mTOR和eIF4E蛋白在大腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義.doc

mTOR和eIF4E蛋白在大腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義【摘要】目的研究真核翻譯啟動(dòng)因子eIF4E(eukaryoticinitiationfactor4E)和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白mTOR(mammaliantargetofrapamycin,mTOR)在結(jié)直腸癌中的表達(dá)和其對(duì)應(yīng)的臨床病理之間相互關(guān)系，尋找在大腸癌的發(fā)生、進(jìn)展過(guò)程中eIF4E及mTOR的作用；研究?jī)烧咧g的有無(wú)關(guān)系。方法外科手術(shù)中獲取大腸癌組織及癌旁組織各60例（要求手術(shù)患者在手術(shù)前未進(jìn)行全身化療、放療及其他治療），采用逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)及酶聯(lián)免疫法檢測(cè)大腸癌組織及癌旁組織中mTOR和eIF4E基因的RNA水平和蛋白水平表達(dá)變化。結(jié)果1、分別用RT-PCR法和酶聯(lián)免疫法檢測(cè)結(jié)果顯示：大腸癌組織中mTOR和eIF4E基因的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<；0.05)。mTOR和eIF4E基因RNA表達(dá)與性別、年齡、臨床TNM分期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>；0.05)，在不同腫瘤分化程度以及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<；0.05)。2.相關(guān)性分析顯示mTOR和eIF4E在大腸癌中的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(P<；0.05)。結(jié)論mTOR和eIF4E基因的過(guò)度表達(dá)在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，mTOR和eIF4E基因的表達(dá)與大腸癌的分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有相關(guān)性；聯(lián)合檢測(cè)兩者在大腸癌中的表達(dá)可能有助于惡性程度的評(píng)估與預(yù)后判斷?！娟P(guān)鍵詞】大腸癌mTOReIF4E職稱論文大腸癌是發(fā)生于大腸部位的常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，居于消化道道腫瘤的第3位。mTOR信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的生存信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,該通路的激活與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、逃避凋亡、耐藥及血管生成密切相關(guān)1。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶(mammaliantargetofrapamycin,mTOR)和真核細(xì)胞翻譯起始因子(eukaryoticinitiationfactor4E)是mTOR信號(hào)通路中的兩個(gè)重要的分子2，3。本實(shí)驗(yàn)擬觀察試圖通過(guò)收集大腸癌及癌旁組織中對(duì)mTOR信號(hào)通路的mTOR、eIF4E兩個(gè)基因的檢測(cè)，更進(jìn)一步完善對(duì)大腸癌組織的早期診斷和預(yù)后判斷提供一個(gè)新的思路。1對(duì)象與方法1.1研究對(duì)象收集2010年l0月至2012年6月來(lái)自烏海市第三人民醫(yī)院的結(jié)腸癌根治術(shù)后癌及癌旁標(biāo)本各60例其中男28例、女32例，年齡2280歲，按全國(guó)結(jié)直腸癌協(xié)作組1986年標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分類，其中高分化l6例，中分化26例，低分化18例，TNM分期、期分別為13、23和24例，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例。1.2實(shí)驗(yàn)方法按一步Trizol法提取樣本組織的RNA：按說(shuō)明書(shū)配制20ul的RT反應(yīng)液（反應(yīng)液配制請(qǐng)?jiān)诒线M(jìn)行）。1TotalRNA用量為1ug。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下:3715min，855sec按說(shuō)明書(shū)配制50ul的PCR反應(yīng)液，9430sec，56*15sec，25Cycle7230sec。設(shè)循環(huán)25個(gè),實(shí)驗(yàn)采用GAPDH片段作為內(nèi)參照。mTOR、eIF4E、GAPDH引物采用Oligo軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，由invitrogen公司合成（具體序列見(jiàn)表一）。