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1、基因工程制藥 Chapter 4 Gene Engineering for Pharmacon 基因工程:是通過(guò)對(duì)Nucleic acid 分子的Insert, Assemble and Recombinant而實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)（germ plasm）的重新組合，再借助Virus ,Bacterium ,Plasmid or other Vectors,將Target gene轉(zhuǎn)移到新的 Host Cell System,并使Target Gene在新的Host cell system 進(jìn)行Replication and Expression的技術(shù)。 基因工程主要研究任務(wù):Gene isolati

2、on ,synthesis , Incision(切割),recombinant ,transformation and expression. Gene Manipulation/Gene cloning/DNA recombination. 基因工程技術(shù)最成功的成就:用于新型生物技術(shù)藥物的研制, 基因工程技術(shù)的主要工具: * Tool enzyme 工具酶:restriction enzyme, ligase, repair. * Nucleic acid and protein sequence:Basis for gene analyze and synthesis. * Transf

3、er vector: gene transfer * Expression vector: Manufacture plant for gene replication and expression target products. Good Vectors: Ecol. ,- High efficiency expression but glycoprotein Beer yeast , mammalian cell -glycoprotein, 傳統(tǒng)制藥存在的問(wèn)題： A、材料來(lái)源困難或制造技術(shù)問(wèn)題而無(wú)法付諸應(yīng)用； B、從動(dòng)物臟器中提取出來(lái)，也因造價(jià)太高，或因來(lái) 源困難而供不應(yīng)求； C、由于

4、免疫抗原等緣故，使它們?cè)谑褂蒙鲜艿较拗啤?基因工程技術(shù)的特點(diǎn)：就是能夠十分方便有效地生 產(chǎn)許多以往難以大量獲取的生物活性物質(zhì)，甚至可 以創(chuàng)造出自然界中不存在的全新物質(zhì)。,基因工程技術(shù)的應(yīng)用特點(diǎn)： A、為癌種、病毒性疾病、心血管疾病和內(nèi)分泌疾病的預(yù)防、治療和診斷提供新型疫苗、新型藥物和新型診斷試劑。 B、基因工程技術(shù)的最大好處在于它能從極端復(fù)雜的機(jī)體細(xì)胞內(nèi)取出所需要的基因，將其在體外進(jìn)行剪切拼接、重新組合，然后轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)募?xì)胞進(jìn)行表達(dá)，從而生產(chǎn)出比原來(lái)多數(shù)百、數(shù)千倍的相應(yīng)的蛋白質(zhì)。,基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥品的優(yōu)點(diǎn)： a. 可大量生產(chǎn)過(guò)去難以獲得的生理活性多肽和蛋白質(zhì)，為 臨床使用提供有效的保障； b.

5、 可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)，以便對(duì)其生理生化 和結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入的研究，從而擴(kuò)大這些物質(zhì)的應(yīng)用范圍； c. 利用基因工程技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)、挖掘更多的內(nèi)源性生理活性 物質(zhì)；？ d. 內(nèi)源性生理活性物質(zhì)在作為藥物使用時(shí)存在的不足之處， 可以通過(guò)基因工程和蛋白質(zhì)工程進(jìn)行改造；？ e. 利用基因工程技術(shù)可獲得新型化合物，擴(kuò)大藥物篩選來(lái) 源。,基因工程的誕生與及其相關(guān)學(xué)科的關(guān)系,“863”高技術(shù)計(jì)劃在生物技術(shù)領(lǐng)域研究的三個(gè)主題之一是：新型藥物、疫苗和基因治療，重點(diǎn)是利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段，開(kāi)發(fā)化學(xué)合成法難以生產(chǎn)的藥品。,“十五”期間，863計(jì)劃選擇了信息技術(shù)、生物和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)、新材料、先進(jìn)制造與自動(dòng)化技術(shù)

6、、能源技術(shù)、資源環(huán)境技術(shù)等6個(gè)高技術(shù)領(lǐng)域 。,基因工程藥物的生產(chǎn)分為上游和下游兩個(gè)階段： 上游階段：主要是分離目的基因、構(gòu)建工程菌(細(xì)胞)。目的基因獲得后，最主要的就是目的基因的表達(dá)。選擇基因表達(dá)系統(tǒng)主要考慮的是保證表達(dá)的蛋白質(zhì)的功能，其次是表達(dá)的量和分離純化的難易。 此階段的工作主要在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。 下游階段：從工程菌的大量培養(yǎng)一直到產(chǎn)品的分離純化和質(zhì)量控制。此階段是將實(shí)驗(yàn)室的成果產(chǎn)業(yè)化、商品化，主要包括工程菌大規(guī)模發(fā)酵最佳參數(shù)的確立，新型生物反應(yīng)器的研制，高效分離介質(zhì)及裝置的開(kāi)發(fā)，分離純化的優(yōu)化控制，高純度產(chǎn)品的制備技術(shù)，生物傳感器等一系列儀器儀表的設(shè)計(jì)和制造，電子計(jì)算機(jī)的優(yōu)化控制等。,基

