《pcr質(zhì)量管理》PPT課件.ppt

1、臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證,中心實(shí)驗(yàn)室 麥麗文,核酸實(shí)驗(yàn)室工作要求及流程,1、設(shè)施與環(huán)境：由于基因擴(kuò)增檢驗(yàn)對靶核酸有一個指數(shù)擴(kuò)增過程，因而有大量的擴(kuò)增產(chǎn)物的出現(xiàn)，這種產(chǎn)物極易對以后新的擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生“污染”，為防止這種污染的發(fā)生，就需要對實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行嚴(yán)格分區(qū)。 2、人員：必須經(jīng)過培訓(xùn)并取得上崗證。 3、設(shè)備、標(biāo)本、耗材、記錄的管理,四個方面闡述,一、測定前的標(biāo)本采集處理 二、測定中的核酸提取 三、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析 四、測定后的結(jié)果報告 涉及到整個基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的所有階段,測定前的標(biāo)本采集,一、標(biāo)本的采集 臨床PCR實(shí)驗(yàn)室對各種臨床標(biāo)本的收集都建立了標(biāo)準(zhǔn)操體程序（SOP）。標(biāo)本的采集、運(yùn)送和保存對檢驗(yàn)結(jié)

2、果往往有決定性的影響，因此，為保證得到高質(zhì)量的檢驗(yàn)結(jié)果，必須有一個規(guī)范的臨床標(biāo)本采集、運(yùn)送和保存的程序。,測定前的標(biāo)本采集,常用于基因擴(kuò)增檢測的臨床標(biāo)本包括： 1、EDTA或枸椽酸鈉抗凝全血或骨髓 2、血清或血漿 3、尿液、乳汁、組織 4、咽拭子、生殖道拭子及分泌物等。,測定前的標(biāo)本采集,二、影響標(biāo)本采集的因素 1、標(biāo)本采集的時間 2、標(biāo)本采集部位 3、標(biāo)本采集的類型和采集量 4、采樣質(zhì)量的評價 5、采樣及運(yùn)輸容器 6、標(biāo)本采集中的防污染,測定前的標(biāo)本采集,采集時間 標(biāo)本采集過早或過晚都可能會給出假陰性結(jié)果。當(dāng)病原體感染機(jī)體后，特定的臨床標(biāo)本中，病原體含量能達(dá)到PCR檢出水平的點(diǎn)，并不能覆蓋整

3、個感染過程，可能只是在感染或疾病發(fā)生發(fā)展過程中的某一個時間段。 如：呼吸道冠狀病毒，感染發(fā)病后3-4d，即可出現(xiàn)于上或下呼吸道標(biāo)本中，在10-13天，在尿液和糞便中出現(xiàn)的濃度最高，而在血液中，則不但存在時間短，而且濃度低。 又如：HBV、HCV和HIV感染等，機(jī)體感染后，在特定抗原和抗體出現(xiàn)以前，血循環(huán)中即可有較高的病原體存在，而當(dāng)抗體出現(xiàn)后，病原體的濃度在不同的患者不同的感染階段有可能是不一樣的，有的可能會低于特定PCR方法的測定下限。,測定前的標(biāo)本采集,標(biāo)本采集部位、類型和采集量 1、在臨床靜脈血液標(biāo)本的采集上，一般不會出現(xiàn)對結(jié)果影響很大的情況。但在泌尿生殖道分泌物及咽拭子標(biāo)本的采集上，如

4、果采集不當(dāng)，可能有相當(dāng)一部分結(jié)果出現(xiàn)假陰性。 2、類型與采集量應(yīng)根據(jù)所測病原體而定。 3、標(biāo)本量的大小對測定非常重要。標(biāo)本量大會使外源非相關(guān)DNA增多，有可能會影響測定的敏感性。,測定前的標(biāo)本采集,采樣及運(yùn)輸容器 標(biāo)本的采集材料如棉簽、拭子等均為一次性使用，運(yùn)輸容器應(yīng)為密閉的一次性無菌裝置，采樣所用的防腐劑及相關(guān)試劑材料不應(yīng)對核酸擴(kuò)增及檢測過程造成干擾。 如：PCR不能使用肝素抗凝，因?yàn)楦嗡厥荰aq酶的強(qiáng)抑制劑，而且在其后的核酸提取步驟中很難去除，故應(yīng)盡量避免使用。,測定前的標(biāo)本采集,采樣質(zhì)量的評價 、血清（漿）標(biāo)本可觀察標(biāo)本是否溶血、脂血及其程度；（血紅素及其代謝產(chǎn)物、脂類等對PCR有抑制作