取PCR產(chǎn)物5ul，加5xLoadingBuffer2ul，2%瓊脂糖凝膠電泳110V，100mA，25min，凝膠成像儀成像并保存結(jié)果。表1PCR引物詳細(xì)序列：1.3按酶聯(lián)免疫法（ELISA）試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)mTOR,eIF4E基因蛋白表達(dá)計(jì)算：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD值，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣本的OD值，在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度，也可以使用各種應(yīng)用軟件來(lái)計(jì)算。最終濃度為實(shí)際測(cè)定濃度乘以稀釋倍數(shù)。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，兩組以上比較采用方差分析，相關(guān)分析采用直線相關(guān)分析法分析。以SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P<；0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果RT-PCR、Elisa法檢測(cè)大腸癌及癌旁組織mTOR、eIF4E基因RNA水平的表達(dá)和蛋白表達(dá)結(jié)果一致。結(jié)果顯示：大腸癌mTOR、eIF4E基因表達(dá)量結(jié)果一致，癌組織明顯高于癌旁組織，差異顯著有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<；005）（見(jiàn)圖1，2，表2，4）。相對(duì)應(yīng)內(nèi)參基因GAPDH表達(dá)無(wú)差異（見(jiàn)圖3）。大腸癌組織中mTOR、eIF4E基因表達(dá)與年齡、性別、TNM分期無(wú)關(guān)(P>；0.05)，與組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<；0.05)（詳見(jiàn)表3,5）。mTOR基因和eIF4E基因相關(guān)性分析：60例大腸癌標(biāo)本RT-PCR法檢測(cè)mTOR基因和eIF4E基因灰度值相關(guān)性分析統(tǒng)計(jì)處理后結(jié)果為：r=0.892，P0.05，二者呈明顯正相關(guān)性。同樣用Elisa法檢測(cè)mTOR基因和eIF4E基因OD值相關(guān)性分析統(tǒng)計(jì)處理后結(jié)果為：r=0.563，P0.05，二者呈明顯正相關(guān)性圖-1，2，3mTOR基因、eIF4E基因、GAPGH內(nèi)參RT-PCR電泳圖表格2RT-PCR法大腸癌及癌旁組織mTOR和eIF4E基因總RNA表達(dá):(n=60，)注：*P<；0.01VS癌旁組表3eIF4E和mTOR基因RNA的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系注：P1為mTOR基因，P2為eIF4E基因表格4Elisa法檢測(cè)大腸癌及癌旁組織mTOR、eIF4E基因蛋白水平的表達(dá)結(jié)果（n=60，）。.注：*P<；0.01VS癌旁組表5eIF4E和mTOR基因蛋白的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系注：P1為mTOR基因，P2為eIF4E基因3討論結(jié)直腸癌是目前最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率表現(xiàn)為明顯上升趨勢(shì)。目前結(jié)直腸癌的主要根據(jù)Dukes分期或TNM分期兩種分期方法來(lái)進(jìn)行預(yù)后的估計(jì)，治療方案的選擇也是主要根據(jù)此分期系統(tǒng)進(jìn)行的。多基因和多因素的共同作用可能是導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生、以及進(jìn)展的因素。其中各種致癌的因素和環(huán)境的因素通過(guò)協(xié)同、序貫的方法導(dǎo)致細(xì)胞局部可復(fù)性的DNA傷害；進(jìn)一步促發(fā)原癌基因的激活、抑癌基因的滅活，以及凋亡基因、凋亡抑制基因功能的改變，引起腫瘤細(xì)胞的惡性生長(zhǎng)。目前許多學(xué)者認(rèn)為在腫瘤的發(fā)生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮相當(dāng)重要作用兩個(gè)因素是細(xì)胞的化生和腫瘤周邊微血管生成4。本研究通過(guò)RT一PCR和酶聯(lián)免疫法等方法，分別從RNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)檢測(cè)大腸癌及正常組織中mTOR基因的表達(dá)，結(jié)果顯示：mTOR基因RNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)無(wú)論是在大腸癌組織還是正常組組織中表現(xiàn)為高度一致性，大腸癌癌組織中mTOR基因呈現(xiàn)出過(guò)度表達(dá)，但是在于正常大腸組織中mTOR表達(dá)微弱，與上述有關(guān)參考文獻(xiàn)研究結(jié)果一致。