《發(fā)酵工程》第3章 培養(yǎng)基的制備與滅菌.ppt

1、第三章 培養(yǎng)基的制備,教學內(nèi)容(4學時)： 了解培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分，掌握培養(yǎng)基的類型和用途 了解發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇，了解原料轉(zhuǎn)換的意義 了解淀粉水解糖的制備方法 了解生物合成的前體物質(zhì)及促進劑,第一節(jié) 培養(yǎng)基的原材料,培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分 培養(yǎng)基的類型 發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇 原料轉(zhuǎn)換及意義,碳酸氣 淀粉水解糖、糖蜜、亞硫酸鹽紙漿廢液等 石油、正構(gòu)石蠟、天然氣 醋酸、甲醇、乙醇等石油化工產(chǎn)品,一、培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分及用途,1.碳源,功能：提供能量、構(gòu)成菌體、代謝產(chǎn)物的物質(zhì)基礎(chǔ)；,有機氮：黃豆餅粉、花生餅粉、玉米漿、蛋白胨、 酵母粉、魚粉、發(fā)酵菌絲體、酒糟水等 無機氮： 尿素、硫酸銨、氨水、硝酸鹽,功能：構(gòu)成菌

2、體、含氮代謝物；,2.氮源,磷酸鹽、鉀鹽、鈣鹽等礦物鹽 3.無機鹽 鐵、錳、鈷等微量元素 功能：構(gòu)成菌體，參與酶的組成，維持酶活性，調(diào)節(jié)滲透壓，調(diào)節(jié)pH值，維持氧化還原電位；,4.特殊生長因子：硫胺素、生物素、對氨基苯甲酸、肌酸等 功能：酶的輔助部分，維持生命活動；,5發(fā)酵的促進劑與抑制劑 發(fā)酵培養(yǎng)基中某些成分的加入有利于調(diào)節(jié)產(chǎn)物的形成，而并不促進微生物的生長，這些物質(zhì)包括前體、促進劑和抑制劑,1）、前體：指某些化合物加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接被微生物在生物合成過程中結(jié)合到產(chǎn)物分子中去，而其自身的結(jié)構(gòu)沒有多大的變化，但產(chǎn)物的產(chǎn)量卻因加入前體而有較大的提高。 如：在青霉素生產(chǎn)中加入玉米漿，青霉素

3、產(chǎn)量可從20u/mL增加到100u/mL，研究發(fā)現(xiàn)玉米漿中的苯乙胺被有限結(jié)合到青霉素分子中，從而提高了青霉素G的產(chǎn)量。,2）、促進劑：指那些既不是營養(yǎng)物又不是前體，但卻能提高產(chǎn)量的添加劑。 比如在酶制劑發(fā)酵過程中，加入誘導物、表明活性劑及其它一些產(chǎn)酶促進劑（比如吐溫80、植酸、洗衣粉等）,3）、抑制劑：在發(fā)酵過程中加入抑制劑會抑制某些代謝途徑的進行，同時會使另外一些代謝途徑活躍，從而獲得人們所需要的某種產(chǎn)物或使正常代謝的某一代謝中間物積累起來。 例如：微生物發(fā)酵生產(chǎn)甘油中，例如亞硫酸氫鈉，它與代謝過程中的乙醛生成加成物。,6.水分 功能：生化反應均在水溶液中進行,二、培養(yǎng)基的類型,1.依營養(yǎng)物

4、質(zhì)的來源分類 天然培養(yǎng)基； 合成培養(yǎng)基，也稱組合培養(yǎng)基（多用于定量研究）； 半合成培養(yǎng)基，（用的最多，在部分天然有機碳源、氮源、生長因子的基礎(chǔ)上，適當加入一些化學藥品）；,2.依培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來分： 1）固體培養(yǎng)基 A、凝固培養(yǎng)基 ：即遇熱可融化，冷卻后則凝固的固體培養(yǎng)基 B、非可逆性凝固培養(yǎng)基：指有血清凝固成的固體培養(yǎng)基或由無機硅膠配成的凝固后即不能再融化的固體培養(yǎng)基 C、天然固體培養(yǎng)基：由天然固體狀基質(zhì)直接制成的培養(yǎng)基，如麩皮，米糠，木屑等 D、濾膜：是一種堅韌且?guī)в袩o數(shù)微孔的醋酸纖維薄膜，把它制成圓片狀覆蓋在營養(yǎng)瓊脂或浸有培養(yǎng)液的纖維襯墊上，形成了具有固體培養(yǎng)基性質(zhì)的培養(yǎng)條件。,2）半

