大鼠心臟中神經(jīng)肽Y的Y1 受體樣免疫反應(yīng)物質(zhì)的定位.doc

大鼠心臟中神經(jīng)肽Y的Y1受體樣免疫反應(yīng)物質(zhì)的定位作者：鮑嵐張平程希平張旭【關(guān)鍵詞】心臟關(guān)鍵詞:心臟；大鼠；Y1受體；神經(jīng)肽Y摘要:目的為在細(xì)胞水平精確地確定神經(jīng)肽Y（NPY）的Y1受體樣免疫反應(yīng)物質(zhì)（-LI）在大鼠心臟中的分布.方法用免疫組織化學(xué)方法對(duì)Y1受體-LI細(xì)胞進(jìn)行了檢測(cè).結(jié)果一些心肌細(xì)胞含有Y1受體-LI，可見(jiàn)清晰的Y1受體免疫反應(yīng)性（-Ir）條紋，此類細(xì)胞在心臟呈斑點(diǎn)狀分布，接近外膜側(cè)和室間隔的內(nèi)膜側(cè)分布較多，Y1受體-LI主要分布于心肌細(xì)胞膜、橫小管膜和小泡上；心臟內(nèi)有Y1受體-LI的心內(nèi)神經(jīng)元，此類細(xì)胞有較長(zhǎng)的突起，呈離散分布，與Y1受體-LI心肌細(xì)胞或血管相鄰，Y1受體-LI神經(jīng)元的外膜和胞質(zhì)內(nèi)有較強(qiáng)的Y1受體-LI，尤以其突起明顯.結(jié)論NPY對(duì)心臟作用的復(fù)雜性可能與Y1受體在心臟中多種細(xì)胞的廣泛分布有關(guān).Keywords:heart；rats；Y1receptor；neuropeptideYAbstract:AIMToaccuratelylocalizeneuropeptideY（NPY）Y1receptor（-R）-likeimmunoreactivity（-LI）inrathearts.METHODSY1-Rimmunoreactive（-Ir）cellswereexaminedwithimmunohistochemistry.RESULTSY1-R-LIwasobservedinsomecardiomyocytesofratheartswithastripe-likepatterninthecells.Thesecellswerescatteredintheheart，especiallyneartheoutermembraneoftheheartandtheinnermembraneofinterventricularseptum.Y1-R-LIwasmainlydistributedovertheplasmalemmaofthecellandTtube，andsmallvesicles.Ontheotherhand，thereweredispersedY1-R-Irintrinsicneuronswithlongprocessesintheheart，sometimesclosetomyocardialcellsorbloodvessels.HighlevelofY1-R-LIwasobservedneartheplasmalemmaandthecytoplasmofneurons，especiallyintheirprocesses.CONCLUSIONThecomplicatedeffectsofNPYontheheartmayberelatedtotheextensivedistributionofY1recep-torinvariedcellsoftheheart.0引言含神經(jīng)肽Y（NPY）的神經(jīng)纖維分布于整個(gè)心臟1.通常情況下，NPY與去甲腎上腺素（NA）共存于交感神經(jīng)元，但大鼠心臟中約有半數(shù)的NPY神經(jīng)纖維不與NA共存，而存在于心內(nèi)神經(jīng)元中2.根據(jù)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，NPY對(duì)心臟的作用至少通過(guò)兩種以上的受體介導(dǎo)，即Y1，Y2和Y3等受體3.通過(guò)受體放射自顯影方法觀察到心臟有Y1受體的結(jié)合點(diǎn)4，用分子原位雜交方法也觀察到人類心臟中有表達(dá)Y1受體的mRNA5.但由于已往的檢測(cè)方法對(duì)組織定位的精確性不夠，無(wú)法在細(xì)胞水平精確地確定受體的位置.