參黃沖劑對(duì)衰老患者P16 基因mRNA 表達(dá)及臨床療效的影響.doc

參黃沖劑對(duì)衰老患者P16基因mRNA表達(dá)及臨床療效的影響韓旭李七一郭宏敏賴仁勝艾炳蔚苑志軍孫云霞張彪尤峰屠浩明江蘇省中醫(yī)院（中國(guó)210029）中圖分類號(hào)：R22.34文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：18180086（2012）01摘要：目的應(yīng)用基因測(cè)序技術(shù)，通過觀察參黃沖劑對(duì)衰老患者P16基因mRNA定量表達(dá)等相關(guān)內(nèi)環(huán)境指標(biāo)影響與個(gè)體反應(yīng)差異的相關(guān)性，評(píng)價(jià)參黃沖劑在延緩衰老方面的作用和臨床療效。方法采用隨機(jī)、單盲、對(duì)照研究方法，共選擇60例符合條件的衰老患者納入研究及統(tǒng)計(jì)分析。所有患者被隨機(jī)分為參黃沖劑治療組和對(duì)照治療組，每組30人。參黃沖劑組進(jìn)行常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用參黃沖劑治療（江蘇省中醫(yī)院協(xié)定處方），每次10，每日3次。對(duì)照組進(jìn)行常規(guī)系統(tǒng)治療，并給予甲磺酸雙氫麥角毒堿片，每次1mg，每日3次。各組均連續(xù)服藥8周為1個(gè)療程，觀察時(shí)間為1個(gè)療程。結(jié)果衰老患者腎陰虛、腎陽(yáng)虛2種證型P16基因的序列特征未見突變改變。參黃沖劑組治療后衰老患者P16基因mRNA擴(kuò)增曲線起始循環(huán)數(shù)（ct值）明顯變大（p0.05）；參黃沖劑組治療后腎陰虛、腎陽(yáng)虛兩種證型P16基因mRNA擴(kuò)增曲線起始循環(huán)數(shù)（ct值）未見明顯差異（p0.05）。參黃沖劑組與對(duì)照組在治療前的衰老患者P16基因mRNA定量表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)，二者之間具有可比性；在治療后兩組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。兩組治療后衰老患者臨床療效比較，參黃沖劑組30例，顯效3例，有效21例，無效6例，總有效率80.0；對(duì)照組30例，顯效1例，有效12例，無效17例，總有效率43.3；經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩組間有效率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p0.05）。1.2兩組年齡對(duì)比參黃沖劑治療組年齡最高80歲，最低62歲；對(duì)照組年齡最高78歲，最低60歲；兩組年齡分布沒有顯著性差異（p0.05）。1.3兩組證型對(duì)比參黃沖劑治療組腎陰虛型14例，腎陽(yáng)虛型16例；對(duì)照組腎陰虛型12例，腎陽(yáng)虛型18例；兩組證型分布沒有顯著性差異（p0.05）。兩組在性別、年齡、證型分布上皆具有可比性。2診斷標(biāo)準(zhǔn)和癥狀量化分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)2.1衰老的辨證診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照“中醫(yī)虛證參考標(biāo)準(zhǔn)”1制定，分為腎陽(yáng)虛證、腎陰虛證2個(gè)證型。腎陽(yáng)虛證:腰膝酸軟、性欲減退、畏寒肢冷、夜尿頻多、下肢浮腫、腰膝酸軟、精神萎靡、動(dòng)則氣短，舌質(zhì)淡，脈弱。腎陰虛證：頭目眩暈、視力模糊、耳鳴或耳聾、腰膝酸軟、身疲乏力、煩熱汗出、咽干便燥、脫發(fā)或發(fā)白、失眠健忘、性功能減退、尿后余瀝或不禁，齒搖或齒落、膚燥身癢、常易外感、震顫肢麻，舌質(zhì)紅，脈細(xì)。2.2衰老癥狀量化分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：參照“延緩衰老中藥的篩選規(guī)程和臨床觀察規(guī)范中有關(guān)腎虛評(píng)分部分”2制定。重度:主動(dòng)說出或顯著、持續(xù)出現(xiàn)，為3分；中度:時(shí)重時(shí)輕，間斷出現(xiàn)，為2分；輕度:癥狀較輕或偶爾出現(xiàn)，為1分；無癥狀為0分。舌脈中任何一項(xiàng)出現(xiàn)者均為3分。用治療前后衰老積分值的變化來反映衰老程度的變化。針對(duì)衰老癥狀的嚴(yán)重程度和動(dòng)態(tài)變化分級(jí)記分。3治療方案治療組：常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用參黃沖劑（江蘇省中醫(yī)院協(xié)定處方，江蘇江陰天江制藥有限公司制成中藥配方顆粒），每次10，每日3次。對(duì)照組：常規(guī)治療的基礎(chǔ)上給予甲磺酸雙氫麥角毒堿片（瑞士諾華制藥有限公司生產(chǎn)），每次1mg，每日3次。各組均連續(xù)服藥8周為1個(gè)療程，每7天復(fù)診一次。觀察時(shí)間為1個(gè)療程。