開(kāi)展vWF檢測(cè),應(yīng)對(duì)血栓試驗(yàn)挑戰(zhàn).ppt

1、開(kāi)展vWF檢測(cè) 應(yīng)對(duì)血栓試驗(yàn)挑戰(zhàn),什么是vWF,vWF分子是由內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞產(chǎn)生，首先形成前體多肽，包含22個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，一個(gè)741個(gè)氨基酸組成的前肽和2050個(gè)氨基酸的亞基，成熟的亞基被廣泛地糖基化。 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，兩個(gè)亞基的末端通過(guò)二硫鍵連接形成二聚體。高爾基體中，二聚體通過(guò)另外的二硫鍵形成多聚體，分子量可達(dá)到10,000KD，甚至更高，成熟vWF貯存在巨核細(xì)胞和血小板顆粒中以及內(nèi)皮細(xì)胞中Weibel-Palade小體中，vWF從內(nèi)皮細(xì)胞釋放入血漿，前肽分離并快速循環(huán)，血漿中vWF多聚體易于被金屬蛋白酶（metallo-protease,ADAMTS13）水解(ADAMTS13在血栓

2、性血小板減少性紫癜中缺失),vWF 基因,vWF基因位于12號(hào)染色體短臂,基因非常大，有52個(gè)外顯子，共178kb。信號(hào)肽和前肽由其中80kb核酸編碼，成熟亞基由其他堿基編碼。本圖顯示了重復(fù)的同源序列區(qū)域，部分假基因位于22號(hào)染色體。,vWF有什么作用,vWF的改變對(duì)人體的影響,正常的VWF水平變化 vWF水平與血型和種族有關(guān)，相比于O型血的人，A型和B型人水平較高（O型與蛋白糖基化水平較低有關(guān)，vWF在O型血人中低糖基化，而切割vWF的蛋白酶ADAMTS-13水平在O型血人中較高），非洲黑人后裔vWF水平較高加索人高。非洲非O型血黑人vWF正常范圍幾乎覆蓋了O型的高加索人群，其他血型僅有較小

3、的相關(guān)性。也就是說(shuō)，vWF基因正常的遺傳變異單核苷酸多態(tài)性也影響vWF水平，部分影響蛋白水解的易感性。,血型和種族在123例正常女性的平均因子水平中的影響 （來(lái)自 Miller et alia, J Thromb Haemost, 2003; 1:2191.),vWF和F可以受到各種因素影響而升高,（1）高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)或緊張導(dǎo)致腎上腺素釋； （2）炎癥反應(yīng)； （3）嚴(yán)重肝??； （4）甲亢時(shí)釋放高水平甲狀腺激素； （5）妊娠時(shí)較高水平雌激素和孕激素。,vWF減少圍繞各種vWD展開(kāi),什么是vWD vWD（血管性血友?。?是一種常染色體遺傳的先天性出血性疾病，發(fā)病原因是由于血管性血友病因子 (vWF)的

4、缺乏或功能障礙。臨床上最顯著的特征是鼻出血、小的皮膚傷口出血、粘膜或胃腸道出血，月經(jīng)量過(guò)多、創(chuàng)傷出血、手術(shù)或分娩出血，嚴(yán)重的vWF缺乏可能導(dǎo)致關(guān)節(jié)或肌肉出血。,純合子或可疑雜合子的剔除突變或缺失產(chǎn)生極少量或不產(chǎn)生VWF， 整個(gè)基因都可以發(fā)現(xiàn)這樣的突變 （3型）,假vWD,血小板膜糖蛋白Ib的功能獲得性突變可以導(dǎo)致高分子量vWF多聚體配體的親和力增加，這種顯性遺傳的高度顯性血小板疾病的表型與2B型vWD表型相似，患者有典型的出血時(shí)間延長(zhǎng)，F(xiàn)和vWF:Ag在正常范圍邊緣，vWF:RCo水平降低，缺乏高分子量多聚體，低濃度瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集增加和血小板減少癥。,獲得性vWD,出現(xiàn)在甲狀腺功能

