基因工程試題

1、精品 料推薦二、名詞解釋（每題2 分，共 20 分）1、 southern blotting:southern 印跡： southern 發(fā)明的一種影印轉(zhuǎn)移物質(zhì)的方法。2、 cosmid vector: 黏粒載體：含有 cos 位點(diǎn)的質(zhì)粒載體。3、 cdna library:cdna文庫：是指某生物某一發(fā)育時期所轉(zhuǎn)錄形成的cdna 片段與某種載體連接而成的克隆的集合。4、 race: 是一種通過 pcr 進(jìn)行 cdna 末端快速克隆的技術(shù)，是以mrna 為模板反轉(zhuǎn)錄成cdna 第一鏈后用 pcr 技術(shù)擴(kuò)增出某個特異位點(diǎn)到3，或 5， 端之間未知序列的方法。5、 probe: 探針：指被標(biāo)記物質(zhì)

2、標(biāo)記了的核酸。6、 rt-pcr ：逆轉(zhuǎn)錄 pcr：先用逆轉(zhuǎn)錄酶作用于mrna ，以寡聚 dt 為引物合成cdna 第一鏈，然后用已知一對引物，擴(kuò)增嵌合分子，這種方法稱為逆轉(zhuǎn)錄pcr。7、insert inactivation:插入失活，基因工程載體上的某些選擇標(biāo)記基因常常含某種或某幾種限制性內(nèi)切酶的單一酶切位點(diǎn)，在該位點(diǎn)用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶處理，并將外源dna 片段插入該位點(diǎn)，則插入的外源dna 片段將破壞原有基因的讀碼框，往往導(dǎo)致原有的選擇標(biāo)記基因無法翻譯表達(dá)， 或即使翻譯表達(dá)， 形成的也是喪失了原有生物活性的蛋白質(zhì)，這一現(xiàn)象稱為插入失活。 。8、s-d sequence: s-d 序列：

3、在大腸桿菌mrna 的核糖體結(jié)合位點(diǎn)上，含有一個轉(zhuǎn)譯起始密碼子及同16s 核糖體 rna 3 ， 末端堿基互補(bǔ)的序列，該序列最初由shine 、dalgarno 發(fā)現(xiàn)，故后來命名為shine dalgarno 序列，簡稱s-d 序列。9、 shuttle plasmid vector:穿梭質(zhì)粒載體：指一類由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)的選擇標(biāo)記，因而可在兩種不同宿主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。10、 mcs: 指載體上人工合成的含有緊密排列的多種限制核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的dna片段。三、簡答題（每題5 分，共 25 分）1、理想質(zhì)粒載體的必備條件？答：具有較小的分子質(zhì)量和較高的拷貝數(shù)。具有若

4、干限制性核酸內(nèi)切酶的單一酶切位點(diǎn)。具有兩種以上的選擇標(biāo)記基因。缺失 mob 基因。插入外源基因的重組質(zhì)粒較易導(dǎo)入宿主細(xì)胞并自制和表達(dá)。2、核酸操作的基本技術(shù)有哪些？答：核酸提取與純化核酸的檢測與保存核酸的凝膠電泳核酸分子雜交3、影響核酸保存的關(guān)鍵因素是什么？怎樣保存核酸制品？答： 關(guān)鍵因素 ： 保存液的酸堿度 保存溫度保存方法： 一般保存可用濃鹽液，nacl- 檸檬酸緩沖液或0.1mol/l 醋酸緩沖液。 對 dna 來說，在 ph4 11 的范圍分子的堿基較穩(wěn)定，超出此范圍dna 易變性或降解，低溫、稀堿下保存dna及低溫下保存rna均較穩(wěn)定 。 固態(tài)核酸通常在0以上低溫干燥保存即可。4、合

5、成 cdna 第二鏈的主要策略有哪些？答：自身引導(dǎo)合成法置換合成法 pcr 合成法1精品 料推薦快速擴(kuò)增cdna 末端法雙鏈 cdna 末端的處理 cdna 與載體的連接5、基因工程誕生的理論基礎(chǔ)是什么？答：是現(xiàn)代分子生物學(xué)領(lǐng)域理論上的三大發(fā)現(xiàn)和技術(shù)上的三大發(fā)明。理論上的三大發(fā)現(xiàn)：證實(shí)了dna 是遺傳物質(zhì)揭示了dna 分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)理遺傳密碼的破譯和遺傳信息傳遞方式的確定技術(shù)上的三大發(fā)明：限制核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)與dna 切割 dna 連接酶的發(fā)現(xiàn)與 dna 片段的連接基因工程載體的研究與應(yīng)用四、問答題（每題10 分，共 40 分）1 pcr 技術(shù)主要應(yīng)用在哪些領(lǐng)域？答：核酸基

6、礎(chǔ)研究序列分析檢測基因表達(dá)從 cdna 文庫中放大特定序列研究已知片段鄰近基因或未知dna 片段進(jìn)化分析醫(yī)學(xué)應(yīng)用分析生物學(xué)證據(jù)性別控制轉(zhuǎn)基因檢測。2 細(xì)菌的限制與修飾系統(tǒng)有什么意義？大腸桿菌k12 限制與修飾系統(tǒng)的遺傳分析揭示的4種表型是什么？答： 宿主控制的限制與修飾現(xiàn)象廣泛存在于原核細(xì)菌中，它有兩方面的作用， 一是保護(hù)自身 dna不受限制； 二是破壞入侵外源dna使之降解。 細(xì)菌正是利用限制與修飾系統(tǒng)來區(qū)分自身 dna與外源 dna的。外源 dna可以通過多種方式進(jìn)入某一生物體內(nèi)，但是它必須被修飾成受體細(xì)胞的限制內(nèi)切酶無法辯認(rèn)的結(jié)構(gòu)形式，才能在寄主細(xì)胞內(nèi)得以生存， 否則會很快被破壞。因此，

