基因工程制藥.ppt

1、基因工程制藥 Chapter 4 Gene Engineering for Pharmacon 基因工程:是通過對Nucleic acid 分子的Insert, Assemble and Recombinant而實現(xiàn)遺傳物質(zhì)（germ plasm）的重新組合，再借助Virus ,Bacterium ,Plasmid or other Vectors,將Target gene轉(zhuǎn)移到新的 Host Cell System,并使Target Gene在新的Host cell system 進行Replication and Expression的技術。 基因工程主要研究任務:Gene isolati

2、on ,synthesis , Incision(切割),recombinant ,transformation and expression. Gene Manipulation/Gene cloning/DNA recombination. 基因工程技術最成功的成就:用于新型生物技術藥物的研制, 基因工程技術的主要工具: * Tool enzyme 工具酶:restriction enzyme, ligase, repair. * Nucleic acid and protein sequence:Basis for gene analyze and synthesis. * Transf

3、er vector: gene transfer * Expression vector: Manufacture plant for gene replication and expression target products. Good Vectors: Ecol. ,- High efficiency expression but glycoprotein Beer yeast , mammalian cell -glycoprotein, 傳統(tǒng)制藥存在的問題： A、材料來源困難或制造技術問題而無法付諸應用； B、從動物臟器中提取出來，也因造價太高，或因來 源困難而供不應求； C、由于

4、免疫抗原等緣故，使它們在使用上受到限制。 基因工程技術的特點：就是能夠十分方便有效地生 產(chǎn)許多以往難以大量獲取的生物活性物質(zhì)，甚至可 以創(chuàng)造出自然界中不存在的全新物質(zhì)。,基因工程技術的應用特點： A、為癌種、病毒性疾病、心血管疾病和內(nèi)分泌疾病的預防、治療和診斷提供新型疫苗、新型藥物和新型診斷試劑。 B、基因工程技術的最大好處在于它能從極端復雜的機體細胞內(nèi)取出所需要的基因，將其在體外進行剪切拼接、重新組合，然后轉(zhuǎn)入適當?shù)募毎M行表達，從而生產(chǎn)出比原來多數(shù)百、數(shù)千倍的相應的蛋白質(zhì)。,基因工程技術生產(chǎn)藥品的優(yōu)點： a. 可大量生產(chǎn)過去難以獲得的生理活性多肽和蛋白質(zhì)，為 臨床使用提供有效的保障； b.

5、 可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)，以便對其生理生化 和結構進行深入的研究，從而擴大這些物質(zhì)的應用范圍； c. 利用基因工程技術可以發(fā)現(xiàn)、挖掘更多的內(nèi)源性生理活性 物質(zhì)；？ d. 內(nèi)源性生理活性物質(zhì)在作為藥物使用時存在的不足之處， 可以通過基因工程和蛋白質(zhì)工程進行改造；？ e. 利用基因工程技術可獲得新型化合物，擴大藥物篩選來 源。,基因工程的誕生與及其相關學科的關系,“863”高技術計劃在生物技術領域研究的三個主題之一是：新型藥物、疫苗和基因治療，重點是利用現(xiàn)代生物技術手段，開發(fā)化學合成法難以生產(chǎn)的藥品。,“十五”期間，863計劃選擇了信息技術、生物和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術、新材料、先進制造與自動化技術

6、、能源技術、資源環(huán)境技術等6個高技術領域 。,基因工程藥物的生產(chǎn)分為上游和下游兩個階段： 上游階段：主要是分離目的基因、構建工程菌(細胞)。目的基因獲得后，最主要的就是目的基因的表達。選擇基因表達系統(tǒng)主要考慮的是保證表達的蛋白質(zhì)的功能，其次是表達的量和分離純化的難易。 此階段的工作主要在實驗室內(nèi)完成。 下游階段：從工程菌的大量培養(yǎng)一直到產(chǎn)品的分離純化和質(zhì)量控制。此階段是將實驗室的成果產(chǎn)業(yè)化、商品化，主要包括工程菌大規(guī)模發(fā)酵最佳參數(shù)的確立，新型生物反應器的研制，高效分離介質(zhì)及裝置的開發(fā)，分離純化的優(yōu)化控制，高純度產(chǎn)品的制備技術，生物傳感器等一系列儀器儀表的設計和制造，電子計算機的優(yōu)化控制等。,基