5、低下、自身免疫性疾病、淋巴瘤、巨球蛋白血癥和其他相似的疾病，這種vWD可能在原發(fā)疾病發(fā)現(xiàn)前幾個(gè)月就出現(xiàn)了。確定vWD是獲得性而非先天性存在一定困難，試圖找到vWF抗體僅在少數(shù)病例中獲得成功。在參考實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)血漿中的vWF前肽，發(fā)現(xiàn)比正常人高，在一些主動(dòng)脈瓣狹窄的患者中描述了2A表型vWD綜合征,考慮可能是由于高分子量多聚體在瓣膜處消耗所致。,為何要開(kāi)展vWF檢測(cè)(1),Sadler博士估計(jì)人群中0.4%有出血癥狀，vWF水平較低，部分存在家族史。人群篩查出血癥狀和低vWF水平可能使這種遺傳性疾病的發(fā)病率過(guò)高。在某個(gè)特定的中心進(jìn)行研究，根據(jù)出血癥狀得出的發(fā)病率約為23-113/1,000,000

6、。vWF水平的適度下降被認(rèn)為是導(dǎo)致適度出血的危險(xiǎn)因素。Sadler博士希望將vWF水平作為疾病的危險(xiǎn)因素，而不是作為疾病診斷本身。,為何要開(kāi)展vWF檢測(cè)(2),存在非vWD的vWF減少或獲得性vWD或vWD綜合征 存在一過(guò)性vWF減低，存在反應(yīng)性vWF增高導(dǎo)致的對(duì)vWF減低的掩蓋 存在各種因素引起的vWF減低有報(bào)道接近1% 存在各種血栓凝固試驗(yàn)對(duì)vWF的不能區(qū)別,Laboratory Investigation of Hemostasis,PT,凝血因子 FVII, FX, FV and prothrombin PT延長(zhǎng)可發(fā)生在 30 %凝血酶原,或其他相關(guān)因子 10 % 肝病導(dǎo)致凝血蛋白合成

7、能力一過(guò)性下降，或總合成能力在50%以下時(shí) fibrinogen 中度肝臟病變就可以導(dǎo)致 fibrinogen合成減少 or dysfibrinogenemia(發(fā)生獲得性異常纖維蛋白血癥) low fibrinogen levels below 1 g/L 可以導(dǎo)致凝血實(shí)驗(yàn)結(jié)果嚴(yán)重影響 Other factors PRP 和 溫度(冷血漿待測(cè)縮短),APTT（1）,凝血因子 FVIII, FIX, FXI, FXII, prekallikrein, HMWK 因子VIII和IX 30 %即可延長(zhǎng)，但其他因子只有10%到20% prothrombin, FV, FX minor effect

8、if only one single factor reduced(單個(gè)因子缺陷影響小) prolongation of APTT in case of - increased consumption of coagulation factors, e.g. in DIC, post-surgery, or- decreased synthesis, e.g. oral anticoagulant therapy (OAT), liver disease fibrinogen low fibrinogen levels below 1 g/L may affect clot detection

9、(與PT相同),APTT（2）,各類抑制物 inhibitors against a single coagulation factor frequently develop in hemophiliacs, directed against the deficient factor lupus anticoagulants (LA) prolongation of APTT, but associated with thrombotic tendency fibrin(ogen) degradation products (FDP) interfer with fibrin formatio

10、n, e.g. in DIC, hypercoagulability, thrombolytic therapy,Fib,試劑(100NIHu/ml in 9g/L的NaCl)和樣本稀釋度(1:10稀釋后與試劑之比為2:1;檢測(cè)的凝固時(shí)間必須在550secs) 對(duì)肝素不敏感(0.8u/ml才有影響) 對(duì)FDP不敏感(190g/ml才有影響) FIB Clauss 方法檢測(cè)是對(duì)濃度和活性的聯(lián)合檢測(cè),參考值在1.83.6g/L 對(duì)于異常FIB的檢測(cè)要結(jié)合免疫學(xué)方法,BT（1）,BT（2）,Surgicut instead of lancet. Apply 40 mmHg blood pressur

11、e. Take blood every 30 sec. Normal range: 2-8 min,出血時(shí)間（BT）不敏感也不特異，在60%的vWF減少情況下,出血時(shí)間可延長(zhǎng)。但無(wú)臨床表現(xiàn)或檢測(cè)方法不規(guī)范的還是會(huì)遺漏。現(xiàn)在也正在尋找更多敏感和客觀的檢測(cè)方法，二十世紀(jì)80至90年代，開(kāi)始通過(guò)對(duì)vWF抗原水平和活性的直接檢測(cè)。,出血時(shí)間是診斷試驗(yàn),Collagen,Thrombin,Platelet,release ADP,Pl. pool,Pl. aggregation,serotanin Adrenalin,Ca+,PAgT（血小板聚集試驗(yàn)） 血小板聚集的機(jī)制,瑞斯托霉素輔因子活性vWF:RC