5、固體培養(yǎng)基 再配置號的液體培養(yǎng)基中加入0.5%左右的瓊脂作為凝固劑，形成的培養(yǎng)基稱之微半固體培養(yǎng)基。 主要用于菌種鑒定，觀察細菌運動特征及噬菌體的效價測定等,3）液體培養(yǎng)基； 培養(yǎng)基中8090%是水。,3.依培養(yǎng)基的用途來分 1）、孢子培養(yǎng)基 2）、種子培養(yǎng)基 3) 、 發(fā)酵培養(yǎng)基 4）、補料培養(yǎng)基 5）、加富培養(yǎng)基 6）、選擇培養(yǎng)基 7）、鑒別培養(yǎng)基 8）、增殖和保存培養(yǎng)基 9）、富集培養(yǎng)基 10）、測定培養(yǎng)基,三、發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇,一）、配置培養(yǎng)基的原則 1、根據(jù)不同微生物的營養(yǎng)需要配置不同的培養(yǎng)基 2、注意各營養(yǎng)物質(zhì)的濃度和配比 3、調(diào)節(jié)適宜的物理化學條件 4、根據(jù)培養(yǎng)微生物的目的配置

6、5、盡量使用廉價易得的原料,1、生態(tài)模擬 2、查閱文獻 3、借助優(yōu)選法或正交試驗法精心設(shè)計培養(yǎng)基配方 4、實驗比較 實驗的規(guī)模一般由定性到定量，由小到大。 發(fā)酵培養(yǎng)基的用途與要求、成分、配比經(jīng)實驗確定，配制時兼顧原料來源、成本及工藝管理；,二）、配置培養(yǎng)基的方法,發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇程序,要了解生產(chǎn)菌種的來源、生活習慣、生理生化特性和一般的營養(yǎng)要求； 對生產(chǎn)菌種的培養(yǎng)條件，生物合成的代謝途徑，代謝產(chǎn)物的化學性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)、一般提煉方法和產(chǎn)品質(zhì)量要求等要有所了解 應先以合成培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，先進行搖瓶試驗，再進行小型發(fā)酵罐培養(yǎng)，探索此生產(chǎn)菌種對各種主要有機碳源和氮源的利用情況和產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的能力,要注意

7、培養(yǎng)過程中的pH值變化，比較適于菌體生長繁殖和適合于代謝產(chǎn)物形成的pH值差異，不斷調(diào)整 在初步研究的基礎(chǔ)之上，先確立一個培養(yǎng)基配比；再進行各種重要的金屬和非金屬離子的影響試驗，試驗各種無機鹽的最高、最低和最合的用量 在合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，進行復合培養(yǎng)基試驗，探討各種發(fā)酵條件和培養(yǎng)基的關(guān)系。 如培養(yǎng)過程中的pH值變化與培養(yǎng)基各種組成的關(guān)系。,四、原料轉(zhuǎn)換及意義,1、節(jié)約原料，減低單耗，提高發(fā)酵單位和總收率； 2、開拓新的原料資源和微生物資源：野生植物淀粉、植物纖維、木屑水解物、石蠟、醋酸、乙醇,日本 1959年開始研究由醋酸發(fā)酵生成谷氨酸的工藝，并于1968年由味之素公司設(shè)廠制造，為發(fā)酵法制造谷

8、氨酸由“糧食發(fā)酵”轉(zhuǎn)入“無糧發(fā)酵”奠定了基礎(chǔ)。,谷氨酸發(fā)酵原料：最初用葡萄糖，以后改用淀粉水解糖液或薯粉水解糖液，產(chǎn)糖地區(qū)則采用價格低廉的糖蜜為原料,隨著石油化工的發(fā)展，合成醋酸和乙醇的產(chǎn)量逐年增加，醋酸和乙醇作為一種新型發(fā)酵原料，越來越受到重視。近年來，國外乙醇代糧發(fā)酵的研究取得了重大進展，除抗生素外，幾乎所有用糧食發(fā)酵生產(chǎn)的產(chǎn)品，如氨基酸、有機酸、酶制劑、單細胞蛋白、糖類、脂肪、維生素、核酸類物質(zhì)等，都可以用乙醇為碳源發(fā)酵生產(chǎn)。,第二節(jié) 淀粉水解糖的制備,一、淀粉水解糖的制備方法 1、酸解法： 定義：以酸（無機酸或有機酸）為催化劑，在高溫高壓下將淀粉水解為葡萄糖的方法. 優(yōu)點：設(shè)備要求簡單

