shRNA抑制COX2基因表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2生長(zhǎng)的影響.doc

shRNA抑制COX2基因表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2生長(zhǎng)的影響作者：楊義明劉預(yù)涂植光陳亞芹劉靳波【摘要】目的：應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制COX2基因，觀察其對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2生長(zhǎng)的影響.方法：構(gòu)建靶向抑制COX2基因表達(dá)的短發(fā)夾雙鏈RNA(shRNA)真核表達(dá)載pshRNACOX2，轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HepG2，用RTPCR和WesternBlot分別從mRNA和蛋白水平檢測(cè)其對(duì)COX2的抑制效應(yīng)，MTT法檢測(cè)對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響.結(jié)果：與未轉(zhuǎn)染組相比，pshRNACOX2重組表達(dá)質(zhì)粒抑制了HepG2細(xì)胞COX2mRNA及蛋白表達(dá)，抑制率分別為69.9和50.3；并可抑制HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)，72h后有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<；0.05).結(jié)論：pshRNACOX2重組表達(dá)載體能顯著抑制肝癌細(xì)胞COX2基因表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖.【關(guān)鍵詞】RNA干擾；重組表達(dá)載體；環(huán)氧化酶2；肝腫瘤【Abstract】AIM:Toinvestigatetheeffectsofinhibitionofcyclooxygenase2（COX2）withRNAinterference(RNAi)onthegrowthofhepatocellularcarcinomaHepG2cells.METHODS:TheeukaryoticexpressionplasmidofshorthairpinRNA(shRNA)targetingCOX2gene(pshRNACOX2)wasconstructedandtransfectedintohepatocellularcarcinomaHepG2cells；theexpressionsofCOX2mRNAandproteinweredetectedwithreversetranscriptionalpolymerasechainreaction(RTPCR)andWesternBlotassay,respectively.ThegrowthofHepG2cellswasdetectedbyMTT.RESULTS:Comparedwithuntransfectedgroup,recombinantexpressionvectorpshRNACOX2resultedinthereductionofCOX2mRNAandproteinby69.9%and50.3%respectively,andthegrowthofHepG2cellswassignificantlyinhibitedafter72h(P<；0.05).CONCLUSION:RecombinantexpressionvectorpshRNACOX2cansignificantlyinhibittheexpressionofCOX2gene,andsuppressthegrowthoftumorcells.【Keywords】RNAinterference；recombinantexpressionvcectors；cyclooxygenase2；liverneoplasms0引言環(huán)氧化酶（cyclooxygenase,COX）是催化花生四烯酸生成前列腺素的限速酶，包括COX1和COX2兩種同工異構(gòu)體.近年來研究表明，許多腫瘤，如結(jié)腸癌，乳腺癌，前列腺癌，肺癌，肝癌等COX2呈高表達(dá)狀態(tài)，并在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中起重要的作用1-6.研究表明選擇性COX2抑制劑可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡，而成為腫瘤基因治療的靶點(diǎn).我們采用RNA干擾(RNAi)技術(shù)抑制COX2基因表達(dá)，觀察對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，為利用RNA干擾技術(shù)作為腫瘤基因治療途徑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).1材料和方法1.1材料真核表達(dá)質(zhì)粒pGenesil1購(gòu)于武漢晶賽公司，含有人鼠人共用U6啟動(dòng)子和編碼綠色熒光蛋白的報(bào)告基因.COX2靶基因序列：AACATGGAATTACCCAGTTTG.shRNA轉(zhuǎn)錄DNA模板：正向鏈為5GATCCCATGGAATTACCCAGTTTGTTCAAGAGACAAACTGGGTAATTCCATGTTTTTGTCGAA3,反向鏈為5AGCTTGTCGACAAAAACATGGAATTACCCAGTTTGTCTCTTGAACAAACTGGGTAATTCCATGG3，以上片段由上海生工公司合成.經(jīng)Blast與現(xiàn)有人類基因無同源性的序列：5GACTTCATAAGGCGCATGC3作為陰性對(duì)照，稱為HK（武漢晶賽合成）.肝癌細(xì)胞株HepG2,大腸桿菌JM109由本實(shí)驗(yàn)室保存.RPMI1640（Hyclone），新生小牛血清（杭州四季青公司產(chǎn)品），陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000(Invitrogen)，Hind,BamH,RTPCR試劑（大連寶生物公司產(chǎn)品），COX2一抗（SantaCruz產(chǎn)品），COX2二抗,DAB顯色試劑（北京中杉公司產(chǎn)品）.