7、因工程藥物生產(chǎn)的基本過程,基因工程藥物的上游技術： 1、基因克隆載體:質(zhì)粒載體， 2、重組DNA技術的有關工具酶及其應用 3、核酸制備技術：制備純凈、高質(zhì)量的 載體DNA和待克隆的 核酸，才能有效地進行后續(xù)的酶切、反轉(zhuǎn)錄、連接等分子克隆操作。 1）用堿抽提法分離質(zhì)粒DNA 原理：細胞pH12.0-12.6線狀DNA變性，cccDNA不變性，加酸恢復pH到中性，變性的染色體DNA交織成網(wǎng)而沉淀，上清用酚處理使蛋白變性，用醇沉淀質(zhì)粒DNA。 A）質(zhì)粒DNA的小量制備 B）質(zhì)粒DNA的大量制備,2）染色體DNA的制備 3）真核細胞RNA的制備 DNA的凝膠(Agarose)電泳和 凝膠中DNA的 回

8、收 5) SDS-PAGE電泳和 凝膠中DNA的 回收,第一節(jié) 目的基因的獲得,問題：來源于真核細胞的產(chǎn)生基因工程藥物的目的基因，為什么不能進行直接分離？ 目的基因的獲取途徑： 一、逆轉(zhuǎn)錄法 逆轉(zhuǎn)錄法就是分離純化目的基因的mRNA，再反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進行cDNA 克隆表達。 1、mRNA purification a.細胞內(nèi)RNA的組成和含量: DNA:95%核內(nèi)，5細胞器 RNA：75細胞質(zhì)，10%核內(nèi)，15%細胞器 rRNA80-85%;tRNA10-15%;mRNA1-5% b.真核細胞mRNA 的特點及分離純化方法。 3-polyA（20-250AAA）-oligo(dT),纖維

9、素柱純化Poly(A)mRNA 流程圖,2、cDNA第一鏈的合成：一次好的逆轉(zhuǎn)錄反應可使 oligo(dT)選出的mRNA有530%被拷貝。 3、cDNA第二鏈的合成： 4、cDNA cloning：expression vector pUC 5、將重組體導入host cell 6、cDNA library identification 7、目的cDNA 克隆的分離和鑒定 （限制酶圖譜的繪制、雜交分析、基因定位、基因測序、確定基因的 轉(zhuǎn)錄方向、轉(zhuǎn)錄起始點等。）,二、化學合成法 較小的蛋白質(zhì)和多肽的編碼基因可以用人工化學合成法獲得?；瘜W合成法有個先決條件是：必須知道目的基因的核苷酸排列順序，或知

10、道目的蛋白質(zhì)的氨基酸順序，再按相應的密碼子推導出DNA的堿基系列。 方法：合成目的基因DNA不同部位的兩條鏈的寡核苷酸短片段，再退火成為兩端形成粘性末端的DNA雙鏈片段，然后將這些雙鏈片段按正確的次序進行退火連接成較長的DNA片段，再用連接酶連接成完整的基因。,人工化學合成基因的限制： a. 不能合成太長的基因。最長50-60bp.只適用于克隆小分子肽的基因。 b. 人工合成基因時，遺傳密碼的簡并會為選擇密碼子帶來很大困難， 如用氨基酸順序推測核苷酸序列，得到的結果可能與天然基因不完 全一致，易造成中性突變。 c. 費用太高。,第二節(jié) 基因表達 克隆蛋白質(zhì)藥物基因的一個主要目的使為了高效的表達

11、該基因，從而大量地市場原本難以獲得的藥物。 基因表達是指結構基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過程?；蚋咝П磉_研究是指外源基因在某種細胞中的表達活動，即剪切下一個外源基因片段，拼接到另一個基因表達體系中，使其能獲得既有原生物活性又可高產(chǎn)的表達產(chǎn)物。 進行基因表達研究的主要問題是目的基因的表達產(chǎn)量、表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性、產(chǎn)物的生物學活性和表達產(chǎn)物的分離純化。因此，建立最佳的基因表達體系，是基因表達設計的關鍵。,GST-T10 Fusion Protein Expression,Fig.2 GST-T10 fusion protein expressed in BL21 induced with

12、 1mM IPTG. Lane 1: Mr; Lane 2: Negative control; Lane 3: expressed GST-T10 fusion protein .,以Fusion Protein的形式表達藥物基因 許多蛋白質(zhì)藥物與原核生物的蛋白質(zhì)融合后，能保留原有的免疫原性。一些免疫原性弱的多肽制成融合蛋白，其免疫原性能得到加強。用這種融合蛋白免疫動物所制備的抗體，能夠用于檢測原來的多肽藥物，也可用于藥代動力學研究，藥物受體研究以及藥物產(chǎn)品的檢測。 有些情況下，采用融合蛋白的形式表達外源基因是不得以而為之。一些多肽藥物在原核細胞中不穩(wěn)定，難以獲得高表達。這些蛋白與菌體蛋白融