7、因工程藥物生產(chǎn)的基本過(guò)程,基因工程藥物的上游技術(shù)： 1、基因克隆載體:質(zhì)粒載體， 2、重組DNA技術(shù)的有關(guān)工具酶及其應(yīng)用 3、核酸制備技術(shù)：制備純凈、高質(zhì)量的 載體DNA和待克隆的 核酸，才能有效地進(jìn)行后續(xù)的酶切、反轉(zhuǎn)錄、連接等分子克隆操作。 1）用堿抽提法分離質(zhì)粒DNA 原理：細(xì)胞pH12.0-12.6線(xiàn)狀DNA變性，cccDNA不變性，加酸恢復(fù)pH到中性，變性的染色體DNA交織成網(wǎng)而沉淀，上清用酚處理使蛋白變性，用醇沉淀質(zhì)粒DNA。 A）質(zhì)粒DNA的小量制備 B）質(zhì)粒DNA的大量制備,2）染色體DNA的制備 3）真核細(xì)胞RNA的制備 DNA的凝膠(Agarose)電泳和 凝膠中DNA的 回

8、收 5) SDS-PAGE電泳和 凝膠中DNA的 回收,第一節(jié) 目的基因的獲得,問(wèn)題：來(lái)源于真核細(xì)胞的產(chǎn)生基因工程藥物的目的基因，為什么不能進(jìn)行直接分離？ 目的基因的獲取途徑： 一、逆轉(zhuǎn)錄法 逆轉(zhuǎn)錄法就是分離純化目的基因的mRNA，再反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行cDNA 克隆表達(dá)。 1、mRNA purification a.細(xì)胞內(nèi)RNA的組成和含量: DNA:95%核內(nèi)，5細(xì)胞器 RNA：75細(xì)胞質(zhì)，10%核內(nèi)，15%細(xì)胞器 rRNA80-85%;tRNA10-15%;mRNA1-5% b.真核細(xì)胞mRNA 的特點(diǎn)及分離純化方法。 3-polyA（20-250AAA）-oligo(dT),纖維

9、素柱純化Poly(A)mRNA 流程圖,2、cDNA第一鏈的合成：一次好的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可使 oligo(dT)選出的mRNA有530%被拷貝。 3、cDNA第二鏈的合成： 4、cDNA cloning：expression vector pUC 5、將重組體導(dǎo)入host cell 6、cDNA library identification 7、目的cDNA 克隆的分離和鑒定 （限制酶圖譜的繪制、雜交分析、基因定位、基因測(cè)序、確定基因的 轉(zhuǎn)錄方向、轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)等。）,二、化學(xué)合成法 較小的蛋白質(zhì)和多肽的編碼基因可以用人工化學(xué)合成法獲得?；瘜W(xué)合成法有個(gè)先決條件是：必須知道目的基因的核苷酸排列順序，或知

10、道目的蛋白質(zhì)的氨基酸順序，再按相應(yīng)的密碼子推導(dǎo)出DNA的堿基系列。 方法：合成目的基因DNA不同部位的兩條鏈的寡核苷酸短片段，再退火成為兩端形成粘性末端的DNA雙鏈片段，然后將這些雙鏈片段按正確的次序進(jìn)行退火連接成較長(zhǎng)的DNA片段，再用連接酶連接成完整的基因。,人工化學(xué)合成基因的限制： a. 不能合成太長(zhǎng)的基因。最長(zhǎng)50-60bp.只適用于克隆小分子肽的基因。 b. 人工合成基因時(shí)，遺傳密碼的簡(jiǎn)并會(huì)為選擇密碼子帶來(lái)很大困難， 如用氨基酸順序推測(cè)核苷酸序列，得到的結(jié)果可能與天然基因不完 全一致，易造成中性突變。 c. 費(fèi)用太高。,第二節(jié) 基因表達(dá) 克隆蛋白質(zhì)藥物基因的一個(gè)主要目的使為了高效的表達(dá)

11、該基因，從而大量地市場(chǎng)原本難以獲得的藥物。 基因表達(dá)是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過(guò)程?；蚋咝П磉_(dá)研究是指外源基因在某種細(xì)胞中的表達(dá)活動(dòng)，即剪切下一個(gè)外源基因片段，拼接到另一個(gè)基因表達(dá)體系中，使其能獲得既有原生物活性又可高產(chǎn)的表達(dá)產(chǎn)物。 進(jìn)行基因表達(dá)研究的主要問(wèn)題是目的基因的表達(dá)產(chǎn)量、表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性、產(chǎn)物的生物學(xué)活性和表達(dá)產(chǎn)物的分離純化。因此，建立最佳的基因表達(dá)體系，是基因表達(dá)設(shè)計(jì)的關(guān)鍵。,GST-T10 Fusion Protein Expression,Fig.2 GST-T10 fusion protein expressed in BL21 induced with

12、 1mM IPTG. Lane 1: Mr; Lane 2: Negative control; Lane 3: expressed GST-T10 fusion protein .,以Fusion Protein的形式表達(dá)藥物基因 許多蛋白質(zhì)藥物與原核生物的蛋白質(zhì)融合后，能保留原有的免疫原性。一些免疫原性弱的多肽制成融合蛋白，其免疫原性能得到加強(qiáng)。用這種融合蛋白免疫動(dòng)物所制備的抗體，能夠用于檢測(cè)原來(lái)的多肽藥物，也可用于藥代動(dòng)力學(xué)研究，藥物受體研究以及藥物產(chǎn)品的檢測(cè)。 有些情況下，采用融合蛋白的形式表達(dá)外源基因是不得以而為之。一些多肽藥物在原核細(xì)胞中不穩(wěn)定，難以獲得高表達(dá)。這些蛋白與菌體蛋白融