7、 在基因工程中， 常采用缺少限制作用的菌株作為受體，以保證基因操作的順利完成。大腸桿菌 k12 限制與修飾系統(tǒng)的遺傳分析揭示，它有以下4 種表型：r k + m k +野生型r k - m k +限制缺陷型r k - m k -限制和修飾缺陷型r k + m k -修飾缺陷型3 試述 5 race技術(shù)原理和方法。答： pcr用于擴(kuò)增代表mrna轉(zhuǎn)錄物某一單位點(diǎn)與其3或 5末端之間區(qū)域的部分cdna稱為快速擴(kuò)增cdna末端技術(shù)（ race）。如果已知mrna的一片段鏈內(nèi)短序列，據(jù)此或設(shè)計(jì)基因特異引物，用原先存在的poly(a)尾（ 3末端）或附加的同聚尾（5末端）互補(bǔ)的序列做末端引物，就可以獲得

8、從未知末端直到已知區(qū)域的部分cdna序列。為獲得 5末端部分cdna克隆需用基因特異引物，產(chǎn)物第一鏈產(chǎn)物，可用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶及datp加 poly(a)2精品 料推薦尾。通過qt引物和反轉(zhuǎn)錄使用的上游基因特異引物生成第二鏈cdna。4 大腸桿菌作為基因工程受體菌具有哪些特點(diǎn)？真核基因在大腸桿菌中表達(dá)存在哪些障礙？答：特點(diǎn)：大腸桿菌培養(yǎng)方便、操作簡單、成本低廉，基礎(chǔ)生物學(xué)、分子遺傳學(xué)等方面的背景知識清楚，對其基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)理也比較了解，而且歷經(jīng)二十年的基因工程實(shí)踐，大腸桿菌已發(fā)展成為一種安全的基因工程實(shí)驗(yàn)體系，有多種適用的寄主菌株和載體系列，大腸桿菌易于進(jìn)行工業(yè)化批量生產(chǎn)。存在的障礙

9、：第一，在大腸桿菌的 mrna 的核糖體結(jié)合位點(diǎn)上， 含有一個起始密碼子及 16s 核糖體 rna 3 末端堿基互補(bǔ)序列，即 s-d 序列，而真核上缺泛這個序列。第二，許多真核基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物需要經(jīng)過翻譯后的加工修飾， 如正確的折疊和組裝，而細(xì)菌中通常并沒有這樣的修飾機(jī)制， 從而可能導(dǎo)致真核基因在大腸桿菌中的翻譯產(chǎn)物無法產(chǎn)生有活性的蛋白。第三、外源真核基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)分子往往能夠被細(xì)菌的蛋白酶識別，并被當(dāng)做 “異已分子”降解掉。8、 s-d 序列： 在大腸桿菌 mrna 的核糖體結(jié)合位點(diǎn)上， 含有一個轉(zhuǎn)譯起始密碼子及同16s 核糖體 rna 3，末端堿基互補(bǔ)的序列，該序列最初由shine 、

10、 dalgarno 發(fā)現(xiàn)，故后來命名為 shine dalgarno 序列，簡稱s-d 序列。1、什么是包涵體？重組蛋白在胞內(nèi)表達(dá)時，常常以不溶性蛋白聚集成的晶狀物形式存在，這種晶狀體即包涵體。包涵體的形成是外源蛋白的高效表達(dá)時的普遍現(xiàn)象， 這是由于肽鏈折疊過程中部分折疊的中間態(tài)發(fā)生了錯誤聚合，而不是形成成熟的天然態(tài)或完全解鏈的蛋白。2、什么是 - 互補(bǔ)篩選？質(zhì)粒載體具有- 半乳糖苷酶基因（lac z），當(dāng)外源dna插入到它的lac z，可造成表達(dá)后的 - 半乳糖苷酶失活，利用這一點(diǎn)就可以通過大腸桿菌轉(zhuǎn)化子菌落在添加有x-gal-iptg培養(yǎng)基中的顏色變化鑒別出重組子和非重組子。有些大腸桿菌上

11、帶有l(wèi)ac z 基因的部分編碼序列，質(zhì)粒載體中含有別一部分編碼序列， 當(dāng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入載體后， 可形成具有酶活性的蛋白質(zhì)。這種 lac z 基因上缺失了一部分編碼序列的突變體與帶有這一部分編碼序列的突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)的現(xiàn)象叫互補(bǔ)。3、限制性核酸內(nèi)切酶的活性受哪些因素影響？酶的純度。 dna 樣品的純度。 dna 的甲基化程度。酶切反應(yīng)的溫度與時間。 dna 分子的構(gòu)型。限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)緩沖液。5、基因工程誕生的理論基礎(chǔ)是什么？是現(xiàn)代分子生物學(xué)領(lǐng)域理論上的三大發(fā)現(xiàn)和技術(shù)上的三大發(fā)明。理論上的三大發(fā)現(xiàn)：證實(shí)了dna 是遺傳物質(zhì)揭示了dna 分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)理遺傳密碼的破譯和遺傳信