13、合后得到穩(wěn)定，但融合蛋白需經(jīng)過后處理才能釋放出有活性的外源多肽。 多肽藥物的純化通常較為困難，但與特定的原核蛋白融合后，不僅能穩(wěn)定所表達的產(chǎn)物，還能用識別蛋白的配體進行親和層析純化。如GST-融合基因，所產(chǎn)生的融合蛋白可用谷胱甘肽親和柱一次性純化。,一、宿主細胞的選擇 宿主細胞的基本要求： 容易獲得較高濃度的細胞； 能利用易得廉價原料； 不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素； 發(fā)熱量低，需氧低，適當?shù)陌l(fā)酵溫度和細胞形態(tài)； 容易進行代謝調(diào)控； 容易進行DNA技術操作； 產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高，且易提取純化。,宿主細胞的 分類： 原核細胞，常用的有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈 霉菌等； 真核細胞，常用的有酵母、絲狀真菌

14、、哺乳動物細 胞。 1、原核細胞 （1）大腸桿菌：表達產(chǎn)物的形式：細胞內(nèi)不溶性表達（包含體）、胞內(nèi)可溶性表達、細胞周質(zhì)表達，極少還可分泌到胞外表達。不同的表達形式具有不同的表達水平，且會帶來完全不同的雜質(zhì)。,特點: A、大腸桿菌中的表達不存在信號肽，故產(chǎn)品多為胞內(nèi) 產(chǎn)物，提 取時需破碎細胞，此時細胞質(zhì)內(nèi)其他蛋白 也釋放出來，因而造成提取困難。 B、由于分泌能力不足，真核蛋白質(zhì)常形成不溶性的 包含體(inclusion body)，表達產(chǎn)物必須在下游處理 過程中經(jīng)過變性和復姓處理才能恢復其生物活性。,C、在大腸桿菌中表達不存在翻譯后修飾作用，故對蛋白質(zhì)產(chǎn)物不能糖基化，因此，只適于表達不經(jīng)糖基化等

15、翻譯后修飾仍具有生物功能的真核蛋白質(zhì)，在應用上受到一定的限制。 由于翻譯常從甲硫氨酸的AUG密碼子開始，故目的蛋白質(zhì)的N端常多余一個甲硫氨酸殘基，容易引起免疫反應。大腸桿菌會產(chǎn)生很難除去的內(nèi)毒素，還會產(chǎn)生蛋白酶而破壞目的蛋白質(zhì)。,（2）枯草芽孢桿菌：分泌能力強，可將蛋白質(zhì)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中，不形成包含體。該菌也不能使蛋白質(zhì)糖基化，另外由于它有很強的胞外蛋白酶，會對產(chǎn)物進行不同程度的降解，因此，它的應用也受到限制。 （3）鏈霉菌：重要的工業(yè)微生物。特點是不致病、使用安全，分泌能力強，可將表達產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中，具有糖基化能力，可做理想的受體菌。,2、真核細胞 （1）酵母：繁殖迅速，可廉價

16、的大規(guī)模培養(yǎng)，而且沒有毒性，基因工程操作與原核生物相似，表達產(chǎn)物直接分泌到細胞外，簡化了分離純化工藝。表達產(chǎn)物能糖基化。特別是某些在細菌系統(tǒng)中表達不良的真核基因，在酵母中表達良好。目前以釀酒酵母應用最多。干擾素和乙肝表面抗原已獲成功。 （2）絲狀真菌：很強的分泌能力；能正確進行翻譯后加工，包括肽剪切和糖基化；而且糖基化方式與高等真核生物相似；絲狀真菌（如曲霉）被確認是安全菌珠，有成熟的發(fā)酵和后處理工藝。,（3）哺乳動物細胞：由于外源基因的表達產(chǎn)物可由重組轉(zhuǎn)化的細胞分泌到培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液成分完全由人控制，從而是產(chǎn)物純化變得容易。產(chǎn)物是糖基化的，接近或 類似于天然產(chǎn)物。 但動物細胞生產(chǎn)慢，生產(chǎn)率低