4療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)“中醫(yī)證候的臨床研究指導(dǎo)原則證候療效判定標(biāo)準(zhǔn)”3，采用積分法評(píng)價(jià)中醫(yī)證候療效。療前積分-療后積分療效指數(shù)（N）=100%療前積分顯效:癥狀積分下降2/3以上；N70%。有效:癥狀積分量降1/3-2/3；N30%70%。無效:未能達(dá)到上述有效標(biāo)準(zhǔn)，N30%。5觀察項(xiàng)目及指標(biāo)檢測(cè)方法5.1觀察項(xiàng)目臨床指標(biāo)：病史、癥狀、體征、舌質(zhì)、脈象。治療前病人隨機(jī)檢測(cè)P16基因的序列突變特征。各組治療前后P16基因mRNA定量表達(dá)的變化。各組治療前后臨床療效和癥狀積分。5.2指標(biāo)檢測(cè)及觀察方法5.2.1P16基因測(cè)定采用基因測(cè)序方法。標(biāo)本收集：抽取患者靜脈血2ml，試管內(nèi)含抗凝劑（肝素或EDTA）模板DNA的提取：用Omega公司血液基因組DNA提取試劑盒，按說明提取DNA，應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)DNA純度，再用eppendorf核酸定量?jī)x測(cè)定DNA濃度（260nm吸光率大于0.05以上，DNA含量大于2.0ug/ul，吸光率A260/A280比值1.6-1.8之間，320nm波長(zhǎng)處吸光率接近為0）PCR擴(kuò)增:引物的設(shè)計(jì)與合成:根據(jù)NCBI相關(guān)文獻(xiàn)提供的研究結(jié)果，確定候選的基因片段，利用genebank上提供的序列設(shè)計(jì)引物，由上海生物合成.序列為P1（上游引物）:5，GAATAAGTTACGGTCGGAG3，；P2（下游引物）：5，CGGTGACTGATGATCTAAG3，。PCR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度401bp。PCR反應(yīng)體系（總體系20ul）：10PCRBuffer（含15mMMgCL2）2ul，HotStarTaqDNAPolymerase（QIAGEN公司）0.2ul，5Q-Solution4ul，dNTPmi（10mMofeach）2ul，Primer11ul，Primer21ul，模版DNA1ul，Distilledwater8.8ul。PCR反應(yīng)條件：置ABI-q700型擴(kuò)增儀中95預(yù)變性15min，用TouchdownPCR，94。C變50sec，63。C-58。C退火1min（-0.5。C/1min，72。C延伸1min，共循環(huán)10次，94。C變性50sec，57。C退火1min，共循環(huán)30次，最后于72。C延伸10min）。PCR產(chǎn)物純化：用1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是否為單一目的條帶，根據(jù)Axygen公司提供的PCR純化試劑盒，對(duì)PCR產(chǎn)物過柱純化后，進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。測(cè)序反應(yīng):反應(yīng)體系:2.8ulBigDye1.6ulBigDyeSeqBuffer0.3ul引物+1ulPCR純化產(chǎn)物+6.3ulddH2O。測(cè)序熱循環(huán)條件：96。C，10sec（96。C10sec50。C5sec60。C4min）25個(gè)循環(huán)60。C，4min4。C保溫。測(cè)序反應(yīng)后純化:每管加入1ul125mMEDT到管底，再加入1ul3MNaAc每管加入100ul100%乙醇，封口膜封嚴(yán)密，震蕩混勻4次，室溫放置15min4000rpm離心45min，馬上倒置96孔1200rpm離心1min重復(fù)第4步驟1次室溫?fù)]發(fā)凈酒精，加入10ulHi-DiFormamide溶解DNA樣品在95。C變性4min，迅速置冰中冷卻4min。基因測(cè)序：電泳前，在數(shù)據(jù)采集軟件（Datecollection2.0）中選擇正確的運(yùn)行模塊和分析模塊。樣品制備，上樣至3100-Avant遺傳分析儀進(jìn)行電泳。Datecollection軟件自動(dòng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。結(jié)果分析：將測(cè)序結(jié)果用DNAsequencinganalysis5.1自動(dòng)分析原始測(cè)序數(shù)據(jù)，獲得測(cè)序電泳圖和序列。將樣品序列用DNAseqcape與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，觀察樣本基因序列的改變。5.2.2P16基因mRNA表達(dá)檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)P16基因mRNA表達(dá)。提取血液中總RNA?？俁NA的濃度及純度鑒定。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：反應(yīng)體系及反應(yīng)程序：Gdna1l,總RNA1.0g，混勻，42孵育2min，primer0.5l,RTose0.5l,RT10Buffer2l,加水至總體積10l。