13、合后得到穩(wěn)定，但融合蛋白需經(jīng)過(guò)后處理才能釋放出有活性的外源多肽。 多肽藥物的純化通常較為困難，但與特定的原核蛋白融合后，不僅能穩(wěn)定所表達(dá)的產(chǎn)物，還能用識(shí)別蛋白的配體進(jìn)行親和層析純化。如GST-融合基因，所產(chǎn)生的融合蛋白可用谷胱甘肽親和柱一次性純化。,一、宿主細(xì)胞的選擇 宿主細(xì)胞的基本要求： 容易獲得較高濃度的細(xì)胞； 能利用易得廉價(jià)原料； 不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素； 發(fā)熱量低，需氧低，適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度和細(xì)胞形態(tài)； 容易進(jìn)行代謝調(diào)控； 容易進(jìn)行DNA技術(shù)操作； 產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高，且易提取純化。,宿主細(xì)胞的 分類(lèi)： 原核細(xì)胞，常用的有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈 霉菌等； 真核細(xì)胞，常用的有酵母、絲狀真菌

14、、哺乳動(dòng)物細(xì) 胞。 1、原核細(xì)胞 （1）大腸桿菌：表達(dá)產(chǎn)物的形式：細(xì)胞內(nèi)不溶性表達(dá)（包含體）、胞內(nèi)可溶性表達(dá)、細(xì)胞周質(zhì)表達(dá)，極少還可分泌到胞外表達(dá)。不同的表達(dá)形式具有不同的表達(dá)水平，且會(huì)帶來(lái)完全不同的雜質(zhì)。,特點(diǎn): A、大腸桿菌中的表達(dá)不存在信號(hào)肽，故產(chǎn)品多為胞內(nèi) 產(chǎn)物，提 取時(shí)需破碎細(xì)胞，此時(shí)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)其他蛋白 也釋放出來(lái)，因而造成提取困難。 B、由于分泌能力不足，真核蛋白質(zhì)常形成不溶性的 包含體(inclusion body)，表達(dá)產(chǎn)物必須在下游處理 過(guò)程中經(jīng)過(guò)變性和復(fù)姓處理才能恢復(fù)其生物活性。,C、在大腸桿菌中表達(dá)不存在翻譯后修飾作用，故對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)物不能糖基化，因此，只適于表達(dá)不經(jīng)糖基化等

15、翻譯后修飾仍具有生物功能的真核蛋白質(zhì)，在應(yīng)用上受到一定的限制。 由于翻譯常從甲硫氨酸的AUG密碼子開(kāi)始，故目的蛋白質(zhì)的N端常多余一個(gè)甲硫氨酸殘基，容易引起免疫反應(yīng)。大腸桿菌會(huì)產(chǎn)生很難除去的內(nèi)毒素，還會(huì)產(chǎn)生蛋白酶而破壞目的蛋白質(zhì)。,（2）枯草芽孢桿菌：分泌能力強(qiáng)，可將蛋白質(zhì)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中，不形成包含體。該菌也不能使蛋白質(zhì)糖基化，另外由于它有很強(qiáng)的胞外蛋白酶，會(huì)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行不同程度的降解，因此，它的應(yīng)用也受到限制。 （3）鏈霉菌：重要的工業(yè)微生物。特點(diǎn)是不致病、使用安全，分泌能力強(qiáng)，可將表達(dá)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中，具有糖基化能力，可做理想的受體菌。,2、真核細(xì)胞 （1）酵母：繁殖迅速，可廉價(jià)

16、的大規(guī)模培養(yǎng)，而且沒(méi)有毒性，基因工程操作與原核生物相似，表達(dá)產(chǎn)物直接分泌到細(xì)胞外，簡(jiǎn)化了分離純化工藝。表達(dá)產(chǎn)物能糖基化。特別是某些在細(xì)菌系統(tǒng)中表達(dá)不良的真核基因，在酵母中表達(dá)良好。目前以釀酒酵母應(yīng)用最多。干擾素和乙肝表面抗原已獲成功。 （2）絲狀真菌：很強(qiáng)的分泌能力；能正確進(jìn)行翻譯后加工，包括肽剪切和糖基化；而且糖基化方式與高等真核生物相似；絲狀真菌（如曲霉）被確認(rèn)是安全菌珠，有成熟的發(fā)酵和后處理工藝。,（3）哺乳動(dòng)物細(xì)胞：由于外源基因的表達(dá)產(chǎn)物可由重組轉(zhuǎn)化的細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液成分完全由人控制，從而是產(chǎn)物純化變得容易。產(chǎn)物是糖基化的，接近或 類(lèi)似于天然產(chǎn)物。 但動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)慢，生產(chǎn)率低