12、息傳遞方式的確定技術(shù)上的三大發(fā)明：3精品 料推薦限制核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)與dna 切割 dna 連接酶的發(fā)現(xiàn)與 dna 片段的連接基因工程載體的研究與應(yīng)用四、問答題（每題10 分，共 40 分）1 如何有效地提高外源基因的表達(dá)效率？提高啟動子強(qiáng)度縮短啟動子同克隆基因間距離高效的翻譯起始序列高效的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)提高質(zhì)?？截悢?shù)及穩(wěn)定性用以下方法提高翻譯水平：調(diào)整sd序列與 aug間的距離用點(diǎn)突變的方法改變某些堿基增加mrna的穩(wěn)定性的減輕細(xì)胞的代謝負(fù)荷：誘導(dǎo)表達(dá)表達(dá)載體的誘導(dǎo)復(fù)制提高表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性，防止其降解：克隆一段原核序列，表達(dá)融合蛋白采用某種突變菌株表達(dá)分泌蛋白質(zhì)2 試述載體構(gòu)建一般方法a 目的基

13、因分析（ 1） orf 分析（ 2）酶切位點(diǎn)分析b 載體選擇與分析（ 1）多克隆位點(diǎn)分析（ 2）抗性標(biāo)記分析（ 3）啟動子與其他篩選標(biāo)記分析c 連接體系與連接時間確定4 大腸桿菌作為基因工程受體菌的優(yōu)缺點(diǎn)是什么？優(yōu)點(diǎn)：大腸桿菌培養(yǎng)方便、操作簡單、成本低廉，基礎(chǔ)生物學(xué)、分子遺傳學(xué)等方面的背景知識清楚，對其基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)理也比較了解，而且歷經(jīng)二十年的基因工程實(shí)踐，大腸桿菌已發(fā)展成為一種安全的基因工程實(shí)驗(yàn)體系，有多種適用的寄主菌株和載體系列，大腸桿菌易于進(jìn)行工業(yè)化批量生產(chǎn)。缺點(diǎn)：在通常情況下， 細(xì)菌的 rna聚合酶不能識別真核的啟動子；許多真核基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物需要經(jīng)過翻譯后的加工修飾，如正確的

14、折疊和組裝，而細(xì)菌中通常并沒有這樣的修飾機(jī)制，從而可能導(dǎo)致真核基因在大腸桿菌中的翻譯產(chǎn)物無法產(chǎn)生有活性的蛋白；外源真核基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)分子往往能夠被細(xì)菌的蛋白酶識別，并被當(dāng)做“異已分子”降解掉。一、名次解釋（解釋并翻譯下列名詞術(shù)語，每題4 分，共 20 分）1魔斑：2轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)染：3 rna干擾：4. 融合蛋白：5考斯質(zhì)粒：二、說明下列各項(xiàng)在基因工程中的主要作用或功能（每題2 分，共 10 分）1. 核酶：2. dna 探針：3. klenow 酶：4. 分子克?。?. 載體：4精品 料推薦三、分別說出5 種以上 rna的功能？（ 10 分）四、對天然質(zhì)粒的人工構(gòu)建主要表現(xiàn)在哪些方面？（10

15、分）五、說明雙脫氧鏈終止法（sanger 法）測定dna一級結(jié)構(gòu)的原理與方法？（10 分）六、典型的dna重組實(shí)驗(yàn)通常包括哪些步驟？（10 分）七、基因文庫的構(gòu)建對重組子的篩選舉出3 種方法并簡述過程。（10 分）八、在 pcr擴(kuò)增時，（ 1） pcr擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶，為什么？有何對策？（2） pcr擴(kuò)增后有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶，其原因是什么？應(yīng)該如何改進(jìn)？（20 分）載體： vector ，能在連接酶的作用下和外源 dna片段連接并運(yùn)送 dna分子進(jìn)入受體細(xì)胞的dna分子。2不相容性： incompatibility，是指

16、在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒不能共存于同一宿主細(xì)胞內(nèi)。3 cdna基因文庫： cdna library，是指以mrna為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶及其他一系列酶的催化作用下所獲得的雙鏈 cdna，經(jīng)與適當(dāng)載體連接并轉(zhuǎn)化到寄主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，由此而構(gòu)成包含著相應(yīng)基因編碼序列的一群克隆。4環(huán)腺苷酸受體蛋白. ： camp receptor protein， crp，camp與 crp結(jié)合后所形成的復(fù)合物稱激活蛋白cap（camp activated protein）5核酶： ribozyme ，具有催化活性的rna，在 rna的剪接加工過程中起到自我催化的作用。二、說明下列各項(xiàng)在基因工

17、程中的主要作用或功能（每題2 分，共 10 分）1 sd 序列：是核糖體與mrna結(jié)合序列，對翻譯起到調(diào)控作用。.2. klenow 酶： dna聚合酶 i 大片段，只是從 dna聚合酶 i 全酶中去除了 5 3 外切酶活性3.藍(lán) - 白斑篩選： 含 lacz 基因（編碼 半乳糖苷酶） 該酶能分解生色底物x-gal產(chǎn)生藍(lán)色，從而使菌株變藍(lán)。當(dāng)外源 dna插入后， lacz 基因不能表達(dá)，菌株呈白色，以此來篩選重組細(xì)菌。4. 互補(bǔ)干擾 rna： micrna，或稱反義 rna，與 mrna序列互補(bǔ)，可抑制 mrna的翻譯。5.限制性內(nèi)切核酸酶：常簡稱為限制酶，是一類能識別雙鏈dna分子中特異核苷