4230min；955min；-20保存。RealTime反應(yīng)SYBR法：反應(yīng)體系：cDNA(RNA反轉(zhuǎn)錄所得cDNA)1L,SYBRmix2.5L，上下游primer各0.25l,H2O1L,總體積5L。PCR循環(huán)參數(shù)：502min9510min(9215sec601min)40個(gè)循環(huán)。ABI7900熒光定量PCR儀擴(kuò)增、軟件操作反應(yīng)體系，分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。6統(tǒng)計(jì)分析的內(nèi)容和方法6.1統(tǒng)計(jì)分析內(nèi)容研究分析衰老患者2種不同證型的P16基因的序列突變特征和mRNA定量表達(dá)的變化。研究分析中藥干預(yù)后，不同證型和P16基因的關(guān)聯(lián)性；中藥干預(yù)后衰老患者2種不同證型P16基因mRNA表達(dá)的變化，P16基因mRNA表達(dá)變化對(duì)中藥干預(yù)反應(yīng)的差異。研究分析衰老患者2種證型與P16基因mRNA表達(dá)變化及P16基因型療效關(guān)聯(lián)性。研究分析中藥干預(yù)后衰老2組患者的臨床綜合療效。6.2統(tǒng)計(jì)分析方法描述性統(tǒng)計(jì)分析，定性指標(biāo)以頻數(shù)表，百分率或構(gòu)成比描述；定量指標(biāo)以均數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)差，或中位數(shù)，下四分位數(shù)（Q1），上四分位數(shù)（Q3），最小值，最大值描述。P16基因頻率計(jì)數(shù)法，等位基因頻率的比較采用X2檢驗(yàn)。兩組對(duì)比分析，定性資料采用卡方檢驗(yàn)，F(xiàn)isher精確概率法，Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，CMH2檢驗(yàn)，WLS協(xié)方差。定量資料符合正態(tài)分布用t檢驗(yàn)（組間進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，以0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，方差不齊時(shí)選用Satterthwaite方法進(jìn)行校正的t檢驗(yàn)），不符合正態(tài)分布用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)；GLM協(xié)方差。多組間比較方差分析，組間兩兩比較用q檢驗(yàn)；等級(jí)資料用秩和檢驗(yàn)。各組治療前后比較用配對(duì)t檢驗(yàn)。以上統(tǒng)計(jì)分析均SAS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。7治療結(jié)果7.1衰老患者2種不同證型的P16基因的序列特征（圖1圖2）從圖1圖2中表明，腎陰虛、腎陽(yáng)虛2種證型P16基因的序列特征未見明顯差異。圖1腎陰虛證型P16基因測(cè)序圖圖2腎陽(yáng)虛證型P16基因測(cè)序圖7.2衰老患者2種不同證型的P16基因mRNA定量表達(dá)的比較（圖38）從圖3至8中表明，參黃沖劑組治療后衰老患者P16基因mRNA擴(kuò)增曲線起始循環(huán)數(shù)（ct值）明顯變大，對(duì)照組治療后衰老患者P16基因mRNA擴(kuò)增曲線起始循環(huán)數(shù)（ct值）無明顯差異。參黃沖劑組治療后腎陰虛、腎陽(yáng)虛兩種證型P16基因mRNA擴(kuò)增曲線起始循環(huán)數(shù)（ct值）未見明顯差異。圖3治療前參黃沖劑組衰老患者P16基因mRNA擴(kuò)增曲線圖4治療后參黃沖劑組衰老患者P16基因mRNA擴(kuò)增曲線圖5治療前對(duì)照組衰老患者P16基因mRNA擴(kuò)增曲線圖6治療后對(duì)照組衰老患者P16基因mRNA擴(kuò)增曲線圖7治療后參黃沖劑組腎陰虛衰老患者P16基因mRNA擴(kuò)增曲線圖8治療后參黃沖劑組腎陽(yáng)虛衰老患者P16基因mRNA擴(kuò)增曲線7.3兩組治療前后衰老患者P16基因mRNA定量表達(dá)比較（表1）表1兩組治療前后衰老患者P16基因mRNA定量表達(dá)比較（S）分組治療前治療后參黃沖劑組對(duì)照組26.201.3739.902.3426.571.5927.971.90治療前兩組比較p0.05，治療后與對(duì)照組比較p0.05)；治療后二組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05由表2可以看出，治療后兩組衰老主要證型腎陰虛、腎陽(yáng)虛P(yáng)16基因mRNA定量表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。7.5兩組治療后衰老患者臨床療效比較（表3）表3兩組治療后衰老患者臨床療效比較組別例數(shù)顯效有效無效有效率（）參黃沖劑組30321680.0對(duì)照組301121743.3兩組間比較p0.05由表3可見，參黃沖劑組30例，顯效3例，有效21例，無效6例，總有效率80.0；對(duì)照組30例，顯效1例，有效12例，無效17例，總有效率43.3。