本研究用針對(duì)Y1受體C末端肽片段的一種純化的抗血清6，7，用免疫組織化學(xué)方法研究大鼠心肌細(xì)胞和心內(nèi)神經(jīng)元Y1受體的分布.1材料和方法1.1免疫光鏡組織化學(xué)方法SD大鼠（體質(zhì)量200250g）10只（本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），戊巴比妥鈉（50mg・；kg-1，ip）麻醉，經(jīng)心臟灌注37生理鹽水50mL和含40g・；L-1多聚甲醛的0.1mol・；L-1磷酸緩沖液（PB）50mL，再灌注4同樣固定液250mL，取心臟，放入4同樣固定液后固定1.5h，200g・；L-1蔗糖浸泡24h以上，用冰凍切片機(jī)（Leica，德國(guó)）切20m的心臟矢狀和冠狀切片.根據(jù)免疫組織化學(xué)方法，將切片放入針對(duì)Y1受體C末端肽片段的一種純化的兔抗血清（18000）6-8中，用生物素標(biāo)記的羊抗兔血清（1200）和VectorABC盒（Vector實(shí)驗(yàn)室，美國(guó)）孵育，用葡萄糖氧化酶、二甲基聯(lián)苯胺（DAB）和硫酸鎳胺加強(qiáng)法顯色，標(biāo)記物質(zhì)呈深藍(lán)色，經(jīng)干燥、透明和DPX封片.在NikonMicrophot-FX顯微鏡下觀察標(biāo)本，Leica圖像處理系統(tǒng)（Leica-Q570C，德國(guó)）取像，出照片.1.2免疫電鏡組織化學(xué)方法SD大鼠4只，麻醉、灌注和后固定同上，固定液為含50mL・；L-1戊二醛和40g・；L-1多聚甲醛的PB.取心臟，切50100m振動(dòng)切片.免疫組織化學(xué)方法處理同上，進(jìn)行常規(guī)DAB反應(yīng)，標(biāo)記物質(zhì)呈棕色.在10g・；L-1鋨酸中處理30min，經(jīng)梯度乙醇和環(huán)氧丙烷脫水后，在Epon812中浸潤(rùn)，做平板包埋，聚合后在光鏡下定位，取材，在LKB超薄切片機(jī)上切片，不做鉛鈾染色，在JEOL-1200電子顯微鏡下觀察，拍照，出照片.用制備抗體用的合成的Y1受體C末端多肽片段以1mol・；L-1與Y1受體抗體預(yù)吸收24h（4）后，做以上免疫組織化學(xué)反應(yīng)，以此檢驗(yàn)抗血清免疫標(biāo)記的特異性.2結(jié)果2.1心肌細(xì)胞大鼠心臟內(nèi)一些心肌細(xì)胞可見(jiàn)中等強(qiáng)度的藍(lán)黑色著色，為Y1受體-LI（Fig1），可見(jiàn)清晰的Y1受體-Ir標(biāo)記條紋，為心肌細(xì)胞內(nèi)橫小管結(jié)構(gòu)，有的與心臟內(nèi)Y受體-LI血管相鄰（Fig2）.左右心房、左右心室、房間隔、室間隔和房室瓣膜上均有Y1標(biāo)記-Ir心肌細(xì)胞，此類細(xì)胞在心臟呈散在的不均勻分布，近心外膜側(cè)分布較多（Fig3），尤以左心室最明顯，室間隔近心內(nèi)膜的兩側(cè)分布也較多.在電鏡下可以觀察到一些心肌細(xì)胞的外膜上有精細(xì)和間斷的Y1受體-LI標(biāo)記，近胞質(zhì)處有顆粒樣的Y1受體-LI標(biāo)記物，也可見(jiàn)正在內(nèi)吞的有Y1受體-LI標(biāo)記的小泡（Fig4）.在橫小管兩側(cè)膜上有Y1受體-LI標(biāo)記（Fig5），常在相鄰的數(shù)個(gè)橫小管中同時(shí)出現(xiàn)，也可間隔出現(xiàn).2.2神經(jīng)元大鼠心臟內(nèi)有較強(qiáng)標(biāo)記的Y1受體-Ir神經(jīng)元（Fig6，7），這些神經(jīng)元體積小，并有多個(gè)突起，有的突起較長(zhǎng)，此類細(xì)胞在心臟內(nèi)呈離散分布，單個(gè)存在，常與Y1受體-Ir心肌細(xì)胞相鄰（Fig6）.左右心房、左右心室、房間隔和室間隔上均有此類Y1受體-Ir神經(jīng)元，但在竇房結(jié)和房室結(jié)周圍未見(jiàn)大量的Y1受體-Ir神經(jīng)元.心內(nèi)神經(jīng)元胞體的外膜有較深的點(diǎn)狀Y1受體-LI標(biāo)記，其突起的外膜處也有斷續(xù)的Y1受體-LI標(biāo)記，較胞體外膜多（Fig8）.胞體的胞質(zhì)內(nèi)有一些與Y1受體-LI標(biāo)記的外膜相臨的Y1受體-Ir小泡，也有一些顆粒狀和塊狀的Y1受體-LI，神經(jīng)元的胞核在胞體中占較大部分，有時(shí)在胞膜和胞核間的狹小空間內(nèi)充滿了Y1受體-Ir結(jié)構(gòu).