5、用） 、分泌物標(biāo)本，則可從細(xì)胞組成，所需類型細(xì)胞的數(shù)量等方面進(jìn)行評價。 如：分泌物標(biāo)本，則可以鏡下觀察是否有上皮細(xì)胞存在； 痰標(biāo)本如果白細(xì)胞數(shù)量極少，則并沒有采集到真正的痰,測定前的標(biāo)本采集,標(biāo)本采集中的防污染 1、最好采用一次性無菌及無核酸酶的材料，不用處理便可直接使用，采集中要特別注意防止混入操作者的頭發(fā)、表皮細(xì)胞、痰液等。 2、如使用玻璃器皿，必須經(jīng)0.1%DEPC水處理后高壓。以使可能存在的RNase失活。 總而言之，標(biāo)本的收集及適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，對于用于PCR測定的核酸模板的成功提取，具有決定性作用。,測定前的標(biāo)本采集,三、標(biāo)本運(yùn)送與保存： 標(biāo)本一經(jīng)采集，則應(yīng)盡可能快的送至檢測實(shí)驗(yàn)室。

6、、DNA的標(biāo)本，如是在無菌條件下采集，則可以在室溫下運(yùn)送，建議采集后，在8h之內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室；（不能及時送實(shí)驗(yàn)室之前，均應(yīng)暫放在2-8臨時保存） 、RNA的標(biāo)本，短時間內(nèi)的運(yùn)送如10min左右，則可室溫下運(yùn)送，如為較長時間，則應(yīng)在加冰條件下運(yùn)送。（血標(biāo)本必須在抽血后2小時分離血清，以免RNA的降解。最理想是存放在-70）,標(biāo)本的接收,1、核對檢驗(yàn)單的一般信息：姓名、性別等 2、按檢測項(xiàng)目驗(yàn)證標(biāo)本類型： 例：CMV：EDTA抗凝血、尿液、母乳或咽拭子； 3、標(biāo)本狀態(tài)檢查； 4、標(biāo)本唯一性標(biāo)識的確認(rèn)： 例：090909B01表示HBV-DNA在2009年9月9日的第1號標(biāo)本。,標(biāo)本的拒收,1、標(biāo)本的拒

7、收條件： 標(biāo)本血量不足（全血2ml）， 標(biāo)本管聯(lián)號、姓名等與申請單不相符， 使用肝素抗凝的標(biāo)本， 標(biāo)本采集后送檢時間超過2小時、且未低溫保存者 2、拒收程序 填寫相關(guān)的記錄表、告之相關(guān)科室、人員重采標(biāo)本,常見標(biāo)本的處理與保存,一、血清（漿）標(biāo)本 1、HBV-DNA樣本處理與保存：可按照一般的血清標(biāo)本處理程序，對測定影響不大。 2、HCV-RNA樣本處理與保存：血清標(biāo)本則需盡快（2h內(nèi)）分離血清，EDTA抗凝的全血標(biāo)本在6h內(nèi)分離血漿，血清（漿）從采血管中取出，另管保存。血清（漿）的分離應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行，生物安全柜在使用前應(yīng)進(jìn)行清潔消毒程序，并紫外線照射20min以上，吸取血清（漿）的吸頭須

8、為無菌和無RNase的帶濾芯的吸頭，所用容器可為一次性無菌離心管。 標(biāo)本短期（1-2周）可保存在-20下，較長期應(yīng)保存在-70 下。,常見標(biāo)本的處理與保存,二、巨細(xì)胞病毒標(biāo)本 可用于檢測的臨床標(biāo)本有血液、尿液、母乳、支氣管洗液、咽拭子等。 血液：采抗凝血（EDTA）2-5ml，用淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行外周單個核細(xì)胞制備。 尿液：最好是第1次晨尿（5-10ml），1500r/min離心5min，取中上層尿液至EP管中，72h內(nèi)檢測放2-5。 咽拭子：用無菌的一次性拭子采集，加入1-2ml無菌生理鹽水浸泡5-10min,振蕩后將棉拭子擠干，然后把洗液移至1.5mlEP管中， 72h內(nèi)檢測放2-5。應(yīng)盡