9、，水解時間短（20min），設(shè)備生產(chǎn)能力大 缺點：高溫高壓下進行，設(shè)備要求耐腐蝕、耐高溫、耐高壓，副反應多，對原料要求嚴格，淀粉顆粒不宜過大，淀粉乳濃度不能過高。,2、酶解法：（雙酶水解法） 定義：用淀粉酶將淀粉水解為葡萄糖的過程。一般分為兩步：第一步是利用淀粉酶將淀粉液化轉(zhuǎn)為糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加，這個過程稱為液化。第二步是利用糖化酶將糊精或低聚糖進一步水解，轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟堑倪^程，稱為糖化。也稱雙酶法,-淀粉酶（液化） 葡萄糖淀粉酶（糖化） 優(yōu)點：1、反應條件溫和。 2、酶的專一性強，副反應少 3、可在較高的淀粉乳濃度下水解 4、糖液的營養(yǎng)物質(zhì)豐富 5、糖液色澤淺，無苦味，有利于糖液

10、的精制 缺點：時間長（23）天，要求的設(shè)備多，糖液過濾困難。,3、酸酶結(jié)合法 酸酶法 酶酸法,1) 酸酶法,事先將淀粉酸水解成糊精或低聚糖，然后再用糖化酶將其水解為葡萄糖 玉米、小麥等谷類淀粉，淀粉顆粒堅實，如用淀粉酶在短時間內(nèi)液化往往不徹底。 酸液化速度快，且糖化是由酶來進行的，對液化液要求不高，可采用較高的淀粉乳濃度，提高生產(chǎn)效率。 用酸量較少，產(chǎn)品顏色淺，糖液質(zhì)量高。,2) 酶酸法,先用淀粉酶液化到一定程度，然后用酸水解成葡萄糖 有些原料（如碎米淀粉），顆粒大小不一，酸法水解不均勻，出糖率低，故采用先經(jīng)淀粉酶液化，過濾除雜質(zhì)后再酸水解 能采用粗原料淀粉，淀粉濃度較酸法高，生產(chǎn)較易控制，時

11、間短。而且酸水解pH稍高，可減少副產(chǎn)物的形成，糖液色澤較淺。,表2-2 不同糖化工藝糖化質(zhì)量比較,二、淀粉酸水解理論基礎(chǔ),淀粉水解成葡萄糖的反應過程中同時發(fā)生著：水解反應、復合反應、分解反應；其中水解反應是主要的。 復合反應：葡萄糖分子間經(jīng)1-6糖苷鍵結(jié)合成龍膽二糖（有苦味）、異麥芽糖和其他低聚糖（合稱復合低聚糖）。 分解反應：葡萄糖 羥甲基糠醛 有機酸、色素等,淀粉的水解反應,1.淀粉水解過程 顏色變化：藍色 暗紫 紫 紅褐 暗紅 紅 淺紅,水解總趨勢: 淀粉糊精低聚糖葡萄糖; 其中葡萄糖單位30-35時遇碘變藍,隨著聚合度的降低,呈現(xiàn)上述顏色變化,2、淀粉酸水解反應動力學,屬于單分子一級反

12、應類型： K：反應速度常數(shù)，由反應條件（如溫度、酸度等）而定 C：淀粉濃度,濃度對時間求導，濃度的降低,3、影響酸水解的因素 酸的種類 主要因素 濃度（酸的濃度、淀粉的濃度） 水解溫度,（二）、葡萄糖的復合反應及其影響因素 復合反應：在淀粉的酸糖化過程中，水解生成的葡萄糖受酸和熱的影響，葡萄糖分子之間通過糖苷鍵相聚合，生成二糖、三糖及其他低聚糖。,影響復合反應的因素： 1、淀粉濃度的影響（用DE值表示葡萄糖純度）： DE值還原糖/干物質(zhì)100 2.、酸的影響：,（三）葡萄糖的分解反應及其影響因素,葡萄糖 5-羥甲基糠醛 乙酰丙酸、蟻酸、有色素物質(zhì)； 影響因素：濃度、溫度、pH值；,第三節(jié) 糖蜜