肝癌細(xì)胞株HepG2用含100mL/L小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基于37，50mL/LCO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿瓶底80左右時(shí)傳代.1.2方法將合成的單鏈DNA片段用退火緩沖液稀釋，等摩爾混合.945min，緩慢降至室溫形成互補(bǔ)雙鏈.Hind，BamH雙酶切質(zhì)粒pGenesil1，凝膠回收大片段線性DNA，T4連接酶4過夜連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109,鋪含卡那霉素的LB抗性板培養(yǎng)16h，挑取菌落,增菌,提取質(zhì)粒,酶切鑒定并測(cè)序確認(rèn).實(shí)驗(yàn)分為3組：未轉(zhuǎn)染細(xì)胞HepG2組，pshRNACOX2組，陰性對(duì)照HK組.用2.5g/L的胰酶常規(guī)消化對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，稀釋成1108/L,每孔2mL，接種于六孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞鋪滿80左右時(shí)轉(zhuǎn)染.首先用無血清無雙抗RPMI1640培養(yǎng)基洗滌2遍.質(zhì)粒4g，加無血清無雙抗RPMI1640培養(yǎng)基250L，脂質(zhì)體10L，加無血清無雙抗RPMI1640培養(yǎng)基250L，靜置5min,將二者輕輕混勻，靜置20min，加六孔入培養(yǎng)板常規(guī)培養(yǎng)，46h換生長(zhǎng)培養(yǎng)液，24h轉(zhuǎn)種培養(yǎng)瓶.G418篩選：初始終濃度800mg/L,4d左右大部分未轉(zhuǎn)染細(xì)胞將被處死，維持終濃度400mg/L，23wk收集細(xì)胞，供RTPCR和WesternBlot分析.1.2.1腫瘤細(xì)胞中COX2mRNA和蛋白的檢測(cè)常規(guī)胰酶消化收集細(xì)胞，冷PBS洗滌2遍，按試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA.PCR：COX2引物序列：P1：5TTCAAATGAGATTGTGGGAAAAT3,P2:5AGATCATCTCTGCCTGAGTATCTT3,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度304bp.內(nèi)參actin引物序列：P1：5GGGACCTGACTGACTACCTC3P2：5CGTCATACTCCTGCTTCCTG3，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度543bp.PCR循環(huán)：9440s,5530s,7250s,38個(gè)循環(huán).WesternBlot主要步驟：用RIPA（含PMSF蛋白酶抑制劑）細(xì)胞裂解液提取總蛋白，蛋白變性上樣，行100g/L十二烷基硫酸鈉聚丙烯胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)NC膜，用50g/L脫脂奶粉的TBST封閉2h,加COX2多抗（1200），4過夜，TBST洗滌3次（10min/次），二抗（15000）室溫2h，洗滌3次，每次10min，DAB顯色.數(shù)碼照相.1.2.2MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況用2.5g/L胰酶將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞消化下來，稀釋成1108個(gè)/L，轉(zhuǎn)種96孔板，每孔200L，置于37,50mL/LCO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別于24,48,72,96,168h時(shí)，每孔加終濃度為5g/LMTT200L，繼續(xù)培養(yǎng)3h，終止反應(yīng).棄去上清液，加DMSO200L/孔，充分振蕩10min，酶標(biāo)儀（波長(zhǎng)570nm）測(cè)定吸光度A值.每組3個(gè)復(fù)孔，取其平均吸光度A值，比較個(gè)組細(xì)胞生長(zhǎng)情況.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：RTPCR和WesternBlot結(jié)果用Quantityone軟件分析灰度值，計(jì)算抑制率.MTT結(jié)果采用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間均數(shù)比較用單因素方差分析，P<；0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.2結(jié)果2.1psRNACOX2重組質(zhì)粒測(cè)序和轉(zhuǎn)染挑取卡那霉素抗性板上生長(zhǎng)的菌落，增菌并提取質(zhì)粒，Hind,BamH雙酶切切出400bp左右的DNA片斷，經(jīng)測(cè)序插入片斷序列正確（圖1）.pshRNACOX2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48h時(shí)，轉(zhuǎn)染率為50%左右（圖2）.2.2shRNACOX2重組質(zhì)粒對(duì)COX2表達(dá)的影響與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，pshRNACOX2重組質(zhì)粒對(duì)actin無抑制作用，而對(duì)靶基因COX2mRNA有明顯的抑制作用，抑制率為69.9，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞與陰性對(duì)照之間沒有差異（圖3A）.