9、可能在發(fā)病初期采集上述標(biāo)本，越早越好。（發(fā)病初期，病毒含量高，檢測檢出率高） 母乳：取樣10ml， 1500r/min離心5min，離心后小心吸取中下層至EP管（注意避免沾入上層脂肪）， 72h內(nèi)檢測放2-5。,常見標(biāo)本的處理與保存,三、EB病毒-DNA 常用于EB病毒PCR檢測的標(biāo)本可有鼻咽分泌物、外周血、尿液的上皮脫落細(xì)胞等。 血液：采抗凝血（EDTA）2-5ml，用淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行外周單個核細(xì)胞制備。 鼻咽拭子：用無菌的一次性拭子采集，加入1-2ml無菌生理鹽水浸泡5-10min,振蕩后將棉拭子擠干，然后把洗液移至1.5mlEP管中， 72h內(nèi)檢測放2-5。 其它體液：可按水樣標(biāo)本的方

10、式離心取沉淀用作提取核酸。,常見標(biāo)本的處理與保存,四、性病類（HPV-DNA、HSV-DNA） 使用一次性無菌拭子采樣，加入1-2ml無菌生理鹽水浸泡5-10min,振蕩后將棉拭子擠干，然后把洗液移至1.5mlEP管中， 72h內(nèi)檢測放2-5。 如標(biāo)本為EP管采樣，直接存放于2-5冰箱 五、肺炎支原體-DNA 咽拭子：與CMV-DNA同樣處理 肺泡灌洗液：1500r/min離心10min，去上清 待檢樣本在-20保存不超過24h。,測定前質(zhì)量控制,實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境要求： 1、實(shí)驗(yàn)室的各個區(qū)域必須是相互獨(dú)立的； 2、各區(qū)的儀器設(shè)備及各種物品必須是專用的； 3、各區(qū)間不能直通，應(yīng)有緩沖間，供換工作服及

11、鞋子用； 4、進(jìn)入各個工作區(qū)必須遵循嚴(yán)格的順序，只能按單一方向進(jìn)行，即從試劑準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)擴(kuò)增間擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)； 5、產(chǎn)物分析區(qū)應(yīng)安裝排風(fēng)扇或其它抽風(fēng)裝置。,測定前質(zhì)量控制,儀器設(shè)備管理： 1、儀器應(yīng)有定期的維護(hù)和校準(zhǔn)，使其能處于一個良好的狀態(tài)。如：為保證加樣準(zhǔn)確，加樣器應(yīng)保持足夠的準(zhǔn)確度和精密度，并定期校準(zhǔn)。 2、實(shí)驗(yàn)用的消耗品也要達(dá)到相應(yīng)的要求。例如： 離心管：如果含有PCR擴(kuò)增抑制物，用其提取的核酸標(biāo)本有可能會出現(xiàn)假陰性結(jié)果或定量結(jié)果偏低。 帶濾心吸頭：能阻止吸樣時所產(chǎn)生的氣溶膠對加樣器頭部的污染，進(jìn)而造成標(biāo)本間的交叉污染。,測定前質(zhì)量控制,實(shí)驗(yàn)室的日常工作核查： 尤其要注意避免實(shí)驗(yàn)室

12、的污染，污染的概念有二： 通常的空氣中的灰塵、細(xì)菌和標(biāo)本的濺出等污染； 以前擴(kuò)增產(chǎn)物的遺留污染。 前者可依靠日常的清潔工作即可做到，后者除了對實(shí)驗(yàn)室空間的分區(qū)處，嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室管理和對實(shí)驗(yàn)操作的嚴(yán)格要求也是必不可少的。,測定前質(zhì)量控制,理想的試劑 所使用的PCR試劑盒的質(zhì)量對測定結(jié)果的影響是直接而又極為關(guān)鍵。 1、內(nèi)在因素：標(biāo)本處理（核酸提?。┓椒?、用于核酸擴(kuò)增的原材料及方法學(xué)設(shè)計(jì)。 2、外在因素：試劑盒出廠以后，在運(yùn)輸和運(yùn)輸中的貯存、實(shí)驗(yàn)室的貯存等諸環(huán)節(jié)，任一環(huán)節(jié)的不當(dāng)，均會影響試劑盒的臨床使用質(zhì)量。,測定中的核酸提取,核酸提取是決定擴(kuò)增檢測的關(guān)鍵性步驟。 通常，核酸制備質(zhì)量不高是由于抑制物去