17、，而且培養(yǎng)條件苛刻，費(fèi)用高，培養(yǎng)液濃度較稀。 雖然從理論上講，各種微生物都可以用于基因表達(dá)，但由于克隆載體、DNA導(dǎo)入方法以及遺傳背景等方面的限制，目前使用最廣泛的宿主菌仍然是大腸桿菌和釀酒酵母。,二、大腸桿菌中的基因表達(dá) 1、載體：表達(dá)載體必須具備的條件 （1）載體能夠獨(dú)立的復(fù)制； （2）具有靈活的克隆位點(diǎn)和方便的篩選標(biāo)記。且克隆位點(diǎn)應(yīng)在啟動(dòng)子序列后， 以使克隆的外源基因得以表達(dá)； （3）具有很強(qiáng)的Promoter，能為大腸桿菌的RNA聚合酶所識(shí)別； （4）具有Repressor，使啟動(dòng)子受到控制，只有當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)才能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；,（5）具有很強(qiáng)的終止子，以便使RNA聚合酶集中力量轉(zhuǎn)錄克隆的外源基

18、因， 而不轉(zhuǎn)錄無(wú)關(guān)的基因。 （6）所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號(hào)，即起始密碼AUG和SD序列， 以便轉(zhuǎn)錄后能順利翻譯。 實(shí)例：pBV220系統(tǒng) 中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所構(gòu)建。已成功的用于表達(dá) IL-2/3/4/6/8、 TFN、TNF、TNF、 G-CSF、 GM-CSF等細(xì)胞因子。 問(wèn)題:阻遏子repressor的阻遏作用對(duì)host cell有何影響？對(duì)foreign gene的表達(dá)有無(wú)影響？,2、影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素 外源基因的表達(dá)產(chǎn)量-單位體積產(chǎn)量-細(xì)胞濃度和每個(gè)細(xì)胞平均表達(dá)產(chǎn)量呈正相關(guān)。細(xì)胞濃度與生長(zhǎng)速率、外源基因拷貝數(shù)和表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)量之間存在著一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，

19、只有保持最佳的動(dòng)態(tài)平衡才能獲得最高產(chǎn)量；單個(gè)細(xì)胞的產(chǎn)量又與外源基因的拷貝數(shù)、基因表達(dá)效率、表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性和細(xì)胞代謝負(fù)荷等因素有關(guān)。因此必須從以下因素入手，尋找提高外源基因表達(dá)效率的有效途徑：,（1）外源基因的拷貝數(shù)：與載體在宿主中的拷貝數(shù)直接 相關(guān)。 （2）外源基因的表達(dá)效率：?jiǎn)?dòng)子的強(qiáng)弱，SD序列和 ATG的間距等。 A、啟動(dòng)子的強(qiáng)弱：目的基因插入表達(dá)載體啟動(dòng)子的 下游，可增加基因的表達(dá)。lac、trp、 tac、 bla。 B、核糖體結(jié)合位點(diǎn)的有效性 C、SD與ATG的間距：影響非融合蛋白的合成水平 D、密碼子組成：設(shè)計(jì)引物或合成基因時(shí)選擇大腸桿 菌“偏愛(ài)”的密碼子；,（3）表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)

20、定性：組建融合蛋白；利用信號(hào)肽； 特異性突變；位點(diǎn)特異突變，改變二硫鍵位置；宿主 蛋白酶缺陷 （4）細(xì)胞的代謝負(fù)荷：擬制外源基因的表達(dá)；宿主細(xì)胞 的生長(zhǎng)與重組質(zhì)粒的復(fù)制分開(kāi)； （5）工程菌的培養(yǎng)條件：host-Vector -cloning gene,3、真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)方式 （1）以融合蛋白的形式表達(dá)藥物基因：融合蛋白氨基端是原核序列，羧基端是真核序列。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，蛋白質(zhì)在菌體內(nèi)比較穩(wěn)定；易高效表達(dá)；但只能做抗原。? 一般不做人體注射用藥。 （2）以非融合蛋白的形式表達(dá)藥物基因：易被蛋白酶破壞；N端有甲硫氨酸，易引起免疫反應(yīng)。 OP:P-SD-ATG-St.gene-Stop

21、C. （3）分泌型表達(dá)蛋白藥物基因：外源基因融合到原核蛋白信號(hào)肽序列的下游。,三、酵母中的基因表達(dá) 1、載體 酵母載體是可以攜帶外源基因在酵母細(xì)胞內(nèi)保存和復(fù)制，并隨酵母分裂傳遞到子代細(xì)胞的 DNA或RNA。 A) Yep類(lèi)（Yeast episomal plasmid） B) YRp 類(lèi)(Yeast replication plasmid) C) YC p 類(lèi)(yeast centromeric plasmid)：復(fù)制序列為ARS，并含有酵母染色體中心粒、端粒成分，穩(wěn)定性好，但拷貝數(shù)只有一個(gè)，轉(zhuǎn)化頻率103104/g DNA。 D) YI p(yeast integrative plasmid

22、):含有可與酵母染色體重組的序列，可以完全整合到染色體中。因此它依靠酵母染色體進(jìn)行復(fù)制，具有很好的穩(wěn)定性?？截悢?shù)只一個(gè)，轉(zhuǎn)化頻率1100 / g DNA。,（2）克隆載體 向酵母載體中引入大腸桿菌質(zhì)粒pBR322的ori 部分和Ampr 或Tetr 部分，這樣構(gòu)成的載體同時(shí)帶有細(xì)菌和酵母的復(fù)制原點(diǎn)和選擇標(biāo)記。 （3）表達(dá)載體 將酵母菌的啟動(dòng)子和終止子等有關(guān)控制序列引入載體的適當(dāng)位點(diǎn)后，就構(gòu)成了酵母菌的表達(dá)載體。分普通表達(dá)載體和精確表達(dá)載體。,2、影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素 （1）外源基因的拷貝數(shù)：高度穩(wěn)定、高拷貝-高表達(dá) （2）外源基因的表達(dá)效率：?jiǎn)?dòng)子 （3）外源蛋白的糖基化：酵母分泌