18、酸序列并由此切割dna雙鏈結(jié)構(gòu)的水解酶。三、典型的dna重組實(shí)驗(yàn)通常包含幾步？（10 分）5精品 料推薦提取供體生物的目的基因（或稱外源基因），酶接連接到另一dna分子上（克隆載體），形成一個新的重組dna分子。將這個重組dna分子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞并在受體細(xì)胞中復(fù)制保存，這個過程稱為轉(zhuǎn)化。對那些吸收了重組dna的受體細(xì)胞進(jìn)行篩選和鑒定。對含有重組dna的細(xì)胞進(jìn)行大量培養(yǎng)，檢測外援基因是否表達(dá)。四、 pcr的基本反應(yīng)過程包括哪些？反應(yīng)體系需要什么條件？（10 分）pcr的基本反應(yīng)過程包括：變性、退火、延伸三個階段。（5 分）需要具備的反應(yīng)條件包括： a、被分離的目的基因兩條鏈各一端序列相互補(bǔ)的dna

19、 引物（約20 個堿基左右）。 b、具有熱穩(wěn)定性的酶如： tagdna聚合酶。 c、dntp。d、作為模板的目的dna序列。（ 5 分）五、植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)分為幾類？分別舉例說明。（10 分）按照基因引入受體植物細(xì)胞的方法，植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)大體可分為兩類（2分）：以載體為媒介的基因轉(zhuǎn)移： 就是將目的基因連于某一載體dna上，然后通過寄主感染受體植物等途徑將個源基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞的技術(shù)，如農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。（4 分）基因或 dna的直接轉(zhuǎn)移： dna的直接轉(zhuǎn)移是指利用植物細(xì)胞生物學(xué)特性，通過物理、化學(xué)和生物學(xué)方法將外源基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞的技術(shù)，如電激和電注射法、基因槍法、微注射法等。（4 分）六、分

20、子克隆常用載體有哪些？它們都具備什么樣的基本條件？根據(jù)dna分子克隆的目的，載體可分為哪幾類？（10 分）目前所用的載體有細(xì)菌的質(zhì)粒 ( 如大腸桿菌質(zhì)粒 ) 、噬菌體或病毒， 更多的是經(jīng)過人工改造的一些載體。（ 3 分）用于分子克隆的載體都應(yīng)具備下述條件：在細(xì)胞內(nèi)能自主復(fù)制，即具有復(fù)制原點(diǎn)，可以使所攜帶的外源dna在受體細(xì)胞內(nèi)忠實(shí)地復(fù)制； 有適宜的限制酶切位點(diǎn)。最好是對多種限制酶有單一切點(diǎn)，且酶切位點(diǎn)不在復(fù)制原點(diǎn)內(nèi)。具備對重組體易于檢測的選擇性遺傳標(biāo)記。（4 分）根據(jù) dna分子克隆目的，載體可分為克隆載體、穿梭載體和表達(dá)載體三類。（3 分）七、對天然質(zhì)粒的人工構(gòu)建主要表現(xiàn)在哪些方面？（10

21、分）天然質(zhì)粒往往存在著缺陷，因而不適合用作基因工程的載體，必須對之進(jìn)行改造構(gòu)建：a、加入合適的選擇標(biāo)記基因，如兩個以上，易于用作選擇, 通常是抗生素基因。（2 分）6精品 料推薦b、增加或減少合適的酶切位點(diǎn)，便于重組。（2 分）c、縮短長度，切去不必要的片段，提高導(dǎo)入效率，增加裝載量。（2 分）d、改變復(fù)制子，變嚴(yán)緊為松弛，變少拷貝為多拷貝。（2 分）e、根據(jù)基因工程的特殊要求加裝特殊的基因元件。（2 分）八、 pcr反應(yīng)條件最關(guān)鍵的是溫度、時間和循環(huán)數(shù)的選擇，應(yīng)該注意什么？（20 分）首先是溫度與時間的設(shè)置： 基于 pcr原理三步驟而設(shè)置變性- 退火- 延伸三個溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度

22、點(diǎn)法，雙鏈dna在 9095變性，再迅速冷卻至 40 60退火，然后快速升溫至7075使引物鏈沿模板延伸。變性溫度與時間：變性溫度低則解鏈不完全。一般情況下， 93 94lmin 足以使模板dna變性，若低于 93則需延長時間，但溫度不能過高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對酶的活性有影響。（5 分）退火 ( 復(fù)性 ) 溫度與時間：變性后溫度快速冷卻至40 60，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。退火溫度與時間取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。在tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高pcr反應(yīng)的特異性。復(fù)性時間一般為30 60sec ，足以使引物與模板之間完全

