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子穩(wěn)態(tài)改變、非正確蛋白質(zhì)堆積-caspase12活化-活化Bcl2促凋亡亞家族成員-線粒體通透性增加-caspase9活化-凋亡發(fā)生 活化caspase12與其他的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子協(xié)同，直接活化caspase9 -凋亡發(fā)生,4、MAPK、JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,MAPKKK（MEKK1、2、3、4） MAPKK（MEK1-7） MAPK（絲裂原活化蛋白激酶，包括ERK、JNK、P38MAPK、ERK5/BMK1) 轉(zhuǎn)錄因子（c-myc、c-fos、c-jun等）,JAK（兩面神激酶）-活化STAT（