《微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)》參考課件.ppt

1、專題2 :微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用,課題1 微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng),微生物包括哪五類,病毒 細(xì)菌 放線菌 真菌 原生動物,特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)都相當(dāng)簡單,個(gè)體多數(shù)十分微小.通常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu).且體內(nèi)一般不含有葉綠素.不能進(jìn)行光合作用.,原核生物界,原生生物界,真菌界,病毒界,微生物基礎(chǔ)知識,了解有關(guān)微生物及培養(yǎng)基的基礎(chǔ)知識，進(jìn)行無菌技術(shù)的操作，進(jìn)行微生物的培養(yǎng)。,知識目標(biāo)：,掌握培養(yǎng)基的制備、高壓蒸氣滅菌和平板劃線法等基本操作技術(shù)，熟練、規(guī)范地進(jìn)行無菌操作，成功地培養(yǎng)微生物。,無菌技術(shù)的操作。,課題重點(diǎn)和難點(diǎn)：,技能目標(biāo)：,一、基礎(chǔ)知識：,（一）培養(yǎng)基,人們按照微生物對營

2、養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。,（1）按物理狀態(tài)分：固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基。其中固體培養(yǎng)基用于菌種保存及分離、鑒定菌落、活菌計(jì)數(shù)等，液體培養(yǎng)基常用于發(fā)酵工業(yè)。 （2）按功能分：選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。 （3）按成分分：天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。,1.培養(yǎng)基的類型和用途,2.不同的微生物往往需要采用不同的培養(yǎng)基配方,3.不管哪種培養(yǎng)基，一般都含有水、碳源、和氮源、 無機(jī)鹽、等營養(yǎng)物質(zhì)， 另外還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì),例如:生長因子(即細(xì)菌生長必需，而自身不能合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧氣等的要求。,選擇培養(yǎng)基,加入青霉素的培養(yǎng)基:分離酵母

3、菌、霉菌等真菌 加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基:分離金黃色葡萄球菌 不加氮源的無氮培養(yǎng)基: 分離固氮菌 不加含碳有機(jī)物的無碳培養(yǎng)基:分離自養(yǎng)型微生物 加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基: 分離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞加入氨基喋呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶 核苷的培養(yǎng)基:分離雜交瘤細(xì)胞,根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。 合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。 優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對固定;成本低 缺點(diǎn)： 缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長需要。,合成培養(yǎng)基:,天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。 優(yōu)點(diǎn)：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果

4、好 缺點(diǎn)：來源受限;成分復(fù)雜，影響對某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析;易發(fā)生支原體污染;,天然培養(yǎng)基：,血清中含有： 多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）;多種金屬離子;激素;促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等;各種生長因子;轉(zhuǎn)移蛋白;不明成分,人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。,液體培養(yǎng)基：,表面生長,均勻混濁生長,沉淀生長,固體培養(yǎng)基：菌落，菌苔,半固體培養(yǎng)基：,無動力 有動力(彌散),(是否運(yùn)動),4.培養(yǎng)基的用途,液體培養(yǎng)基：增菌 固體培養(yǎng)基：純化，增菌 半固體培養(yǎng)基：動力檢測，保種,（二）無菌技術(shù),1.無菌技術(shù)的概

5、念,無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。無論是隨后將要學(xué)到的倒平板、平板劃線操作，還是稀釋涂布平板法，其操作中的每一步都需要做到“無菌”，即防止雜菌污染。只有熟練、規(guī)范地進(jìn)行無菌操作，才可能成功地培養(yǎng)微生物。,（1）消毒定義： 利用化學(xué)或物理方法，殺死大部份致病微生物的過程。區(qū)分為高程度消毒（High-level Disinfection）、中程度消毒（Intermediate-level Disinfection）、低程度消毒（Low-level Disinfection）三種方式。,2.消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別,（2）滅菌的定義：,使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所

6、有的微生物，包括芽孢和孢子，而達(dá)到完全無菌之過程。 滅菌消毒技術(shù)是微生物有關(guān)工作中最普通也是最重要的技術(shù)。,1、煮沸消毒法:100煮沸5-6min 2、巴氏消毒法：70-75 下煮30min或 80 下煮15min 3、化學(xué)藥劑消毒法:用75%酒精進(jìn)行皮膚消毒;氯氣消毒水源 4、紫外線消毒 ,(1)消毒的方法：,3.常用的消毒與滅菌的方法,1、灼燒滅菌,(2)滅菌的方法：,2、干熱滅菌：160-170 下加熱1-2h。,3、高壓蒸氣滅菌：100kPa、121 下維持15-30min.,最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌，它可以殺滅所有的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體，同時(shí)可以基本保持培養(yǎng)基的

7、營養(yǎng)成分不被破壞。 有些玻璃器皿也可采用高溫干熱滅菌。為了防止雜菌，特別是空氣中的雜菌污染，試管及玻璃燒瓶都需采用適宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各種金屬、塑料及硅膠帽，它們只可讓空氣通過，而空氣中的其他微生物不能通過。 而平皿是由正反兩平面板互扣而成，這種器具是專為防止空氣中微生物的污染而設(shè)計(jì)的。,無菌技術(shù),（3）微生物實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的基本操作程序,1、器具的滅菌 2、培養(yǎng)基的配制 3、培養(yǎng)基的滅菌 4、倒平板 5、微生物接種 6、恒溫箱中培養(yǎng) 7、菌種的保存,旁欄思考,1.無菌技術(shù)除了用來防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？,2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或