23、的異源蛋白糖基化產(chǎn)物與天然產(chǎn)物完全相同。 （4）宿主菌珠的影響：菌體生長(zhǎng)力強(qiáng)；菌體內(nèi)源蛋白酶要弱；菌株性能穩(wěn)定；分泌能力強(qiáng)。,四、動(dòng)物細(xì)胞中的基因表達(dá) 外源基因的表達(dá)產(chǎn)物可由重組轉(zhuǎn)化的細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液成分完全由人工控制，從而使產(chǎn)物純化變得容易?；虍a(chǎn)物是糖基化的，接近或類(lèi)似于天然產(chǎn)物。 但動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)慢，單位體積的生產(chǎn)率低，培養(yǎng)條件苛刻，費(fèi)用高。目前用于表達(dá)外源基因的細(xì)胞均為傳代細(xì)胞。,三類(lèi)主要基因工程表達(dá)體系的比較 表達(dá)體系 產(chǎn) 物 產(chǎn)生部位 培養(yǎng)方式 提純 產(chǎn)物活性 淺在危險(xiǎn) 大腸桿菌 多肽、蛋白 菌體內(nèi) 容易 一般 對(duì)原核好 不大 融合蛋白 部分可高產(chǎn) 酵 母 多肽、蛋白 菌體

24、內(nèi) 容易 菌體內(nèi) 真核接近 不大 糖基化蛋白 分泌出細(xì)胞 可高產(chǎn) 復(fù)雜 天然 動(dòng)物細(xì)胞 完整 分泌出細(xì)胞 較難 簡(jiǎn)單 幾乎可為 可能有 糖基化蛋白 成本高 天然產(chǎn)物 致癌因 可高產(chǎn) 素,第三節(jié) 基因工程菌的穩(wěn)定性（stability） 一、質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生的原因 分裂不穩(wěn)定：指工程菌分裂時(shí)出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒子代菌的現(xiàn)象。(常見(jiàn)) 結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定：指外源基因從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變。 工程菌的質(zhì)粒不穩(wěn)定因素： 一 是含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率； 二是這兩種菌的比生長(zhǎng)速率差異的大小。,對(duì)同一工程菌，通過(guò)控制不同的比生長(zhǎng)速率可以改變質(zhì)粒的拷貝數(shù)：含低拷貝質(zhì)粒的工程菌產(chǎn)生不含

25、質(zhì)粒子代菌的頻率較大，增加質(zhì)?？截悢?shù)能提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性； 含高拷貝質(zhì)粒的工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率較低，但是大量外源質(zhì)粒的存在使含質(zhì)粒菌的工程菌的比生長(zhǎng)速率明顯低于不含質(zhì)粒菌，而不含質(zhì)粒菌一旦產(chǎn)生，能較快地取代含質(zhì)粒菌而成為優(yōu)勢(shì)菌，對(duì)質(zhì)粒的穩(wěn)定性不利。 質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法： 樣品稀釋-涂板-10-12h-挑選100個(gè)菌落-接種抗性標(biāo)記的平版-10-12h-統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)計(jì)算%,二、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法 1、兩階段培養(yǎng)法：第一階段使菌體生長(zhǎng)至一定密度，第二階段誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)。在培養(yǎng)基中加入選擇性壓力如抗生素等，以抑制質(zhì)粒丟 失菌的生長(zhǎng)。 2、通過(guò)控制環(huán)境參數(shù)（溫度、PH、培養(yǎng)基組分和溶解氧

26、濃度），調(diào)節(jié)比 生長(zhǎng)速率，使工程菌生長(zhǎng)具有優(yōu)勢(shì)。有些含質(zhì)粒的菌對(duì)發(fā)酵環(huán)境的改變 比不含質(zhì)粒的菌反應(yīng)慢，因而間歇改變培養(yǎng)條件以改變這兩種菌的比 生長(zhǎng)速率，可以改善質(zhì)粒的穩(wěn)定性。,第四節(jié) 基因工程菌的發(fā)酵 工程菌的培養(yǎng)過(guò)程：搖瓶操作（溫度、pH、培養(yǎng)基組分、碳氮比）； 培養(yǎng)罐操作（確定培養(yǎng)參數(shù)、控制方案、順序） 一、基因工程菌的培養(yǎng)方式 1、補(bǔ)料分批培養(yǎng)：將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，間歇或 連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進(jìn)一步生長(zhǎng)的方法。通常把溶氧控制與流加補(bǔ)料結(jié)合起來(lái)進(jìn)行。,2、連續(xù)培養(yǎng)：將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中，攪拌培養(yǎng)至一定菌體濃度后，開(kāi)動(dòng)進(jìn)料和出料的蠕動(dòng)泵，以控制一定稀釋率