17、，而且培養(yǎng)條件苛刻，費用高，培養(yǎng)液濃度較稀。 雖然從理論上講，各種微生物都可以用于基因表達，但由于克隆載體、DNA導入方法以及遺傳背景等方面的限制，目前使用最廣泛的宿主菌仍然是大腸桿菌和釀酒酵母。,二、大腸桿菌中的基因表達 1、載體：表達載體必須具備的條件 （1）載體能夠獨立的復制； （2）具有靈活的克隆位點和方便的篩選標記。且克隆位點應在啟動子序列后， 以使克隆的外源基因得以表達； （3）具有很強的Promoter，能為大腸桿菌的RNA聚合酶所識別； （4）具有Repressor，使啟動子受到控制，只有當誘導時才能進行轉(zhuǎn)錄；,（5）具有很強的終止子，以便使RNA聚合酶集中力量轉(zhuǎn)錄克隆的外源基

18、因， 而不轉(zhuǎn)錄無關的基因。 （6）所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號，即起始密碼AUG和SD序列， 以便轉(zhuǎn)錄后能順利翻譯。 實例：pBV220系統(tǒng) 中國預防醫(yī)學科學院病毒學研究所構建。已成功的用于表達 IL-2/3/4/6/8、 TFN、TNF、TNF、 G-CSF、 GM-CSF等細胞因子。 問題:阻遏子repressor的阻遏作用對host cell有何影響？對foreign gene的表達有無影響？,2、影響目的基因在大腸桿菌中表達的因素 外源基因的表達產(chǎn)量-單位體積產(chǎn)量-細胞濃度和每個細胞平均表達產(chǎn)量呈正相關。細胞濃度與生長速率、外源基因拷貝數(shù)和表達產(chǎn)物產(chǎn)量之間存在著一個動態(tài)平衡，

19、只有保持最佳的動態(tài)平衡才能獲得最高產(chǎn)量；單個細胞的產(chǎn)量又與外源基因的拷貝數(shù)、基因表達效率、表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性和細胞代謝負荷等因素有關。因此必須從以下因素入手，尋找提高外源基因表達效率的有效途徑：,（1）外源基因的拷貝數(shù)：與載體在宿主中的拷貝數(shù)直接 相關。 （2）外源基因的表達效率：啟動子的強弱，SD序列和 ATG的間距等。 A、啟動子的強弱：目的基因插入表達載體啟動子的 下游，可增加基因的表達。lac、trp、 tac、 bla。 B、核糖體結合位點的有效性 C、SD與ATG的間距：影響非融合蛋白的合成水平 D、密碼子組成：設計引物或合成基因時選擇大腸桿 菌“偏愛”的密碼子；,（3）表達產(chǎn)物的穩(wěn)

20、定性：組建融合蛋白；利用信號肽； 特異性突變；位點特異突變，改變二硫鍵位置；宿主 蛋白酶缺陷 （4）細胞的代謝負荷：擬制外源基因的表達；宿主細胞 的生長與重組質(zhì)粒的復制分開； （5）工程菌的培養(yǎng)條件：host-Vector -cloning gene,3、真核基因在大腸桿菌中的表達方式 （1）以融合蛋白的形式表達藥物基因：融合蛋白氨基端是原核序列，羧基端是真核序列。優(yōu)點：操作簡便，蛋白質(zhì)在菌體內(nèi)比較穩(wěn)定；易高效表達；但只能做抗原。? 一般不做人體注射用藥。 （2）以非融合蛋白的形式表達藥物基因：易被蛋白酶破壞；N端有甲硫氨酸，易引起免疫反應。 OP:P-SD-ATG-St.gene-Stop

21、C. （3）分泌型表達蛋白藥物基因：外源基因融合到原核蛋白信號肽序列的下游。,三、酵母中的基因表達 1、載體 酵母載體是可以攜帶外源基因在酵母細胞內(nèi)保存和復制，并隨酵母分裂傳遞到子代細胞的 DNA或RNA。 A) Yep類（Yeast episomal plasmid） B) YRp 類(Yeast replication plasmid) C) YC p 類(yeast centromeric plasmid)：復制序列為ARS，并含有酵母染色體中心粒、端粒成分，穩(wěn)定性好，但拷貝數(shù)只有一個，轉(zhuǎn)化頻率103104/g DNA。 D) YI p(yeast integrative plasmid

22、):含有可與酵母染色體重組的序列，可以完全整合到染色體中。因此它依靠酵母染色體進行復制，具有很好的穩(wěn)定性。拷貝數(shù)只一個，轉(zhuǎn)化頻率1100 / g DNA。,（2）克隆載體 向酵母載體中引入大腸桿菌質(zhì)粒pBR322的ori 部分和Ampr 或Tetr 部分，這樣構成的載體同時帶有細菌和酵母的復制原點和選擇標記。 （3）表達載體 將酵母菌的啟動子和終止子等有關控制序列引入載體的適當位點后，就構成了酵母菌的表達載體。分普通表達載體和精確表達載體。,2、影響目的基因在酵母菌中表達的因素 （1）外源基因的拷貝數(shù)：高度穩(wěn)定、高拷貝-高表達 （2）外源基因的表達效率：啟動子 （3）外源蛋白的糖基化：酵母分泌