突起的胞質(zhì)內(nèi)有較強(qiáng)的Y1受體-Ir結(jié)構(gòu)，有時(shí)充滿了一小段突起，有許多Y1受體-Ir小泡，另有一些顆粒狀結(jié)構(gòu).這些含Y1受體-LI的心內(nèi)神經(jīng)元可以與周圍的心肌細(xì)胞相臨，在心肌細(xì)胞與之相臨面可見(jiàn)外膜有Y1受體-LI（Fig8）；Y1受體-LI的心內(nèi)神經(jīng)元也可與心內(nèi)血管相臨，有時(shí)與血管腔只有一層內(nèi)皮細(xì)胞之隔（Fig9）.用經(jīng)預(yù)吸收后的抗血清孵育組織切片，并做免疫組織化學(xué)反應(yīng)后未見(jiàn)有以上描述的陽(yáng)性結(jié)構(gòu).3討論NPY受體與心臟的變時(shí)和變力作用有關(guān)9.我們提供了Y1受體存在于心肌細(xì)胞和心內(nèi)神經(jīng)元的直接形態(tài)學(xué)證據(jù).在通常情況下，Y1受體-LI心肌細(xì)胞和心內(nèi)神經(jīng)元呈散在的不均勻分布，靠心肌外膜側(cè)較多，左右心房、左右心室、房間隔、室間隔和房室瓣膜上均有分布.Y1受體在心臟的多種細(xì)胞和廣泛分布為NPY對(duì)大鼠心臟變時(shí)和變力作用的多樣性9提供了一定的依據(jù).許多以往的研究顯示心臟組織有大量的NPY免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)纖維，心房多于心室10.同時(shí)有研究表明心臟具有多種NPY受體，如受體放射自顯影配基結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果顯示心室膜有NPY的結(jié)合位點(diǎn)，用選擇性的Y2受體激動(dòng)劑NPY（13-36）結(jié)合指示此為Y2受體；又如在心室肌，其NPY受體對(duì)PYY和NPY的親合性存在差別，而到目前為止Y1和Y2受體對(duì)PYY和NPY幾乎具有同樣的親合性，因此認(rèn)為在心室肌的結(jié)合位點(diǎn)為Y3受體11.藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)心臟內(nèi)有多種NPY受體，大鼠心肌細(xì)胞至少存在兩種接后（postjunctional）NPY受體，Y1可能介導(dǎo)NPY對(duì)心肌細(xì)胞的負(fù)性收縮反應(yīng)12.本研究證實(shí)大鼠心肌細(xì)胞有Y1受體，但呈散在分布，未見(jiàn)心房?jī)?nèi)有許多Y1受體-Ir的心肌細(xì)胞，似與心臟內(nèi)NPY神經(jīng)纖維的密集和區(qū)域密集分布不匹配，有可能這些心肌細(xì)胞表達(dá)其他類型的NPY受體.此外，Y1受體-Ir心肌細(xì)胞散在分布于較多的Y1受體陰性心肌細(xì)胞中，NPY是如何通過(guò)具有Y1受體的心肌細(xì)胞對(duì)整體心肌產(chǎn)生作用尚待進(jìn)一步研究.圖1圖9略在電鏡下可清晰地觀察到大鼠一些心肌細(xì)胞的外膜和橫小管膜上及胞質(zhì)中有Y1受體-LI，且存在于小泡中.Y1受體為G蛋白偶聯(lián)超家族受體，NPY作用于接后Y1受體時(shí)，通過(guò)抑制性的G蛋白，可能對(duì)心肌產(chǎn)生負(fù)性肌力作用9，在這一過(guò)程中，均可引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子變化.通常情況下，心肌細(xì)胞經(jīng)橫小管將興奮傳向終池，使肌漿網(wǎng)膜上的鈣泵活動(dòng)，肌漿內(nèi)的鈣離子濃度發(fā)生改變，從而引起心肌一系列變化13.NPY可能通過(guò)作用于心肌外膜和橫小管膜上的Y1受體，對(duì)心肌收縮力產(chǎn)生影響.我們的研究表明，大鼠心臟有較強(qiáng)的Y1受體-Ir神經(jīng)元，并具有較長(zhǎng)的突起，可能為心內(nèi)神經(jīng)元，心內(nèi)神經(jīng)元主要為迷走神經(jīng)的節(jié)后神經(jīng)元，可單個(gè)存在.