27、進(jìn)行不間斷的培養(yǎng)。 3、透析培養(yǎng)：利用膜的半透性原理使代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基分離，通過(guò)去處培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物來(lái)解除其對(duì)生產(chǎn)菌的不利影響。 4、固定化培養(yǎng)：將固定化技術(shù)用于工程菌的培養(yǎng)，質(zhì)粒穩(wěn)定性大大提高，特別是對(duì)分泌型菌種。,二、基因工程菌的發(fā)酵工藝 基因工程菌的發(fā)酵工藝 傳統(tǒng)微生物發(fā)酵工藝 材料 帶外源基因重組載體的微生物 不含外源基因的微生物 目的 使外源基因高效表達(dá)，盡量減少 自身基因表達(dá)所產(chǎn)生的 宿主本身蛋白的污染 初級(jí)或次極代謝產(chǎn)物 1、培養(yǎng)基的影響 使用不同的碳源對(duì)菌體的生長(zhǎng)和外源基因的表達(dá)有較大的影響。如以甘油為碳源，菌體得率較大，而以葡萄糖為碳源菌體產(chǎn)生的副產(chǎn)物較多。葡萄糖對(duì)lac啟

28、動(dòng)子有阻遏作用,采用流加措施,控制培養(yǎng)液中葡萄糖的較低濃度,可減弱或消除葡萄糖的阻遏作用。還有無(wú)機(jī)磷對(duì)產(chǎn)物的影響也較大。,碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。 氮源：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米漿和氨 水、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨等 。 其他：無(wú)機(jī)鹽、微量元素維生素、生物素等。 2、接種量的影響 接種量是指移入的種子液體積和培養(yǎng)液體積的比例。它的大小影響發(fā)酵的產(chǎn)量和發(fā)酵周期。接種量小，延長(zhǎng)菌體延遲期，不利于外源基因的表達(dá)，采用大接種量，由于種子液中含有大量水解酶，有利于對(duì)基質(zhì)的利用，但接種量過(guò)大往往會(huì)使菌體生長(zhǎng)過(guò)快，代謝產(chǎn)物積累過(guò)多，反而會(huì)抑制后期菌體的生長(zhǎng)。,3、溫度的影響 溫

29、度對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用可發(fā)生在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯或小分子的合成水平上。 4、溶解氧的影響 溶解氧是發(fā)酵培養(yǎng)中影響菌體代謝的一個(gè)重要參數(shù)，對(duì)菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的生成影響很大。維持較高水平的DO2值（40%）有利于重組質(zhì)粒細(xì)胞的生長(zhǎng)及外源蛋白產(chǎn)物的形成。,5、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響 一般在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期或?qū)?shù)生長(zhǎng)后期進(jìn)行升溫誘導(dǎo)表達(dá)。 6、pH的影響 如采用兩段培養(yǎng)工藝，培養(yǎng)前期著重于優(yōu)化工程菌的最佳生長(zhǎng)條件，培養(yǎng)后期著重于優(yōu)化外源蛋白的表達(dá)條件。細(xì)胞生長(zhǎng)期的最佳pH范圍在6.8-7.4，外源蛋白表達(dá)的最佳pH為6.0-6.5。,總之，工程菌發(fā)酵工藝的優(yōu)化對(duì)異源蛋白的表達(dá)關(guān)系重大，必須建立最佳化工藝。最佳化工藝是

30、獲得最快周期、最高產(chǎn)量、最好質(zhì)量、最低消耗、最大安全性、最周全的廢物處理效果、最佳速度與最低失敗率等指標(biāo)的保障。 工藝最佳化需對(duì)不同的菌種做大量的實(shí)驗(yàn)，取得重復(fù)性好的準(zhǔn)確數(shù)據(jù)后，模擬發(fā)酵代謝曲線(xiàn)，預(yù)測(cè)放大值，才能更合理的設(shè)計(jì)最佳工藝條件。,三、基因工程菌的培養(yǎng)設(shè)備 發(fā)酵罐 組成：發(fā)酵罐體、攪拌器、溫度控制系統(tǒng)、滅菌系統(tǒng)、空氣過(guò)濾裝置、殘留氣體處理裝置、參數(shù)測(cè)量與控制系統(tǒng)、培養(yǎng)液配制及連續(xù)操作裝置。,第五節(jié) 基因工程藥物的分離純化 基因工程藥物或生物技術(shù)產(chǎn)品特點(diǎn): (1) 目的產(chǎn)物在初始原料中的含量較低; (2) 含目的產(chǎn)物的初始物料組成復(fù)雜,除了目的產(chǎn)物外, 還有大量的細(xì)胞、代謝、殘留培養(yǎng)基、

31、無(wú)機(jī)鹽等， 特別是產(chǎn)物類(lèi)似物對(duì)目的產(chǎn)物的分離純化影響很 大；,(3) 目的產(chǎn)物的穩(wěn)定性差，具有生物活性的物質(zhì)對(duì) pH、溫度、金屬離子、 有機(jī)溶劑、剪切力、表 面張力等十分敏感，容易是其失活、變性； 種類(lèi)繁多，包括大、中、小分子、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單或 復(fù)雜的有機(jī)化合物，以及結(jié)構(gòu)復(fù)雜又性質(zhì)各異 的生物活性物質(zhì)； 應(yīng)用面廣，對(duì)其質(zhì)量、純度要求高，甚至要求 無(wú)菌、無(wú)熱源。,一、建立分離純化工藝的根據(jù) 1、含目的產(chǎn)物的起始物料的特點(diǎn) 利用基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)的產(chǎn)物，其上游過(guò)程中的各種因素均對(duì)分離純化技術(shù)和工藝有直接影響。 （1）菌種類(lèi)型及其代謝特性：包括菌種的生物學(xué)性質(zhì)，產(chǎn)物和副產(chǎn)物種類(lèi)、產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)所處的位置