23、的異源蛋白糖基化產(chǎn)物與天然產(chǎn)物完全相同。 （4）宿主菌珠的影響：菌體生長力強；菌體內(nèi)源蛋白酶要弱；菌株性能穩(wěn)定；分泌能力強。,四、動物細胞中的基因表達 外源基因的表達產(chǎn)物可由重組轉(zhuǎn)化的細胞分泌到培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液成分完全由人工控制，從而使產(chǎn)物純化變得容易?；虍a(chǎn)物是糖基化的，接近或類似于天然產(chǎn)物。 但動物細胞生長慢，單位體積的生產(chǎn)率低，培養(yǎng)條件苛刻，費用高。目前用于表達外源基因的細胞均為傳代細胞。,三類主要基因工程表達體系的比較 表達體系 產(chǎn) 物 產(chǎn)生部位 培養(yǎng)方式 提純 產(chǎn)物活性 淺在危險 大腸桿菌 多肽、蛋白 菌體內(nèi) 容易 一般 對原核好 不大 融合蛋白 部分可高產(chǎn) 酵 母 多肽、蛋白 菌體

24、內(nèi) 容易 菌體內(nèi) 真核接近 不大 糖基化蛋白 分泌出細胞 可高產(chǎn) 復雜 天然 動物細胞 完整 分泌出細胞 較難 簡單 幾乎可為 可能有 糖基化蛋白 成本高 天然產(chǎn)物 致癌因 可高產(chǎn) 素,第三節(jié) 基因工程菌的穩(wěn)定性（stability） 一、質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生的原因 分裂不穩(wěn)定：指工程菌分裂時出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒子代菌的現(xiàn)象。(常見) 結構不穩(wěn)定：指外源基因從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變。 工程菌的質(zhì)粒不穩(wěn)定因素： 一 是含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率； 二是這兩種菌的比生長速率差異的大小。,對同一工程菌，通過控制不同的比生長速率可以改變質(zhì)粒的拷貝數(shù)：含低拷貝質(zhì)粒的工程菌產(chǎn)生不含

25、質(zhì)粒子代菌的頻率較大，增加質(zhì)?？截悢?shù)能提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性； 含高拷貝質(zhì)粒的工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率較低，但是大量外源質(zhì)粒的存在使含質(zhì)粒菌的工程菌的比生長速率明顯低于不含質(zhì)粒菌，而不含質(zhì)粒菌一旦產(chǎn)生，能較快地取代含質(zhì)粒菌而成為優(yōu)勢菌，對質(zhì)粒的穩(wěn)定性不利。 質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法： 樣品稀釋-涂板-10-12h-挑選100個菌落-接種抗性標記的平版-10-12h-統(tǒng)計菌落數(shù)計算%,二、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法 1、兩階段培養(yǎng)法：第一階段使菌體生長至一定密度，第二階段誘導外源基因的表達。在培養(yǎng)基中加入選擇性壓力如抗生素等，以抑制質(zhì)粒丟 失菌的生長。 2、通過控制環(huán)境參數(shù)（溫度、PH、培養(yǎng)基組分和溶解氧

26、濃度），調(diào)節(jié)比 生長速率，使工程菌生長具有優(yōu)勢。有些含質(zhì)粒的菌對發(fā)酵環(huán)境的改變 比不含質(zhì)粒的菌反應慢，因而間歇改變培養(yǎng)條件以改變這兩種菌的比 生長速率，可以改善質(zhì)粒的穩(wěn)定性。,第四節(jié) 基因工程菌的發(fā)酵 工程菌的培養(yǎng)過程：搖瓶操作（溫度、pH、培養(yǎng)基組分、碳氮比）； 培養(yǎng)罐操作（確定培養(yǎng)參數(shù)、控制方案、順序） 一、基因工程菌的培養(yǎng)方式 1、補料分批培養(yǎng)：將種子接入發(fā)酵反應器中進行培養(yǎng)，經(jīng)過一段時間后，間歇或 連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進一步生長的方法。通常把溶氧控制與流加補料結合起來進行。,2、連續(xù)培養(yǎng)：將種子接入發(fā)酵反應器中，攪拌培養(yǎng)至一定菌體濃度后，開動進料和出料的蠕動泵，以控制一定稀釋率