與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，actin及陰性對(duì)照HK幾乎無變化，而轉(zhuǎn)染pshRNACOX2質(zhì)粒的細(xì)胞COX2蛋白表達(dá)水平明顯下降，抑制率為50.3（圖3B）.2.3pshRNACOX2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞增值的影響與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，pshRNACOX2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，24,48h時(shí)吸光度A值變化不明顯，而72h后吸光度A值明顯下降.說明72h后細(xì)胞增殖開始得到抑制.轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒HK的細(xì)胞與未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染后24,48,72,96,168h細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖均未受到影響（圖4）.3討論RNA干擾（RNAinterference,RNAi）是通過雙鏈RNA介導(dǎo)同源性mRNA的特異性降解，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默，作為一種高效、特異的基因調(diào)節(jié)技術(shù)，目前已經(jīng)成為研究基因功能的有力工具.RNAi現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)也為腫瘤的基因治療提供了新的方法.利用RNAi技術(shù)抑制hTERT,Survivin的表達(dá)，可以起到抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡，達(dá)到治療腫瘤的目的7-8，顯示出RNAi技術(shù)在腫瘤基因治療中的巨大潛力.小干擾RNA（smallinterferingRNA,siRNA）可在哺乳細(xì)胞中誘導(dǎo)特異性基因沉默.siRNA可通過化學(xué)合成、體外轉(zhuǎn)錄或核酸內(nèi)切酶降解等途徑合成，但化學(xué)合成成本昂貴，內(nèi)切酶可導(dǎo)致非特異性效應(yīng)，且有siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染介導(dǎo)的沉默效應(yīng)持續(xù)時(shí)間短的缺點(diǎn).如果將轉(zhuǎn)錄siRNA的DNA模板克隆至RNA聚合酶III的下游，可在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生小RNA分子，通過自身折疊形成發(fā)夾樣（hairpin）結(jié)構(gòu)，即內(nèi)源性siRNA,可與靶基因結(jié)合降解mRNA，實(shí)現(xiàn)靶基因的持續(xù)抑制，可克服上述缺點(diǎn).我們將靶向抑制COX2基因的siRNA的DNA轉(zhuǎn)錄模板插入到質(zhì)粒pGenesil2的U6啟動(dòng)子下游，轉(zhuǎn)錄的mRNA通過自身折疊形成發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)（shRNA）,經(jīng)Dicer酶切割形成siRNA,供探討其對(duì)靶基因COX2抑制效應(yīng).我們構(gòu)建的靶向抑制COX2基因的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HepG2后COX2基因及蛋白顯著下調(diào)，抑制率分別為69.9和50.3，而對(duì)內(nèi)參基因actin沒有影響，提示利用RNAi技術(shù)抑制COX2基因表達(dá)是切實(shí)可行的.MTT實(shí)驗(yàn)顯示，pshRNACOX2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞72h后，細(xì)胞增殖明顯減慢，與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組相比有顯著性差異（P<；0.05），并可持續(xù)至少1wk.本研究表明，利用RNAi技術(shù)可抑制COX2表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖，為高表達(dá)COX2基因的惡性腫瘤基因治療新途徑提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù).基金項(xiàng)目：重慶市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2006BB5271）【參考文獻(xiàn)】1SinghB,BerryJA,ShoherA,etal.COX2overexpressionincreasesmotilityandinvasionofbreastcancercellsJ.IntJOncol,2005,26(5):1393-1399.2郭貴龍，姚榛祥，吳堅(jiān).環(huán)氧化酶2基因在人乳腺癌中的表達(dá)及臨床意義J.中華醫(yī)學(xué)雜志,2003，83（19）：1661-1664.3LuS,YuG,ZhuY,etal.Cyclooxygenase2overexpressioninMCF10Fhumanbreastepithelialcellsinhibitsproliferation,apoptosisanddifferentiation,andcausespartialtransformationJ.IntJCancer,2005,116(6):847-852.4YuanA,YuCJ,ShunCT,etal.Totalcyclooxygenase2mRNAlevelstumorangiogenesisandprognosisinnonsmallcelllungcancerpatientsJ.IntJCancer,2005,115(4):545-555.5WangW,BerghA,DamberJE.Cycloogenase2expressioncorrelateswithlocalchronicinflammationandtumorneovascularizationinhumanprostatecancerJ.ClinCancerRes,2005,11(9):3250-3256.6Iwamot