32、，表達(dá)方式（胞內(nèi)、胞外、包含體），代謝物種類(lèi)、產(chǎn)物類(lèi)似物、毒素和能降解產(chǎn)物的酶類(lèi)等； （2）原材料和培養(yǎng)基的來(lái)源及其質(zhì)量；,（3）生產(chǎn)工藝和條件：包括滅菌方式和條件，生產(chǎn)方式 （連續(xù)、批式、半連續(xù)），生產(chǎn)周期，生產(chǎn)能力，工 藝控制條件因素幾方式等； （4）初始物料的物理、化學(xué)和生物學(xué)特性：包括產(chǎn)物濃 度、主要雜質(zhì)種類(lèi)和濃度、鹽的種類(lèi)和濃度、溶解 度、pH、黏度、流體力學(xué)性質(zhì)和熱力學(xué)性質(zhì)。 2、物料中雜質(zhì)的種類(lèi)和性質(zhì) 物料中雜質(zhì)的含量、性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、相對(duì)分子質(zhì)量、電荷性質(zhì)及數(shù)量、生物學(xué)特性、穩(wěn)定性、溶解度、分配系數(shù)、揮發(fā)性、吸附性能等。,3、目的產(chǎn)物特性 產(chǎn)物的化學(xué)、物理和生物學(xué)特性，包括化學(xué)組成

33、、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、電荷分布及密度、溶解度、穩(wěn)定性、疏水性、擴(kuò)散性、擴(kuò)散系數(shù)、分配系數(shù)、吸附性能、生物學(xué)活性、親和性、配基種類(lèi)、表面活性等。 4、產(chǎn)品質(zhì)量的要求 產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和用途對(duì)產(chǎn)品純度、生物活性、比活的要求。包括允許的雜質(zhì)種類(lèi)和最大允許含量，特殊雜質(zhì)的種類(lèi)和最大允許量，以及雜質(zhì)對(duì)使用的影響，產(chǎn)品劑型、貯存穩(wěn)定性等。,二、分離純化的基本過(guò)程 由于基因工程藥物是從轉(zhuǎn)化細(xì)胞、而不是從正常細(xì)胞生產(chǎn)的，所以對(duì)產(chǎn)品的純度要求也要高于傳統(tǒng)產(chǎn)品。 基因工程藥物的分離純化一般不應(yīng)超過(guò)4-5個(gè)步驟，包括細(xì)胞破碎、固液分離、濃縮與初步純化、高度純化直至得到純品以及成品加工。,基因工程藥物分離純化的一般流程

34、,發(fā)酵液,細(xì)胞分離,胞內(nèi)產(chǎn)物,胞外產(chǎn)物,細(xì)胞破碎,固液分離,包含體,細(xì)胞碎片分離,變 性,復(fù) 性,濃 縮,初步分離,高度純化,制 劑,產(chǎn) 品,三、分離純化的技術(shù) 分離純化技術(shù)要求： （1）技術(shù)條件要溫和，能保持目的產(chǎn)物的生物活性； （2）選擇性要好，能從復(fù)雜的混合物中有效的地將目的產(chǎn)物分離出來(lái)，達(dá)到較高純化倍數(shù)； （3）收率要高； （4）兩個(gè)技術(shù)之間要能直接銜接，不需要對(duì)物料加以處理或調(diào)整，這樣可減少工藝步驟； （5）整個(gè)分離純化過(guò)程要快，能夠滿(mǎn)足高生產(chǎn)率的要求。,1、細(xì)胞破碎與固液分離 （1）細(xì)胞收集：離心和膜過(guò)濾 （2）細(xì)胞破碎： 機(jī)械法-高壓勻漿、超聲波、高速珠磨、高壓擠壓等。 非機(jī)械法

35、-酶溶、化學(xué)滲透、熱處理、滲透壓沖擊法。 （3）固液分離：分離細(xì)胞碎片是比較困難。一般用離心和 膜過(guò)濾。,2、目的產(chǎn)物的分離純化 分離純化目的產(chǎn)物主要依賴(lài)于色譜分離技術(shù)。色譜技術(shù)分為： Ion exchange chromatography (IEC) Reversed phase chromatography (RPC) Hydrophobic interaction chromatography (HIC) Affinity chromatography (AC),表4-1 產(chǎn)物的主要特性及在分離純化中的作用 產(chǎn) 物 特 性 作 用 等電點(diǎn) 決定離子交換的種類(lèi)及條件 相對(duì)分子質(zhì)量 選擇不同