27、進行不間斷的培養(yǎng)。 3、透析培養(yǎng)：利用膜的半透性原理使代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基分離，通過去處培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物來解除其對生產(chǎn)菌的不利影響。 4、固定化培養(yǎng)：將固定化技術用于工程菌的培養(yǎng)，質(zhì)粒穩(wěn)定性大大提高，特別是對分泌型菌種。,二、基因工程菌的發(fā)酵工藝 基因工程菌的發(fā)酵工藝 傳統(tǒng)微生物發(fā)酵工藝 材料 帶外源基因重組載體的微生物 不含外源基因的微生物 目的 使外源基因高效表達，盡量減少 自身基因表達所產(chǎn)生的 宿主本身蛋白的污染 初級或次極代謝產(chǎn)物 1、培養(yǎng)基的影響 使用不同的碳源對菌體的生長和外源基因的表達有較大的影響。如以甘油為碳源，菌體得率較大，而以葡萄糖為碳源菌體產(chǎn)生的副產(chǎn)物較多。葡萄糖對lac啟

28、動子有阻遏作用,采用流加措施,控制培養(yǎng)液中葡萄糖的較低濃度,可減弱或消除葡萄糖的阻遏作用。還有無機磷對產(chǎn)物的影響也較大。,碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。 氮源：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米漿和氨 水、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨等 。 其他：無機鹽、微量元素維生素、生物素等。 2、接種量的影響 接種量是指移入的種子液體積和培養(yǎng)液體積的比例。它的大小影響發(fā)酵的產(chǎn)量和發(fā)酵周期。接種量小，延長菌體延遲期，不利于外源基因的表達，采用大接種量，由于種子液中含有大量水解酶，有利于對基質(zhì)的利用，但接種量過大往往會使菌體生長過快，代謝產(chǎn)物積累過多，反而會抑制后期菌體的生長。,3、溫度的影響 溫

29、度對基因表達的調(diào)控作用可發(fā)生在復制、轉(zhuǎn)錄、翻譯或小分子的合成水平上。 4、溶解氧的影響 溶解氧是發(fā)酵培養(yǎng)中影響菌體代謝的一個重要參數(shù)，對菌體的生長和產(chǎn)物的生成影響很大。維持較高水平的DO2值（40%）有利于重組質(zhì)粒細胞的生長及外源蛋白產(chǎn)物的形成。,5、誘導時機的影響 一般在對數(shù)生長期或?qū)?shù)生長后期進行升溫誘導表達。 6、pH的影響 如采用兩段培養(yǎng)工藝，培養(yǎng)前期著重于優(yōu)化工程菌的最佳生長條件，培養(yǎng)后期著重于優(yōu)化外源蛋白的表達條件。細胞生長期的最佳pH范圍在6.8-7.4，外源蛋白表達的最佳pH為6.0-6.5。,總之，工程菌發(fā)酵工藝的優(yōu)化對異源蛋白的表達關系重大，必須建立最佳化工藝。最佳化工藝是

30、獲得最快周期、最高產(chǎn)量、最好質(zhì)量、最低消耗、最大安全性、最周全的廢物處理效果、最佳速度與最低失敗率等指標的保障。 工藝最佳化需對不同的菌種做大量的實驗，取得重復性好的準確數(shù)據(jù)后，模擬發(fā)酵代謝曲線，預測放大值，才能更合理的設計最佳工藝條件。,三、基因工程菌的培養(yǎng)設備 發(fā)酵罐 組成：發(fā)酵罐體、攪拌器、溫度控制系統(tǒng)、滅菌系統(tǒng)、空氣過濾裝置、殘留氣體處理裝置、參數(shù)測量與控制系統(tǒng)、培養(yǎng)液配制及連續(xù)操作裝置。,第五節(jié) 基因工程藥物的分離純化 基因工程藥物或生物技術產(chǎn)品特點: (1) 目的產(chǎn)物在初始原料中的含量較低; (2) 含目的產(chǎn)物的初始物料組成復雜,除了目的產(chǎn)物外, 還有大量的細胞、代謝、殘留培養(yǎng)基、