12、o 是最有效和最關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn),比較不同的出血,患者，女性25歲，術(shù)前APTT、PT、TT、Fg均正常，術(shù)后出現(xiàn)出血，非DIC，非創(chuàng)傷部位。經(jīng)凝血因子活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)FVIII：C為25%。 vWF抗原32%（血型A）， vWF：RCo14% vWFRCo:vWFAg為0.44 此類情形提示在結(jié)合病史后（有家族性出血傾向的），要加做凝血因子活性,vWF檢測(cè)對(duì)目前血栓試驗(yàn)補(bǔ)充作用的體現(xiàn),實(shí)驗(yàn)室要求的補(bǔ)充血栓試驗(yàn),無(wú)法涉及的血栓因素,術(shù)前準(zhǔn)備中BT的缺位 術(shù)前準(zhǔn)備中四項(xiàng)篩查試驗(yàn)的盲點(diǎn) 藥物和年齡對(duì)血栓因素和成分的干擾,vWF和FXIII,如何開(kāi)展vWF檢測(cè),1926年，瑞典赫爾辛基的埃里克von Will

13、ebrand博士首先發(fā)現(xiàn)了在瑞典和芬蘭之間的愛(ài)蘭群島海峽上有一個(gè)出血性疾病的大家族，他描述了上述的所用臨床癥狀，并推測(cè)出此病是一種顯性遺傳病，而大多數(shù)嚴(yán)重出血的家庭成員都是純合子。在當(dāng)時(shí)為數(shù)很少的可用檢查項(xiàng)目中僅有明顯異常的檢查項(xiàng)目是出血時(shí)間和毛細(xì)血管脆性試驗(yàn)（后者將血壓袖帶在上臂，在收縮壓和舒張壓之間的壓力下，持續(xù)幾分鐘并觀察前臂的瘀斑）。,二十世紀(jì)50年代，隨著凝血因子檢測(cè)的發(fā)展，血友病A能夠被準(zhǔn)確診斷，其遺傳方式是明顯的性染色體連鎖方式。家系中所有累及的男性患者都表現(xiàn)為F水平降低,而在vWD患者中，F(xiàn)水平也可能降低，但特定家系的受累成員F水平有明顯變化，低水平F在常染色體疾病中往往變化不

14、定。,整個(gè)二十世紀(jì)60年代，vWD中F和血漿因子VWF缺陷之間的關(guān)系仍令人費(fèi)解，70年代的發(fā)現(xiàn)對(duì)疾病認(rèn)識(shí)有很大的幫助，瑞斯托霉素（Ristocetin）是一種抗生素，由于它有時(shí)會(huì)導(dǎo)致患者血小板減少，因此被禁止在臨床上應(yīng)用，但它被證明是一種非常有效的試劑，可以刺激正常人或血友病A患者懸浮在血漿中的血小板聚集（富含血小板血漿）。將正常人或嚴(yán)重的血友病A患者的乏血小板血漿加入到vWD患者的富含血小板血漿中，瑞斯托霉素會(huì)誘導(dǎo)血小板聚集，證明vWD缺乏的是血漿底物（而非血小板自身）。一種vWF定量試驗(yàn)（瑞斯托霉素輔因子試驗(yàn)）得到了發(fā)展。,1975年后免疫試驗(yàn)將半純化F（當(dāng)時(shí)還不知道它能夠誘導(dǎo)vWF）注射

15、入兔中，能夠產(chǎn)生一種抗體可以識(shí)別所有血友病A的血漿底物，這些底物被稱為“凝血因子相關(guān)抗原, FR:Ag”（現(xiàn)在已明確是vWF:Ag），進(jìn)一步研究證明即是被稱為”凝血因子分子”，它包含兩個(gè)部分“F和VWF”，它們可以分離開(kāi)，vWF被發(fā)現(xiàn)是一種大的多聚體由許多重復(fù)亞單位組成。下圖顯示了根據(jù)分子大小免疫電泳顯示出的多聚體。,Figure 1. Multimers. This drawing represents multimer distribution in various types of VWD. The largest multimers are on top. Note the faint