36、孔徑及分級(jí)分離范圍的介質(zhì) 疏水性 與疏水、反相介質(zhì)結(jié)合的程度 特殊反應(yīng)性 產(chǎn)物的氧化、還原及部分催化性能的抑制 聚合性 是否采用預(yù)防聚合、解聚及分離去除聚合體 生物特異性 決定親和配基 溶解性 決定分離體系及蛋白濃度 穩(wěn)定性 決定工藝采用的溫度及流程時(shí)間 微不均一性 影響產(chǎn)物的回收,表4-2 基因工程藥物生產(chǎn)中常用的分離純化方法,方 法 目 的 離心/過(guò)濾 去除細(xì)胞、細(xì)胞碎片、顆粒性雜質(zhì) 陰離子交換層析 去除雜志蛋白、脂質(zhì)、DNA、病毒 40nm微孔濾膜過(guò)濾 進(jìn)一步去除病毒 陽(yáng)離子交換層析 去除牛血清蛋白或轉(zhuǎn)鐵蛋白等 超 濾 去除沉淀物及病毒 疏水層析 去除殘余的雜蛋白 凝膠過(guò)濾 與多聚體分離

37、 0.22m微孔濾膜過(guò)濾 除 菌,四、分離純化工藝應(yīng)遵循的原則 1）具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性； 2）盡可能減少組成工藝的步驟； 3）組成工藝的各技術(shù)或步驟之間要能相互適應(yīng)和協(xié)調(diào)， 工藝和設(shè)備相適 應(yīng)。 4）在工藝過(guò)程中盡可能少用試劑，以免增加分離純化步 驟，或干擾產(chǎn)品質(zhì)量； 5）分離純化工藝所用的時(shí)間盡可能短，尤其是對(duì)穩(wěn)定性 差的產(chǎn)物； 6）工藝和技術(shù)必須高效，收率高，易操作，對(duì)設(shè)備條件 要求低，能耗低； 7）具有較高的安全性。,第六節(jié) 基因工程藥物的質(zhì)量控制,一、原材料的質(zhì)量控制 確保編碼藥品的DNA序列的正確性，重組微生物來(lái)自單一克隆，所用質(zhì)粒純而穩(wěn)定，以保證產(chǎn)品質(zhì)量的安全性和一致性。 （

38、1）明確目的基因的來(lái)源、克隆經(jīng)過(guò)，并以限制性?xún)?nèi)切酶圖譜和核苷酸序列等予以確證； （2）提供表達(dá)載體的名稱(chēng)、結(jié)構(gòu)、遺傳特性及其各組成部分（如啟動(dòng)子、復(fù) 制子）的來(lái)源與功能，構(gòu)建中所用位點(diǎn)的酶切圖譜，抗生素抗性標(biāo)志物；,（3）提供宿主細(xì)胞的名稱(chēng)、來(lái)源、傳代歷史、檢定結(jié)果 及其生物學(xué)特性； （4）闡明載體引入宿主細(xì)胞的方法及載體在宿主細(xì)胞內(nèi) 的狀態(tài)，如是否整合 到染色體內(nèi)及在其中的拷貝 數(shù)，并證明宿主細(xì)胞與載體結(jié)合后的遺傳穩(wěn) 定性； （5）提供插入基因與表達(dá)載體兩側(cè)端控制區(qū)的核苷酸序 列，詳細(xì)敘述在生產(chǎn)過(guò)程中，啟動(dòng)與控制克隆基因 在宿主細(xì)胞中表達(dá)的方法及水平等。,二、培養(yǎng)過(guò)程的質(zhì)量控制 在工程菌菌種

39、貯存中，要求種子克隆純而穩(wěn)定；在培養(yǎng) 過(guò)程中，要求工程菌所含的質(zhì)粒穩(wěn)定，始終無(wú)突變；在重復(fù) 生產(chǎn)發(fā)酵中，工程菌表達(dá)穩(wěn)定；始終能排除外源微生物污 染。 （1）生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品應(yīng)有種子批系統(tǒng)，并證明種子批不含致癌因子，無(wú)細(xì)菌、病毒、真菌和支原體等污染，并由原始種子批建立生產(chǎn)用工作細(xì)胞庫(kù)； （2）原始種子批須確證克隆基因DNA序列，詳細(xì)敘述種子批來(lái)源、方式、保存及預(yù)計(jì)使用期，保存與復(fù)蘇時(shí)宿主載體表達(dá)系統(tǒng)的穩(wěn)定性；,（3）對(duì)生產(chǎn)種子，應(yīng)詳細(xì)敘述細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)品生成的方 法和材料，并控制微生物污染； （4）提供培養(yǎng)生產(chǎn)濃度與產(chǎn)量恒定性數(shù)據(jù)，依據(jù)宿主細(xì) 胞-載體系統(tǒng)穩(wěn)定性，確定最高允許傳種代數(shù)； （5）培養(yǎng)過(guò)程中，應(yīng)測(cè)定被表達(dá)基因分子的完整性及宿 主細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)后的基因型特征；以宿主細(xì)胞-載體 穩(wěn)定性與產(chǎn)品恒定性，規(guī)定持續(xù)培養(yǎng)時(shí)間，并定期 評(píng)價(jià)細(xì)胞系統(tǒng)和產(chǎn)品； （6）培養(yǎng)周期結(jié)束時(shí)，應(yīng)檢測(cè)宿主宿主細(xì)胞載體系統(tǒng)的 特性，如質(zhì)?？截悢?shù)、宿主細(xì)胞中表達(dá)載體存留程 度，含插入基因載體的酶