23、結(jié)合。（5 分）延伸溫度與時間：pcr反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在7075之間，常用溫度為72，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。pcr延伸反應(yīng)的時間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定，一般1kb 以內(nèi)的 dna片段，延伸時間1min 是足夠的。 3 4kb 的靶序列需3 4min；擴(kuò)增 10kb 需延伸至 15min。延伸進(jìn)間過長會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時間要稍長些。（ 5 分）其次是循環(huán)次數(shù)的設(shè)置。循環(huán)次數(shù)決定pcr擴(kuò)增程度。 pcr循環(huán)次數(shù)主要取決于模板dna的濃度。 一般的循環(huán)次數(shù)選在 30 40 次之間， 循環(huán)次數(shù)越多， 非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。（5 分）一

24、、名次解釋（解釋并翻譯下列名詞術(shù)語，每題4 分，共 20 分）1魔斑： magic spot ，當(dāng)細(xì)菌生長過程中，遇到氨基酸全面缺乏時，細(xì)菌將會產(chǎn)生一個應(yīng)急反應(yīng)，停止全部基因的表達(dá)。產(chǎn)生這一應(yīng)急反應(yīng)的信號是鳥苷四磷酸(ppgpp)和鳥苷五磷酸（ pppgpp）。 ppgpp與 pppgpp 的作用不只是一個或幾個操縱子，而是影響一大批，所以稱他們是超級調(diào)控子或稱為魔斑。2轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)導(dǎo)，transduction，指以噬菌體為載體，在細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移dna的過程，有時也指在真核細(xì)胞之間通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移和獲得細(xì)胞 dna的過程。轉(zhuǎn)染， transfection ，指病毒或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入

25、真核細(xì)胞的過程。3 rna干擾： rna interference,rnai，是一種進(jìn)化上保守的抵御轉(zhuǎn)基因或外來病毒侵犯的防御機(jī)制。將與靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mrna存在同源互補(bǔ)序列的雙鏈rna 導(dǎo)入細(xì)7精品 料推薦胞后 , 能特異性地降解該mrna, 從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失, 這一過程屬于轉(zhuǎn)錄后基5. 載因沉默機(jī)制范疇。體：能在4. 融合蛋白： fusionprotein ，真核蛋白的基因與外源基因連接，同時表達(dá)翻譯出的連接原基因蛋白與外源蛋白結(jié)合在一起所組成的蛋白質(zhì)。酶的作用5考斯質(zhì)粒： cosmid ，是經(jīng)過人工構(gòu)建的一種外源dna載體，保留噬菌體兩端的cos下和區(qū)，與質(zhì)粒連接構(gòu)成。外源二

26、、說明下列各項(xiàng)在基因工程中的主要作用或功能（每題2 分，共 10 分）dna片段1. 核酶：具有催化活性的rna，在 rna的剪接加工過程中起到自我催化的作用。連接并運(yùn)2. dna 探針：是帶有標(biāo)記的一段已知序列dna，用以檢測未知序列、篩選目的基因等送dna方面廣泛應(yīng)用。分子3. klenow 酶： dna聚合酶 i 大片段，只是從dna聚合酶 i 全酶中去除了 5 3外切 進(jìn)入酶活性。受體細(xì)胞4. 分子克隆：在體外對dna分子按照即定目的和方案進(jìn)行人工重組，將重組分子導(dǎo)入的dna合適宿主，使其在宿主中擴(kuò)增和繁殖，以獲得該dna分子的大量拷貝。分子。三、分別說出 5 種以上 rna的功能？（

27、 10 分）1）轉(zhuǎn)運(yùn) rna trna 轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸 （ 2 分）2）核蛋白體 rna rrna 核蛋白體組成成（ 2 分）3）信使 rna mrna蛋白質(zhì)合成模板（2 分）4）不均一核rna hnrna 成熟 mrna的前體（ 2 分）5）小核 rna snrna參與 hnrna的剪接（ 2 分）6）小胞漿rna scrna/7sl-rna 蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位合成的信號識別體的組成成分7）反義 rna anrna/micrna對基因的表達(dá)起調(diào)節(jié)作用8）核 酶 ribozyme rna 有酶活性的 rna四、對天然質(zhì)粒的人工構(gòu)建主要表現(xiàn)在哪些方面？（10 分）天然質(zhì)粒往往存在著缺陷，因而不適合用作

28、基因工程的載體，必須對之進(jìn)行改造構(gòu)建：a、加入合適的選擇標(biāo)記基因，如兩個以上，易于用作選擇, 通常是抗生素基因。（2 分）8精品 料推薦b、增加或減少合適的酶切位點(diǎn)，便于重組。（2 分）c、縮短長度，切去不必要的片段，提高導(dǎo)入效率，增加裝載量。（2 分）d、改變復(fù)制子，變嚴(yán)緊為松弛，變少拷貝為多拷貝。（2 分）e、根據(jù)基因工程的特殊要求加裝特殊的基因元件。（2 分）五、利用雙脫氧末端終止法（sanger 法）測定 dna一級結(jié)構(gòu)的原理與方法？（10 分）原理是采用核苷酸鏈終止劑2，3，- 雙脫氧核苷酸終止dna的延長。由于它缺少形成 3/5/磷酸二脂鍵所需要的 3-oh，一旦參入到dna鏈中，