13、除不完全所致，抑制物的來源可見于標(biāo)本本身（如血紅素或降解產(chǎn)物）或核酸提取過程中殘留的有機(jī)溶劑（如酚、氯仿等），這些物質(zhì)對其后的酶反應(yīng)步驟具有強(qiáng)烈的抑制作用，從而影響靶核酸的擴(kuò)增測定。,測定中的核酸提取,1、標(biāo)本制備最好是在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，可防止標(biāo)本氣溶膠的擴(kuò)散。 氣溶膠：是分散在氣體介質(zhì)中的微粒 。 2、在實(shí)驗(yàn)操作過程中，手套要經(jīng)常更換，因手套的污染很容易導(dǎo)致標(biāo)本間的交叉污染。如：在打開及蓋裝有核酸模板樣本的離心管時，手套指尖很容易污染，造成交叉污染。 3、在核酸提取中要加入有效性的質(zhì)控。 如：弱陽性質(zhì)控、陰性質(zhì)控、室間質(zhì)控等。,擴(kuò)增及產(chǎn)物分析,一、嚴(yán)格遵守商品試劑盒確定的條件進(jìn)行擴(kuò)增； 二

14、、通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析： 1、根據(jù)試劑盒要求先確定基本的基線和域值； 2、初步分析未知模板的定量結(jié)果，根據(jù)當(dāng)時曲線的情況，可適當(dāng)調(diào)整域值 3、查看此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的斜率、截距、r值是否在合理范圍，查看空白管、弱陽性管、質(zhì)控管結(jié)果是否在預(yù)知范圍，如結(jié)果都在控，結(jié)果可報。,基本概念,1、線性基線期：為PCR擴(kuò)增最初的10-15個循環(huán),此時,PCR反應(yīng)處于起始階段,擴(kuò)增產(chǎn)物很少,所產(chǎn)生的熒光信號很低。 2、指數(shù)期：PCR達(dá)到其最大的擴(kuò)增階段，理想條件下，每一循環(huán)后，PCR產(chǎn)物倍比增加。 3、Ct值：指的是實(shí)時監(jiān)測擴(kuò)增過程的熒光信號達(dá)到指數(shù)擴(kuò)增時的循環(huán)周期數(shù)。 4、標(biāo)準(zhǔn)曲線：使用一系列稀釋的

15、已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品與臨床標(biāo)本同時進(jìn)行測定,待測標(biāo)本的濃度則可根據(jù)其測定的Ct值,從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到其濃度。,基本概念,域值：為了便于對所檢測樣本進(jìn)行比較，在PCR反應(yīng)的指數(shù)期，首先需設(shè)定一定熒光信號的域值，一般這個域值（threshold）是以PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號（baseline），熒光域值的缺省設(shè)置是315個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍 。 擴(kuò)增效率E：指的是一個循環(huán)后的產(chǎn)物增加量與這個循環(huán)的模板量的比值，其值位于0-1。在PCR的前20或30個循環(huán)中，E值比較恒定，為指數(shù)擴(kuò)增期，隨后E值逐步降低，直至0，此時PCR達(dá)到平臺期，不再擴(kuò)增。,質(zhì)控物使用的功能,

16、弱陽性質(zhì)控樣本最常見的失控原因： 1、核酸提取中的隨機(jī)誤差。如核酸提取中的丟失、有機(jī)溶劑的去除不徹底、標(biāo)本中擴(kuò)增抑制物的殘留等。 2、儀器的問題。如擴(kuò)增儀孔間溫度的不均一性、孔內(nèi)溫度與所示溫度的不一致性等。 3、試劑的問題。如Taq酶和/或反轉(zhuǎn)錄酶的失活、探針的純度及標(biāo)記效率和核酸提取試劑的效率等。,質(zhì)控物使用的功能,陰性原血清質(zhì)控樣本的功能： 1、監(jiān)測實(shí)驗(yàn)室的以前擴(kuò)增產(chǎn)物的“污染”； 2、由實(shí)驗(yàn)操作所致的標(biāo)本間的交叉污染； 強(qiáng)陽性標(biāo)本氣溶膠經(jīng)加樣器所致的污染 強(qiáng)陽性標(biāo)本經(jīng)操作者的手所致的污染 使用翻蓋離心管核酸提取時在較高溫孵育時蓋子崩開 3、擴(kuò)增反應(yīng)試劑的污染 陰性質(zhì)控檢測如為陽性，說明上