8、滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。 （1） 培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿 （2） 玻棒、試管、燒瓶和吸管 （3） 實(shí)驗(yàn)操作者的雙手,答：無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。,答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。,（一）制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)細(xì)菌）,牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g NaCl 5g 將上述物質(zhì)溶解后，用蒸餾水定容至1000ml，調(diào)節(jié)PH為7.07.2。在肉湯培養(yǎng)基中加入1520g的瓊脂，即制成牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基。,二、實(shí)驗(yàn)操作：,1計(jì)算、稱量 2溶化 3調(diào)pH：pH76 4過濾：這一步可以省去。 5分裝：分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，

9、以免沾污棉塞而引起污染。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜。 6加塞 7包扎,操作步驟,8滅菌:將50ml培養(yǎng)基用玻棒轉(zhuǎn)移至三角錐瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮紙，再放入高壓蒸氣滅菌鍋，在壓力為100kPa、溫度為121，滅菌1530min。將培養(yǎng)皿用舊報(bào)紙包裹，放入干熱滅菌箱內(nèi)，在160170 下滅菌2h。 9倒平板:待培養(yǎng)基冷卻到50 左右時(shí)，在酒精燈附近倒平板。（倒平板操作見課本）2d后觀察平板，無雜菌污染才可用來接種. 10無菌檢查：將滅菌的培養(yǎng)基放入37的溫室中培養(yǎng)2448小時(shí)，以檢查滅菌是否徹底。,問題討論,1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50 左右時(shí)，才能用來倒平板。你用什么

10、辦法來估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？,答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí)，就可以進(jìn)行倒平板了。,2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？,答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。,3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？,4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？,答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。,答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物

11、。,（二）純化大腸桿菌,接種方法有： 平板劃線法和稀釋涂布平板法,平板劃線法: 通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作,將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。 在數(shù)次劃線后,可以分離到由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來的肉眼可見的子細(xì)胞群體,這就是菌落.,微生物的接種技術(shù),問題討論,1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？,答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，

12、使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。,2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？,答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。,3.在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？,答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來的菌落。,問題討論,涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進(jìn)行無菌操作？,應(yīng)從操作的各個(gè)細(xì)節(jié)保證“

13、無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。,微生物的恒溫培養(yǎng),微生物的恒溫培養(yǎng),微生物的恒溫培養(yǎng),菌種的保存,1、臨時(shí)保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后置于4冰箱保存。 2、長期保存：甘油冷凍管藏法,培養(yǎng)12 h與24 h后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不同,（一）培養(yǎng)基的制作是否合格,如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫12 d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。,（二）接種操作是否符合無菌要求,如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點(diǎn)，則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了

14、其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達(dá)到要求，需要分析原因，再次練習(xí)。,（三）是否進(jìn)行了及時(shí)細(xì)致的觀察與記錄,三、課題成果評價(jià) ：,本課題知識小結(jié),【典例解析】,例1關(guān)微生物營養(yǎng)物質(zhì)的敘述中，正確的是 A.是碳源的物質(zhì)不可能同時(shí)是氮源 B.凡碳源都提供能量 C.除水以外的無機(jī)物只提供無機(jī)鹽 D.無機(jī)氮源也能提供能量,答案：D,解析：不同的微生物，所需營養(yǎng)物質(zhì)有較大差別，要針對微生物的具體情況分析。對于A、B選項(xiàng)，它的表達(dá)是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同時(shí)是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同時(shí)是能源，如葡萄糖；有的碳源同時(shí)是氮源，也是能源，如蛋白胨。對于C選項(xiàng)，除水以

15、外的無機(jī)物種類繁多，功能也多樣。如二氧化碳，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源；NaHCO3，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源和無機(jī)鹽；而NaCl則只能提供無機(jī)鹽。對于D選項(xiàng)，無機(jī)氮源提供能量的情況還是存在的，如NH3可為硝化細(xì)菌提供能量和氮源。,例2下面對發(fā)酵工程中滅菌的理解不正確的是 A.防止雜菌污染 B.消滅雜菌 C.培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備都必須滅菌 D.滅菌必須在接種前,【典例解析】,答案：B,解析：滅菌是微生物發(fā)酵過程的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。A說的是滅菌的目的，因?yàn)榘l(fā)酵所用的菌種大多是單一的純種，整個(gè)發(fā)酵過程不能混入其他微生物（雜菌），所以是正確的；B是錯誤的，因?yàn)闇缇哪康氖欠乐闺s菌污染，但實(shí)際操作中不可能只消滅雜菌，而是消滅全部微生物。C是正確的，因?yàn)榕c發(fā)酵有關(guān)的所有設(shè)備和物質(zhì)都要滅菌；發(fā)酵所用的微生物是滅菌后專門接種的，滅菌必須在接種前，如果接種后再滅菌就會把所接菌種也殺死。,例3右表是某微生物培養(yǎng)基成分，請據(jù)