29、此 dna鏈就不能進(jìn)一步延長。根據(jù)堿基配對原則，每當(dāng) dna聚合酶需要 dnmp參入到正常延長的dna鏈中時，就有兩種可能性，一是參入 ddntp,結(jié)果導(dǎo)致脫氧核苷酸鏈延長的終止；二是參入dntp,使 dna鏈仍可繼續(xù)延長，直至參入下一個 ddntp。根據(jù)這一方法， 就可得到一組以ddntp結(jié)尾的長短不一的dna片段。（6 分）方法是分成四組分別為 ddamp、 ddgmp、ddcmp、ddtmp反應(yīng)后，聚丙烯酰胺凝膠電泳按泳帶可讀出 dna序列。 （ 4 分）六、典型的 dna重組實(shí)驗(yàn)通常包括哪些步驟？（10 分）a、提取供體生物的目的基因（或稱外源基因），酶接連接到另一dna分子上（克隆載

30、體），形成一個新的重組 dna分子。 （ 3 分）b、將這個重組 dna分子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞并在受體細(xì)胞中復(fù)制保存，這個過程稱為轉(zhuǎn)化。（ 2分）c、對那些吸收了重組 dna的受體細(xì)胞進(jìn)行篩選和鑒定。（ 3 分）d、對含有重組 dna的細(xì)胞進(jìn)行大量培養(yǎng)，檢測外援基因是否表達(dá)。（2 分）七、基因文庫的構(gòu)建對重組子的篩選舉出3 種方法并簡述過程。（10 分）1）抗生素抗性篩選、 抗性的插入失活、 蘭 - 白斑篩選 或 pcr篩選、 差式篩選、 dna探針 （ 2 分）2）多數(shù)克隆載體均帶有抗生素抗性基因（抗氨芐青霉素、四環(huán)素）。當(dāng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中后，該菌便獲得抗性，沒有轉(zhuǎn)入的不具有抗性。但不能區(qū)分是否

31、已重組。（3 分）3）在含有兩個抗性基因的載體中，如果外源 dna片段插入其中一個基因并導(dǎo)致該基因失活，就可用兩個分別含不同藥物的平板對照篩選陽性重組子。如 puc質(zhì)粒含 lacz 基因（編碼 半乳糖苷酶）該酶能分解生色底物 x-gal(5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚 - -d- 半乳糖苷 ) 產(chǎn)生藍(lán)色，從而使菌株變藍(lán)。當(dāng)外源 dna插入后， lacz 基因不能表達(dá)，菌株呈白色，以此來篩選重組細(xì)菌。（ 5 分）9精品 料推薦八、在 pcr擴(kuò)增時，（ 1） pcr擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶，為什么？有何對策？（2） pcr擴(kuò)增后有時

32、出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶，其原因是什么？應(yīng)該如何改進(jìn)？（20 分）（ 1） pcr擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。 非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是 mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及pcr循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量， 往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。（5 分）其對策有： 必要時重新設(shè)計(jì)引物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量， 適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法 (93 變性， 65左右退火與

33、延伸 ) 。（ 5 分）（2） pcr 擴(kuò)增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差， dntp濃度過高， mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。（5 分）其對策有： 減少酶量， 或調(diào)換另一來源的酶。 減少 dntp的濃度。 適當(dāng)降低 mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。（ 5 分）蘇州大學(xué)基因工程(02 級生物技術(shù)專業(yè)) 試題 (a 卷)(2005.12)姓名學(xué)號得分一 名詞解釋 (4 分 / 題 , 共 20 分)重疊基因不同基因的核苷酸序列有時為相鄰兩個基因共用, 將核苷酸彼此重疊的兩個基因稱為重疊基因2. 鋅指結(jié)構(gòu)由兩個半胱氨酸(cys)

34、殘基和兩個組氨酸(his) 殘基通過位于中心的鋅離子結(jié)合成一個穩(wěn)定的指狀結(jié)構(gòu) , 并以鋅輔基敖合形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)作為活性單位 , 在指狀突出區(qū)表面暴露的堿基及其極性氨基酸與 dna結(jié)合有關(guān)3.scfv它是由抗體重 , 輕鏈的可變區(qū)基因(vh,vl) 之間通過一段編碼連接肽基因, 拼接后表達(dá)形成的重組蛋白 . 是一種具有抗原結(jié)合能力的最小抗體片段 , 可在一些不需 fc 段效應(yīng)功能的實(shí)際應(yīng)用中開展研究和應(yīng)用 . 其優(yōu)點(diǎn)是分子量小 , 易于穿透組織到達(dá)靶器官發(fā)揮功效 , 易于構(gòu)建和生產(chǎn) , 但易于被清除 .4. 基因置換是指將致病基因整個地被有功能的正常基因所置換, 使致病基因永久地得到更正.5.

35、基因敲除基因敲除是向正常生物個體內(nèi)引入某個突變的基因位點(diǎn)而選擇性地使某特定基因功能失活的技術(shù) .二 填空題 (3分 / 題, 共 15 分 )1.細(xì)菌的移動基因存在著三種類型的轉(zhuǎn)位因子包括插入序列 ,轉(zhuǎn)位子 , 噬菌體 mu和d108 .2. klenow酶在有 dntp 情況下 , 呈現(xiàn) dna聚合酶活性 , 在 沒有 dntp 情況下呈現(xiàn)外切酶活10精品 料推薦性 .3. 外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá) , 常用的啟動子有 乳糖啟動子 ,trp 啟動子 , tac 啟動子 ,噬菌體的pl 和 pr啟動子 ,脂蛋白啟動子.4.在 laci 標(biāo)記基因插入外源基因, 經(jīng) iptg 誘導(dǎo) , 在 x-g