mTOR基因的RNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)在兩組中均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。mTOR基因的表達(dá)量與年齡、性別、TNM分期無(wú)關(guān)(P>；0.05)，與組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<；0.05)。由此思考本研究可以在大腸癌的診斷及相關(guān)預(yù)后判斷上提供一定的參考價(jià)值。本研究通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和酶聯(lián)免疫法兩種方法分別檢測(cè)RNA水平和蛋白表達(dá)水mTOR和eIF4E基因在大腸癌組織及正常組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示：mTOR和eIF4E基因在大腸癌組織中同時(shí)過(guò)度表達(dá)，呈明顯正相關(guān)，與此同時(shí)，mTOR和eIF4E基因在大腸癌旁組織中同時(shí)低表達(dá)或者表達(dá)缺失，同樣呈明顯正相關(guān)。說(shuō)明mTOR的過(guò)度激活導(dǎo)致了eIF4E的表達(dá)上調(diào)，從而可能成為大腸癌的形成的關(guān)鍵原因之一。有上述結(jié)果可以大膽猜想，同時(shí)抑制mTOR和eIF4E基因的表達(dá)及其相關(guān)生物性活性極有可能成為預(yù)防和或治療大腸癌的有效途徑之一，本實(shí)驗(yàn)為創(chuàng)新大腸癌的治療提供一個(gè)新的思路以及一點(diǎn)相應(yīng)的生物學(xué)依據(jù)。mTOR信號(hào)通路主要通過(guò)兩種信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖：PI3K/Akt依賴型途徑和PI3K/Akt非依賴型途徑5。被激活后的mTOR可以調(diào)節(jié)其兩條處于下游的通路：核糖體S6蛋白激酶)和真核細(xì)胞始動(dòng)因子4E結(jié)合蛋白1(4EBP1)。目前4EBPl和S6K1是最深入研究的mTOR的底物，它們是蛋白翻譯的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子6。其中4EBP1是mTOR的第一個(gè)下游底物，是一種翻譯抑制因子，它通過(guò)與翻譯啟動(dòng)因子4E(eIF4E,eukaryotictranslationinitiationfactor4E)的結(jié)合而抑制翻譯啟動(dòng)抑制蛋白翻譯7。正常情況下，eIF4E和其抑制物4E-BPs的結(jié)合形成復(fù)合物，從而不能觸發(fā)帽依賴性翻譯；而激活后的mTOR使其下游引物4EBPs磷酸化后,導(dǎo)致eIF4E和4EBPs的分離,從而解除對(duì)翻譯的抑制作用8?？赡苁悄[瘤形成的原因之一。4結(jié)論mTOR和eIF4E的異常表達(dá)在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，mTOR和eIF4E的表達(dá)與大腸癌的分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)；聯(lián)合檢測(cè)兩者在大腸癌中的表達(dá)有助于惡性程度的評(píng)估與預(yù)后判斷。參考文獻(xiàn)1LazaLffskaratzasA，SKathleen，SonenbergN：MalignanttransformationbyaneukaryoticinitiationfactorsubunitthatbindstomRNA5capNature1990，345：54472MarotrigianlJ，GingrasAC，SonenbergN，BurleySK：CocrystalstructureofthemessengerRNA5capbindingprotein(elF4E)boundto7-methylGDPCell1997，89：951613SarbassovDD，AiiSM，KimDH，eta1.Rictor，anovelbindingpartnerofmTOR,definesarapamycin-insensitiveandraptor-independentpathwaythatregulatesthecytoskeletonJ.CurrBiol，2004，14(14)：1296-13024LewisJD，IzaurraldeE：TheroleofthecapstructureinRNAprocessingandnuclearexportEurJBiochem1997，247：46195WullschlegerS，LoewithR，HallMNmTORsignalingingrowthandmetabolismJCell，2006，124：4714846ParkEH,WalkerSE,ZhouF,LeeJM,RajagopalV,LorschJR,HinnebuschAG.YeastEukaryoticInitiationFactor(eIF)4BEnhancesComplexAssemblybetweeneIF4AandeIF4GinVivoJ.JBiolChem.2012Nov26.Epubaheadofprint7PaezJ，SellersWRPI3KPTENAKTpathwayAcriticalmediatorofon