16、er satellite bands around each major band.,1985年，克隆了vWF基因，測(cè)定了基因和血漿蛋白的序列，開(kāi)始研究結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。 1990年后，膠原結(jié)合試驗(yàn)、vWF-FVIII結(jié)合突變檢測(cè)，克隆基因中表達(dá)vWF 2000年后，美國(guó)和澳大利亞等對(duì)vWF檢測(cè)通常包括F、vWF:RCo和vWF:Ag。有條件的參考實(shí)驗(yàn)室也可加做vWF:CB， vWF-FVIII結(jié)合檢測(cè)和多聚體分析。,臨床檢測(cè)診斷思路,Patient at risk (e.g. bleeding history, before surgery, post surgical bleeding),

17、Laboratory Testing for vWD Variants Tests to establish the diagnosisTests to further define vWD - APTT - LD-RIPA Bleeding Time - Ristocetin induced vWF platelet - vWF F VIII binding - vWF:Ag - Collagen binding - vWF:RCo - vWF Ag II - vWF multimers - Platelet vWF - F VIII - vWF antibodies - vWF subun

18、its - DNA analysis,實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)途徑,最近，結(jié)合凝集檢測(cè)的全自動(dòng)血凝儀（主要是CS2000i/2100i）已經(jīng)使用解決了原先最有效和關(guān)鍵的試驗(yàn) vWF:RCo很難進(jìn)行，很難進(jìn)行自動(dòng)化操作，不能夠反復(fù)檢測(cè)，不能在血栓實(shí)驗(yàn)中同步獲得各種數(shù)據(jù)。而現(xiàn)在這種需求已得到滿足，可方便進(jìn)行各種隨訪，不需要送到參考實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。,我們的對(duì)策,40,全自動(dòng)血凝分析儀 CS-2000i/2100i,Main unit,IPU (Information Processing Unit),技術(shù)參數(shù),42,主要技術(shù)參數(shù) (1),43,主要技術(shù)參數(shù)(2),44,主要技術(shù)參數(shù)(3),新功能介紹,46,NE

19、W,每0.1秒，每個(gè)檢測(cè)可同時(shí)被5個(gè)波長(zhǎng)分析一次(340, 405, 575, 660 and 800 nm ),集成的檢測(cè)平臺(tái),多波長(zhǎng)檢測(cè)系統(tǒng), 凝固法: 405, 660, 800nm (Percentage Detection Method) 發(fā)色底物法: 405, 340nm (Rate Method) 免疫比濁法: 575, 800nm (Rate Method, VLin Method) 凝集法 vWF:RCo (800nm, VLin Method),47,通過(guò)多波長(zhǎng)檢測(cè)完成后，系統(tǒng)自動(dòng)選擇合適的波長(zhǎng),避免干擾,在一個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)下(800nm)可檢測(cè)到吸光度的變化，不受乳糜的影響。,

20、在一個(gè)短波長(zhǎng)下(405nm)可檢測(cè)到吸光度的變化，對(duì)于低纖維蛋白原的標(biāo)本。,擴(kuò)展了檢測(cè)范圍,PT with a lipemic sample,Fbg with a low fibrinogen,NEW,48,10個(gè)檢測(cè)通道中有4個(gè)可以用于血小板聚集方面的檢測(cè)試驗(yàn)比如： vWF:RCo and Platelet Aggregation (under development).,反應(yīng)杯中的混勻裝置,多波長(zhǎng)濾光片,增加了一個(gè)紫外線的濾光片(340nm) 用于檢測(cè)Factor XIII.,NEW,NEW,增加的新功能和新參數(shù),49,試劑管理的增強(qiáng),試劑冷藏位溫度在近10C Outer Reagent Rack; 30 positions (6 vials x 5) Inner Reagent Rack; 10 positions (2 vials x 5) 所有的位置均可任意放置試劑、標(biāo)準(zhǔn)品、定標(biāo)品。,50,最優(yōu)的試劑管理,設(shè)置試劑易于操作 放置試劑后，儀器自動(dòng)掃描試劑的名稱、批號(hào)等信息. 一種試劑同時(shí)可放置多個(gè)批號(hào) 最多3個(gè)批號(hào) 多個(gè)批號(hào)的試劑可同時(shí)使用 新批號(hào)試劑優(yōu)先使用 雙試劑標(biāo)簽 更換試劑時(shí)無(wú)需停止儀器.,激光條碼掃