36、al 培養(yǎng)基中顯白色 , 為 陽性克隆 ,未插入基因的克隆顯藍(lán) 色 , 為 陰 性克隆 .5. 基因序列經(jīng)堿基替代 , 缺失或插入后 , 可使遺傳信息產(chǎn)生三種不同的后果 , 分別為 同義突變 , 錯義突變 , 無義突變 .三 是非判斷題(2分 / 題 , 共 10 分 )1.dna 連接酶是一種能催化二條 dna鏈之間形成磷酸二酯鍵的酶 , 因此該酶既可修復(fù)基因序列中的缺口 , 也可修復(fù)裂口 . ( )2. 質(zhì)粒提取后 , 在瓊脂糖電泳出現(xiàn)一條帶時說明質(zhì)粒提取純度高 , 當(dāng)為三條帶時為純度不高.( )3.cos位點(diǎn) ,cos質(zhì)粒 ,cos細(xì)胞它們均含有用于自身環(huán)化的12 個堿基的互補(bǔ)粘性末端

37、.( )4. 入噬菌體的插入型載體只有一個單一限制酶切點(diǎn), 替換型載體有2 個成對的限制性酶切點(diǎn).( )5. 原核細(xì)胞和真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的mrna均具有與 rrna結(jié)合的 sd序列 , 以利于進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)錄 .( )四. 不定項(xiàng)選擇題(3 分 / 題 , 共 15 分 )1. 下列生物體的細(xì)胞基因組哪些會有斷裂基因 ( ab ) a. 動物 b. 人 c. 細(xì)菌 d. 噬菌體2. 真核細(xì)胞基因表達(dá)的特點(diǎn)為( ad )a. 單順反子b. 多順反子 c. 轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯連續(xù)進(jìn)行d .轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯分開分步進(jìn)行3. 識別基因序列不同 , 但酶切后產(chǎn)生的粘性末端相同的一類酶為( b )a. 同工酶b. 同尾酶 c

38、. 同裂酶 d. 同位酶4. pbr322質(zhì)粒作為基因克隆載體應(yīng)有下列何種調(diào)控元件( abd )a.ampr 和 tetr b.ori復(fù)制子 c.lacz 標(biāo)記 d. 多克隆位點(diǎn)5. 噬菌體外包裝目的基因片段的大小應(yīng)為( d )a. 小于 噬菌體 dna的 50% b. 小于噬菌體 dna的 75%c.大于 噬菌體 dna的 105% d.為 噬菌體 dna的 75% 105%五 問答題 (8 分 / 題, 共 40分 )真核細(xì)胞基因組中的基因常有內(nèi)含子存在, 能否在原核細(xì)胞中表達(dá)能 , 為什么不能 , 為什么不能 , 因?yàn)樵思?xì)胞缺乏對真核基因中內(nèi)含子的剪接功能和轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng). 原核生物必

39、須有相應(yīng)的原核 rna聚合酶可識別原核細(xì)胞的啟動子,以催化 rna的合成 .基因表達(dá)是以操縱子為單位, 操縱子由數(shù)個相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控功能的部位組成的. 因此在構(gòu)建原核表達(dá)載體時必須有1 個強(qiáng)的原核啟動子及其兩側(cè)的調(diào)控序列.質(zhì)粒單酶切點(diǎn)的基因連接如何降低本底和防止自我環(huán)化和提高連接效率目的基因片斷與載體由相同的單一限制性核酸內(nèi)切酶( 如 ecori) 消化酶切后 , 兩者的兩端均具有相同的粘性末端, 稱為單酶切點(diǎn)的粘性末端,又稱全同源性粘性末端 高背景載體經(jīng)單一限制性核酸內(nèi)切酶切割后,載體分子易于自我環(huán)化,既不利于目的基因的重組連接 ,大大降低陽性克隆效率,又可使非重組性載體造成高背景. 為

40、了防止載體的自我環(huán)化,通常用堿性磷酸酶去除載體粘性末端的5-p以抑制 dna的自我環(huán)化 . 在連接反應(yīng)中,具有5-p,的目的基因dna片斷可有效地與去磷酸化質(zhì)粒dna載體通過粘性末端發(fā)生互補(bǔ)連接,盡管產(chǎn)生的重組dna分子于連接點(diǎn)含有兩個缺口的開環(huán)分子, 盡管在轉(zhuǎn)化時其轉(zhuǎn)化效率高于11精品 料推薦線性低于閉和環(huán) ,但轉(zhuǎn)化大腸桿菌后, 在菌體內(nèi)其缺口可獲得修復(fù). 如第二章圖 2-6 雙向插入經(jīng)單一限制核酸內(nèi)切酶( 如 ecori) 切割的目的基因和載體,因二者的粘性末端是相同的 ,因此在連接反應(yīng)中, 目的基因可發(fā)生雙向插入 ,載體對目的基因表達(dá)是有方向的,而目的基因可雙向與之相連,這種連接若以克隆