31、無機鹽等， 特別是產(chǎn)物類似物對目的產(chǎn)物的分離純化影響很 大；,(3) 目的產(chǎn)物的穩(wěn)定性差，具有生物活性的物質(zhì)對 pH、溫度、金屬離子、 有機溶劑、剪切力、表 面張力等十分敏感，容易是其失活、變性； 種類繁多，包括大、中、小分子、結構簡單或 復雜的有機化合物，以及結構復雜又性質(zhì)各異 的生物活性物質(zhì)； 應用面廣，對其質(zhì)量、純度要求高，甚至要求 無菌、無熱源。,一、建立分離純化工藝的根據(jù) 1、含目的產(chǎn)物的起始物料的特點 利用基因工程菌進行發(fā)酵生產(chǎn)的產(chǎn)物，其上游過程中的各種因素均對分離純化技術和工藝有直接影響。 （1）菌種類型及其代謝特性：包括菌種的生物學性質(zhì)，產(chǎn)物和副產(chǎn)物種類、產(chǎn)物在細胞內(nèi)所處的位置

32、，表達方式（胞內(nèi)、胞外、包含體），代謝物種類、產(chǎn)物類似物、毒素和能降解產(chǎn)物的酶類等； （2）原材料和培養(yǎng)基的來源及其質(zhì)量；,（3）生產(chǎn)工藝和條件：包括滅菌方式和條件，生產(chǎn)方式 （連續(xù)、批式、半連續(xù)），生產(chǎn)周期，生產(chǎn)能力，工 藝控制條件因素幾方式等； （4）初始物料的物理、化學和生物學特性：包括產(chǎn)物濃 度、主要雜質(zhì)種類和濃度、鹽的種類和濃度、溶解 度、pH、黏度、流體力學性質(zhì)和熱力學性質(zhì)。 2、物料中雜質(zhì)的種類和性質(zhì) 物料中雜質(zhì)的含量、性質(zhì)、結構、相對分子質(zhì)量、電荷性質(zhì)及數(shù)量、生物學特性、穩(wěn)定性、溶解度、分配系數(shù)、揮發(fā)性、吸附性能等。,3、目的產(chǎn)物特性 產(chǎn)物的化學、物理和生物學特性，包括化學組成

33、、相對分子質(zhì)量、等電點、電荷分布及密度、溶解度、穩(wěn)定性、疏水性、擴散性、擴散系數(shù)、分配系數(shù)、吸附性能、生物學活性、親和性、配基種類、表面活性等。 4、產(chǎn)品質(zhì)量的要求 產(chǎn)品質(zhì)量標準和用途對產(chǎn)品純度、生物活性、比活的要求。包括允許的雜質(zhì)種類和最大允許含量，特殊雜質(zhì)的種類和最大允許量，以及雜質(zhì)對使用的影響，產(chǎn)品劑型、貯存穩(wěn)定性等。,二、分離純化的基本過程 由于基因工程藥物是從轉(zhuǎn)化細胞、而不是從正常細胞生產(chǎn)的，所以對產(chǎn)品的純度要求也要高于傳統(tǒng)產(chǎn)品。 基因工程藥物的分離純化一般不應超過4-5個步驟，包括細胞破碎、固液分離、濃縮與初步純化、高度純化直至得到純品以及成品加工。,基因工程藥物分離純化的一般流程

34、,發(fā)酵液,細胞分離,胞內(nèi)產(chǎn)物,胞外產(chǎn)物,細胞破碎,固液分離,包含體,細胞碎片分離,變 性,復 性,濃 縮,初步分離,高度純化,制 劑,產(chǎn) 品,三、分離純化的技術 分離純化技術要求： （1）技術條件要溫和，能保持目的產(chǎn)物的生物活性； （2）選擇性要好，能從復雜的混合物中有效的地將目的產(chǎn)物分離出來，達到較高純化倍數(shù)； （3）收率要高； （4）兩個技術之間要能直接銜接，不需要對物料加以處理或調(diào)整，這樣可減少工藝步驟； （5）整個分離純化過程要快，能夠滿足高生產(chǎn)率的要求。,1、細胞破碎與固液分離 （1）細胞收集：離心和膜過濾 （2）細胞破碎： 機械法-高壓勻漿、超聲波、高速珠磨、高壓擠壓等。 非機械法

35、-酶溶、化學滲透、熱處理、滲透壓沖擊法。 （3）固液分離：分離細胞碎片是比較困難。一般用離心和 膜過濾。,2、目的產(chǎn)物的分離純化 分離純化目的產(chǎn)物主要依賴于色譜分離技術。色譜技術分為： Ion exchange chromatography (IEC) Reversed phase chromatography (RPC) Hydrophobic interaction chromatography (HIC) Affinity chromatography (AC),表4-1 產(chǎn)物的主要特性及在分離純化中的作用 產(chǎn) 物 特 性 作 用 等電點 決定離子交換的種類及條件 相對分子質(zhì)量 選擇不同