17、述3外環(huán)節(jié)中有可能一個或幾個問題存在，但并不能區(qū)別究竟在哪點(diǎn)上發(fā)生了污染，所以在實(shí)驗(yàn)中帶入一個空白管。,質(zhì)控物使用的功能,空白管的功能： 1、反應(yīng)液空白管1：可監(jiān)測試劑是否受“污染”。 2、試劑空白管2：在整個實(shí)驗(yàn)過程中，開口放置于核酸提取的操作臺面區(qū)域內(nèi)30-60min，然后進(jìn)行擴(kuò)增，如出現(xiàn)陽性，在反應(yīng)液管1為陰性的情況下，提示可能存在有實(shí)驗(yàn)室污染。,定量PCR檢測結(jié)果分析及解釋,如何分析患者測定結(jié)果 模向分析：主要是與相關(guān)檢測指標(biāo)的一致性，HBV-DNA與乙肝“兩對半”；HCV-RNA與抗-HCV、HCV-核心抗原等。 縱向分析：患者以往相同項(xiàng)目的檢測結(jié)果,定量PCR檢測結(jié)果分析及解釋,有

18、典型擴(kuò)增曲線但很弱陽性樣本,弱陽性樣本的重復(fù)檢測,簡單重復(fù)：把低值的標(biāo)本再做一次 原因探討性重復(fù)：加大樣本量重做一次,如何判斷乙肝患者抗病毒治療療效？,當(dāng)一個HBV-DNAPCR定量檢驗(yàn)結(jié)果為7.2E+08IU/ml的乙肝患者，在抗病毒藥物如拉米夫啶或干擾素治療，兩周后，再檢測，如結(jié)果為5.2E+08IU/ml，再兩周后，結(jié)果為9.0E+08IU/ml，抗病毒治療有效嗎？,如何判斷乙肝患者抗病毒治療療效,血清（漿）HBV-DNA濃度與傳染性強(qiáng)弱的問題,109拷貝/ml，日常生活密切接觸強(qiáng)傳染性。 105 106拷貝/ml，日常生活密切接觸傳染性小。 105 拷貝/ml，日常生活密切接觸幾乎沒有

19、什么傳染性危險性。 但不管HBV-DNA的濃度為多少，那怕是低于相應(yīng)PCR方法的測定下限，也均會引起輸血后的感染。,總 結(jié)（一）,臨床PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量保證是實(shí)驗(yàn)室的一個核心活動，要做好質(zhì)量保證，最重要的是必須要了解影響測定質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)室過程的所有步驟，整個實(shí)驗(yàn)過程的最薄弱的環(huán)節(jié)將反應(yīng)整個的測定質(zhì)量。,總 結(jié)（二）,質(zhì)量保證（QA）：為使臨床醫(yī)師和患者相信檢驗(yàn)報告的準(zhǔn)確及時而采取的必要的一系列的有計(jì)劃的檢驗(yàn)質(zhì)量控制措施。 規(guī)范標(biāo)本采集、運(yùn)送、保存程序，保證樣本的收集方式和標(biāo)本的穩(wěn)定可靠性，這些因素在保證測定結(jié)果的可靠性與測定中的影響因素具有同等的重要性。,Thank you,謝謝大家!,注：

20、文本框可根據(jù)需求改變顏色、移動位置；文字可編輯,POWERPOINT模板 適用于簡約清新及相關(guān)類別演示,1,2,3,4,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,目錄,點(diǎn)擊添加標(biāo)題,點(diǎn)擊添加標(biāo)題,點(diǎn)擊添加標(biāo)題,點(diǎn)擊添加標(biāo)題,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文

21、本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,注：文本框可根據(jù)需求改變顏色、移動位置；文字可編輯,POWERPOINT模板 適用于簡約清新及相關(guān)類別演示,1,2,3,4,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,點(diǎn)擊添加文本,目錄,點(diǎn)擊添加標(biāo)題,點(diǎn)擊添加標(biāo)題,點(diǎn)擊添加標(biāo)題,點(diǎn)