41、目的基因片段為目的沒有影響, 若以表達(dá)為目的 ,我們就要對插入的片段進(jìn)行方向鑒定,因目的基因由起始密碼子向終止密碼子方向表達(dá)是定向轉(zhuǎn)錄的 , 一旦啟動子與目的基因編碼順序方向相反就不能正確轉(zhuǎn)錄目的基因的mrna.若構(gòu)建表達(dá) dna重組體選用雙酶切切割目的基因和載體, 可使目的基因與載體的連接發(fā)生定向連接重組 , 以便定向克隆 .真核表達(dá)調(diào)控的順式作用元件有哪些其作用特點(diǎn)是什么順式作用元件為一些能與dbp結(jié)合的特定序列的dna片段 ,決定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和rna聚合酶的轉(zhuǎn)錄效應(yīng) , 按功能可分為啟動子 , 增強(qiáng)子 , 沉默子 , 衰減子和終止子等dna序列片段 . 啟動子真核基因啟動子是基因表達(dá)時與

42、基因轉(zhuǎn)錄起始有關(guān)的5 端 dna序列 , 包括在 -30bp 區(qū)富含有at 的典型 tata盒 ( 框 )(tata box) 和在 -70 -80bp區(qū)域 ( 在 tatabox 上游 ) 啟動元件 . 前者是引導(dǎo) rna聚合酶在正確起始位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄mrna所必需的 dna序列 ,即保證轉(zhuǎn)錄的精確起始 .后者 upe是調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始頻率和提高轉(zhuǎn)錄效率的調(diào)控序列, 后者的序列常為 ggtcaat和gggccc序列 , 稱為 gc box,它們經(jīng)協(xié)同作用 , 以調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄效率 .啟動子的轉(zhuǎn)錄效率因細(xì)胞而異, 因此需要根據(jù)宿主細(xì)胞的類型選擇不同的啟動子, 以便真核基因的高效表達(dá) . 常用的啟動子有

43、rous 肉瘤病毒啟動子rsv和巨細(xì)胞病毒的啟動子cmv還.有 sv40早期啟動子 , 腺病毒的晚期啟動子 . 增強(qiáng)子增強(qiáng)子是使啟動子的基因轉(zhuǎn)錄效率顯著提高( 增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性 ) 的一類順式作用元件, 其本身不具有啟動子活性 , 是由多個獨(dú)立的 , 具有特征性的核苷酸序列所組成. 其基本的核心組件常由812bp 組成 , 以單拷貝或多拷貝串聯(lián)的形式存在. 增強(qiáng)子一般有以下特性 : 增強(qiáng)子能提高同一條 dna鏈上基因轉(zhuǎn)錄的速率 ; 增強(qiáng)子對同源或異源基因都有效 ;增強(qiáng)子的位置可在基因 5 上游 ,3 下游或內(nèi)部 ;無方向性 , 增強(qiáng)子從 5 3 或是從3 5 均可對啟動子發(fā)揮作用 ; 增強(qiáng)子可遠(yuǎn)離

44、轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn) ;增強(qiáng)子一般無基因特異性 ,對各種基因啟動子均有作用, 但具有組織或細(xì)胞特異性 .典型的增強(qiáng)子首先發(fā)現(xiàn)于sv40的病毒中 ,為 sv40的早期基因增強(qiáng)子, 約 200bp,含 2 個72bp 的重復(fù)序列 ,位于早期啟動子上游,增強(qiáng)子可促使病毒基因轉(zhuǎn)錄效率提高100 倍 , 因此具有這一增強(qiáng)子的載體已得到了廣泛的應(yīng)用. 近些年來 , 來自于 rous 肉瘤病毒基因長末端重復(fù)序列和人類巨細(xì)胞病毒(cmv)增強(qiáng)子也已被廣泛用于真核細(xì)胞的基因表達(dá).增強(qiáng)子能增強(qiáng)啟動子的轉(zhuǎn)錄能力, 有效的增強(qiáng)子能促進(jìn)轉(zhuǎn)錄達(dá)10 倍或 100 倍以上 ,在某些情況下 , 表達(dá)產(chǎn)物可能具有細(xì)胞毒效應(yīng). 因此 ,

45、最好使用一種可被外界刺激信號誘導(dǎo)表達(dá)外源基因的誘導(dǎo)型啟動子,誘導(dǎo)型啟動子有熱休克啟動子, 金屬硫蛋白啟動子 , 糖皮質(zhì)激和固醇類激素誘導(dǎo)的啟動子, 熱休克啟動子的誘導(dǎo)可通過提高細(xì)胞的培養(yǎng)溫度使啟動子轉(zhuǎn)錄水平提高, 重金屬離子可有效地促進(jìn)金屬硫蛋白啟動子的轉(zhuǎn)錄活性. rna 剪接信號多數(shù)高等的真核基因都含有內(nèi)含子序列,在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的前體mrna要經(jīng)過剪接過程去掉內(nèi)含子順序后才成為成熟的mrna分子 . 雖然許多基因的cdna轉(zhuǎn)入哺乳類動物細(xì)胞后,其表達(dá)不受有或無內(nèi)含子的影響,但有些基因在真核細(xì)胞中表達(dá)需要有內(nèi)含子的存在. 一般來說 , 在哺乳動物細(xì)胞的表達(dá)載體中最好有一段內(nèi)含子序列的剪接信號,以提供外源基因cdna表達(dá)的需要 . 常用的內(nèi)含子剪接序列有sv40的小 t 抗原的內(nèi)含子序列等.12精品 料推薦 負(fù)調(diào)控元件沉默子和衰減子是抑制基因轉(zhuǎn)錄的dna序列 ,稱為負(fù)調(diào)控元件,它們與反式作用因子相互結(jié)合而起作用