13、前處理,一、糖蜜的來源與特點 糖蜜的干物質(zhì)濃度很高，約8090Bx，含糖量在50%以上，另含5%12%的膠體物質(zhì)和10%12%灰分，此外產(chǎn)酸細菌多，某些糖蜜還含有較多的生物素。如不進行預處理，則微生物難于生長和發(fā)酵。近年來，由于制糖技術(shù)提高，糖蜜中糖的含量大大降低，可發(fā)酵性糖減少，非發(fā)酵性糖增加，膠體物質(zhì)和灰分也顯著增加，因此，糖蜜發(fā)酵前必須進行預處理。,一、糖蜜的來源與特點 二、糖蜜前處理的方法 1、加酸通風沉淀法（冷酸通風處理法）：糖蜜加水稀釋到500Bx 加入0.20.3濃硫酸，通入壓縮空氣1h 靜置澄清8h，取上清液。,2、加熱加酸沉淀法（熱酸通風沉淀法）： 糖蜜加水稀釋到40 加適量

14、硫酸調(diào)節(jié)pH值到44.5 放入澄清槽加熱至8090，通風30min 保溫 7080 812 小時，取上清液。,3、添加絮凝劑澄清處理法： 糖蜜稀釋至3040 Bx 加硫酸調(diào)pH 33.8 加熱至90 添加8ppm聚丙烯酰胺（PAM），攪拌均勻 靜置1小時，取上清液。,三、谷氨酸發(fā)酵糖蜜預處理,1.糖蜜預處理法 活性炭處理法 樹脂處理法 亞硝酸處理法 2.添加化學藥劑處理法 添加青霉素法 添加表面活性劑 添加抗氧劑法 3.追加糖蜜法 4. 營養(yǎng)缺陷型變異株法,第四節(jié) 其他原料的處理,一、纖維素及發(fā)酵廢液的處理 （一）、利用纖維素廢料生產(chǎn)SCP 稻草、麥稈、玉米的莖和葉、甘蔗渣、廢紙等 流程如下：

15、,纖維原料,粉碎,水解,中和,澄清,過濾,發(fā)酵罐培養(yǎng),分離,廢液,種子,營養(yǎng)鹽,菌體,濃縮,磨碎,干燥,成品,（二）利用檸檬酸中和濾液生產(chǎn)酵母,酵母菌種,斜面,一級種子,二級種子,離心分離,中和廢液,鹽酸調(diào)pH3.5,發(fā)酵,干燥,粉碎,包裝,二次廢液,用于發(fā)酵培養(yǎng)基 的配置等,二、亞硫酸鹽廢液的處理 （一）亞硫酸鹽制漿廢液生產(chǎn)酒精和蛋白質(zhì) 1、亞硫酸鹽造紙制漿廢液生產(chǎn)酒精 2、亞硫酸鹽紙漿廢液發(fā)酵生產(chǎn)蛋白質(zhì) 3、亞硫酸銨法非木材制漿廢液培養(yǎng)SCP （二）亞硫酸鹽廢液發(fā)酵生產(chǎn)乳酸 三、木屑水解液發(fā)酵生產(chǎn)衣康酸,第五節(jié) 培養(yǎng)基滅菌,一、消毒與滅菌在發(fā)酵工業(yè)中的應用 消毒：指用物理和化學方法殺死物料

16、、容器、器具內(nèi)外的病源微生物。一般只能殺死營養(yǎng)細胞而不能殺死細菌芽孢。 滅菌：用物理或化學方法殺死或除去環(huán)境中所有微生物，包括營養(yǎng)細胞、細菌芽孢和孢子。 消滅雜菌和防止雜菌污染,二、滅菌方法：干熱滅菌、濕熱滅菌、物理滅菌（射線、微波等）、化學滅菌（各種化學藥品）； 1、干熱滅菌法 灼燒滅菌、在電熱或紅外線在設(shè)備內(nèi)加熱 主要用于保持干燥的物料、器具等,2、濕熱滅菌法 借助蒸汽釋放的熱使微生物細胞中的蛋白質(zhì)、酶和核酸分子內(nèi)部的化學鍵，特別是氫鍵受到破壞，引起不可逆的變性，使微生物死亡。 優(yōu)點：1）蒸汽來源容易，操作費用低廉，本身無毒 2)蒸汽具有很強的穿透力，滅菌易于徹底 3）蒸汽均有很大的潛熱，