36、孔徑及分級分離范圍的介質(zhì) 疏水性 與疏水、反相介質(zhì)結合的程度 特殊反應性 產(chǎn)物的氧化、還原及部分催化性能的抑制 聚合性 是否采用預防聚合、解聚及分離去除聚合體 生物特異性 決定親和配基 溶解性 決定分離體系及蛋白濃度 穩(wěn)定性 決定工藝采用的溫度及流程時間 微不均一性 影響產(chǎn)物的回收,表4-2 基因工程藥物生產(chǎn)中常用的分離純化方法,方 法 目 的 離心/過濾 去除細胞、細胞碎片、顆粒性雜質(zhì) 陰離子交換層析 去除雜志蛋白、脂質(zhì)、DNA、病毒 40nm微孔濾膜過濾 進一步去除病毒 陽離子交換層析 去除牛血清蛋白或轉(zhuǎn)鐵蛋白等 超 濾 去除沉淀物及病毒 疏水層析 去除殘余的雜蛋白 凝膠過濾 與多聚體分離

37、 0.22m微孔濾膜過濾 除 菌,四、分離純化工藝應遵循的原則 1）具有良好的穩(wěn)定性和重復性； 2）盡可能減少組成工藝的步驟； 3）組成工藝的各技術或步驟之間要能相互適應和協(xié)調(diào)， 工藝和設備相適 應。 4）在工藝過程中盡可能少用試劑，以免增加分離純化步 驟，或干擾產(chǎn)品質(zhì)量； 5）分離純化工藝所用的時間盡可能短，尤其是對穩(wěn)定性 差的產(chǎn)物； 6）工藝和技術必須高效，收率高，易操作，對設備條件 要求低，能耗低； 7）具有較高的安全性。,第六節(jié) 基因工程藥物的質(zhì)量控制,一、原材料的質(zhì)量控制 確保編碼藥品的DNA序列的正確性，重組微生物來自單一克隆，所用質(zhì)粒純而穩(wěn)定，以保證產(chǎn)品質(zhì)量的安全性和一致性。 （

38、1）明確目的基因的來源、克隆經(jīng)過，并以限制性內(nèi)切酶圖譜和核苷酸序列等予以確證； （2）提供表達載體的名稱、結構、遺傳特性及其各組成部分（如啟動子、復 制子）的來源與功能，構建中所用位點的酶切圖譜，抗生素抗性標志物；,（3）提供宿主細胞的名稱、來源、傳代歷史、檢定結果 及其生物學特性； （4）闡明載體引入宿主細胞的方法及載體在宿主細胞內(nèi) 的狀態(tài)，如是否整合 到染色體內(nèi)及在其中的拷貝 數(shù)，并證明宿主細胞與載體結合后的遺傳穩(wěn) 定性； （5）提供插入基因與表達載體兩側(cè)端控制區(qū)的核苷酸序 列，詳細敘述在生產(chǎn)過程中，啟動與控制克隆基因 在宿主細胞中表達的方法及水平等。,二、培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制 在工程菌菌種

39、貯存中，要求種子克隆純而穩(wěn)定；在培養(yǎng) 過程中，要求工程菌所含的質(zhì)粒穩(wěn)定，始終無突變；在重復 生產(chǎn)發(fā)酵中，工程菌表達穩(wěn)定；始終能排除外源微生物污 染。 （1）生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品應有種子批系統(tǒng)，并證明種子批不含致癌因子，無細菌、病毒、真菌和支原體等污染，并由原始種子批建立生產(chǎn)用工作細胞庫； （2）原始種子批須確證克隆基因DNA序列，詳細敘述種子批來源、方式、保存及預計使用期，保存與復蘇時宿主載體表達系統(tǒng)的穩(wěn)定性；,（3）對生產(chǎn)種子，應詳細敘述細胞生長與產(chǎn)品生成的方 法和材料，并控制微生物污染； （4）提供培養(yǎng)生產(chǎn)濃度與產(chǎn)量恒定性數(shù)據(jù)，依據(jù)宿主細 胞-載體系統(tǒng)穩(wěn)定性，確定最高允許傳種代數(shù)； （5）培養(yǎng)過程中，應測定被表達基因分子的完整性及宿 主細胞長期培養(yǎng)后的基因型特征；以宿主細胞-載體 穩(wěn)定性與產(chǎn)品恒定性，規(guī)定持續(xù)培養(yǎng)時間，并定期 評價細胞系統(tǒng)和產(chǎn)品； （6）培養(yǎng)周期結束時，應檢測宿主宿主細胞載體系統(tǒng)的 特性，如質(zhì)?？截悢?shù)、宿主細胞中表達載體存留程 度，含插入基因載體的酶