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩組間有效率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p0.01）。8討論人體衰老是各系統(tǒng)生理性和病理性衰老的總和表現(xiàn)，同時(shí)受著諸多內(nèi)外環(huán)境因素的制約，兩者同時(shí)存在，相互影響，從而加速了衰老的進(jìn)程。隨著分子生物學(xué)迅速發(fā)展，機(jī)體內(nèi)環(huán)境因素對(duì)衰老影響的科學(xué)研究日趨重視和深入，特別是衰老的主導(dǎo)基因p16mRNA表達(dá)等相關(guān)內(nèi)環(huán)境指標(biāo)與衰老的發(fā)生發(fā)展以及機(jī)體對(duì)藥物干預(yù)產(chǎn)生的個(gè)體反應(yīng)差異受到廣泛關(guān)注。人體衰老與p16基因mRNA表達(dá)等相關(guān)內(nèi)環(huán)境指標(biāo)具有密切相關(guān)性4。p16基因是Serrano等5利用酵母雙雜交蛋白相互作用掃描技術(shù)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)陽(yáng)性cDNA克隆、編碼分子量15845kDa并含有4個(gè)錨蛋白(ankyrin)重復(fù)序列的蛋白質(zhì)。由于該基因產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞周期蛋白激酶4（CDK4）活性具有抑制作用，因而稱為p16INK4(INK4，inhibitorofCDK4)，并進(jìn)一步證實(shí)了p16INK4和CDK4相關(guān)的特異性。Kamb等6利用染色體步移技術(shù)和定向測(cè)量技術(shù)，在人類染色體9p21處發(fā)現(xiàn)一個(gè)與p16INK4序列完全相同的區(qū)域，命名為多腫瘤抑制基因(multipletumorsuppressor，MTS1)。Mcconnell7研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞衰老時(shí)pl6mRNA表達(dá)明顯增高，當(dāng)年輕細(xì)胞中導(dǎo)入pl6基因可出現(xiàn)衰老表型；因此認(rèn)為pl6基因是細(xì)胞壽限的關(guān)鍵調(diào)控基因。而且，p16基因是人類細(xì)胞衰老遺傳控制程序中的主要環(huán)節(jié)之一，當(dāng)細(xì)胞衰老時(shí)，基因p16mRNA表達(dá)增高，能夠抑制細(xì)胞周期蛋白（cyclin）D1CDK4的活性，使靶蛋白不能磷酸化。隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的積累，p16基因表達(dá)逐漸上調(diào)，提示p16基因水平的升高是衰老即持續(xù)性端粒縮短的原因。Jiangming等8以p16基因正反義載體分別轉(zhuǎn)染年輕的人成纖維細(xì)胞(2BS)，發(fā)現(xiàn)p16基因mRNA過表達(dá)抑制了RB磷酸化引起細(xì)胞早衰，而其反義載體轉(zhuǎn)染可以延緩細(xì)胞衰老，抑制p16基因mRNA表達(dá)，則端粒長(zhǎng)度縮短減慢，DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)，而端粒酶并未被激活，從而初步闡明了p16基因mRNA表達(dá)等內(nèi)環(huán)境因素影響衰老進(jìn)程的機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，衰老患者腎陰虛、腎陽(yáng)虛2種證型P16基因的序列特征未見突變改變。參黃沖劑組治療后衰老患者P16基因mRNA擴(kuò)增曲線起始循環(huán)數(shù)（ct值）明顯變大（p0.05）。參黃沖劑組治療后腎陰虛、腎陽(yáng)虛兩種證型P16基因mRNA擴(kuò)增曲線起始循環(huán)數(shù)（ct值）未見明顯差異（p0.05）；參黃沖劑組與對(duì)照組在治療前的衰老患者P16基因mRNA定量表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)，二者之間具有可比性；在治療后兩組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。治療后兩組衰老主要證型腎陰虛、腎陽(yáng)虛P(yáng)16基因mRNA定量表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)，這證明參黃沖劑可減少P16基因mRNA的表達(dá)，其機(jī)制可能是通過抑制衰老細(xì)胞的增殖而達(dá)到延緩衰老的作用，從而起到抗衰老的作用；但參黃沖劑對(duì)衰老主要證型腎陰虛、腎陽(yáng)虛基因表達(dá)無顯著差異，同時(shí)本研究也證明P16基因是人類細(xì)胞衰老遺傳控制程序中的主要環(huán)節(jié)之一。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)