有研究報(bào)道心內(nèi)神經(jīng)元中有NPY反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元14，因此來(lái)自心內(nèi)神經(jīng)元自分泌或旁分泌的NPY對(duì)其自身有調(diào)節(jié)作用，也可對(duì)其周圍的心肌細(xì)胞產(chǎn)生作用，這也為Y1受體可以是接前（prejunctional）受體提供了新的證據(jù).已有的研究發(fā)現(xiàn)大鼠心臟有一種小強(qiáng)熒光細(xì)胞位于心肌細(xì)胞之間，有的在有孔毛細(xì)血管周圍，可釋放兒茶酚胺或其他物質(zhì)到組織間隙或血管內(nèi)，以內(nèi)分泌和旁分泌的方式起局部調(diào)節(jié)作用15.我們的研究發(fā)現(xiàn)Y1受體-LI的心內(nèi)神經(jīng)元可與心內(nèi)血管相臨，特別是有時(shí)與血管腔只有一層內(nèi)皮細(xì)胞之隔，因此Y1受體-LI的心內(nèi)神經(jīng)元也可能是此小強(qiáng)熒光細(xì)胞，NPY通過(guò)對(duì)接前Y1受體的作用，除對(duì)乙酰膽堿的釋放起調(diào)節(jié)作用外，對(duì)兒茶酚胺或其他物質(zhì)的釋放也起調(diào)節(jié)作用.參考文獻(xiàn):1WhartonJ，GulbenkianS.Peptidesinthemammaliancardiovas-cularsystemJ.ExperentiaSuppl，1989；56:292-316.2CorrLA，AberdeenJA，MilnerP，LincolnJ，BurnstockG.SympatheticandnonsympatheticneuropeptideY-containingnervesintheratmyocardiumandcoronaryarteriesJ.CircRes，1990；66（6）:1602-1609.3GrundemarL，HakansonR.MultipleneuropeptideYreceptorsareinvolvedincardiovascularregulation.PeripheralandcentralmechanismsJ.GenPharm，1993；24（4）:785-796.4WahlestedtC，RegunathanS，ReisDJ.IdentificationofculturedselectivelyexpressingY1-，Y2-orY3-typereceptorsforneu-ropeptideY/peptideYYJ.LifeSci，1992；50（4）:PL7-PL12.5WhartonJ，GordonL，ByrneJ，HerzogH，SelbieLA，MooreK，SullivanMH，ElderMG，MoscosoG，TaylorKM.Expres-sionofthehumanneuropeptidetyrosineY1receptorJ.ProcNaltAcadSciUSA，1993；90（2）:687-691.6ZhangX，BaoL，XuZQ，KoppJ，ArvidssonU，EldeR，Hok-feltT.LocalizationofneuropeptideYY1receptorsintheratnervoussystemwithspecialreferencetosomaticreceptorsonsmalldorsalrootganglionneuronsJ.ProcNatlAcadSciUSA，1994；91（24）:11738-11742.7BaoL，KoppJ，ZhangX，XuZQ，ZhangLF，WongH，WalshJ，HokfeltT.LocalizationofneuropeptideYY1receptorsincerebralbloodvesselsJ.ProcNatlAcadSciUSA，1997；94（23）:12661-12666.8BaoL，LinYH，ZhangX.DistributionofneuropeptideYY1re-ceptor-likeimmunoreactivityinratcoronarybloodvesselsJ.Di-siJunyiDaxueXuebao（JFourthMilMedUniv），2000；20（1）:1-5.9McDermottBJ，MillarBC，PiperHM.Cardiovasculareffectsofneur