17、冷凝后的水分有利于濕熱滅菌 4）蒸汽輸送可借助本身的壓強，調(diào)節(jié)方便，技術(shù)管理容易 缺點：1)設(shè)備費用高 2）不能用于怕受潮的物料滅菌,3、射線滅菌 紫外線、高速電子流的陰極射線、X射線和Y射線 化學藥品滅菌法 （1）第一大類：表面消毒劑 高錳酸鉀溶液：0.10.25%、漂白粉 、75的酒精、新潔爾滅和杜滅芬、甲醛 37、戊二醛、過氧乙酸、焦碳酸二乙酯、酚類,（2）第二大類：抗代謝藥物 化學結(jié)構(gòu)與微生物必須的代謝物類似 例如：磺胺類化合物取代氨基苯甲酸 （3）第三大類：抗生素,三、加熱滅菌的原理,1.、微生物的熱阻：微生物對熱的抵抗力； 致死溫度、致死時間 2、微生物的熱致死動力學：對數(shù)殘留定律

18、,一級反應： 用N表示殘留活菌個數(shù)，則活菌的減少率（死亡率），與N呈線性關(guān)系，即： 式中，K是反應速度常數(shù)，對滅菌來講，是活菌的比熱致死速率常數(shù)，單位是min-1 ，其值與菌的種類和加熱溫度有關(guān)，需通過實驗才能測定。,積分邊界條件：N0N；t0=0,式中， 滅菌時間（s）； N0 滅菌開始時，培養(yǎng)基中雜菌個數(shù)（個）； N 經(jīng)過滅菌時間后，殘存的活菌數(shù)（個）。,3、熱致死反應的速度常數(shù)K K是表達微生物耐熱性的特征常數(shù) ，與微生物的種類和滅菌溫度有關(guān)。K越小，微生物越耐熱,4、滅菌溫度的選擇 式中 E為菌體死滅反應的活化能（J/mol），它是菌體死滅反應的特征常數(shù)，所以，不同菌其熱死滅反應的E不

19、同。,四、影響培養(yǎng)基滅菌的其他因素,培養(yǎng)基成分、pH值、培養(yǎng)基中的顆粒、泡沫,五、分批滅菌與連續(xù)滅菌,一）、分批滅菌的操作過程（實罐滅菌） 1）培養(yǎng)基的預熱 培養(yǎng)基先加熱到8090，然后再導入蒸汽升溫到120180。 目的：1）防止直接導入蒸汽時由于培養(yǎng)基與蒸汽的溫度過大而產(chǎn)生大量的冷凝水使培養(yǎng)基稀釋 2）防止直接導入蒸汽所造成的泡沫急劇上升而引起的物料外溢。 方法：先將排氣閥打開,2）培養(yǎng)基滅菌 從各路通入蒸汽（進氣口、排料口、取樣口），溫度升到120130，保溫30min,2、分批滅菌的注意事項 1）各路蒸汽進口要暢通，防止短路逆流；罐內(nèi)液體翻動要劇烈，以使罐內(nèi)物料達到均一的滅菌溫度。 2）排氣量不宜過大，以節(jié)約蒸汽 3）滅菌將要結(jié)束時，應立即引入無菌空氣以保持罐壓，然后開夾套或蛇管冷卻，以避免罐壓迅速下降產(chǎn)生負壓而吸入外界空氣，或引起發(fā)酵罐破壞。 4）在引入無菌空氣前，罐內(nèi)壓力必須低于過濾器壓力，否則培養(yǎng)基將倒流入過濾器。,二）、連續(xù)滅菌： 1、連續(xù)滅菌優(yōu)點： 1）可以采用高溫短時滅菌； 2）發(fā)酵罐利用率高； 3）蒸汽負荷均衡； 4）熱效率高； 5）可采用自動控制，降低