銅對wnt6 基因表達及鵝羽絨生產(chǎn)性能影響的試驗方法.doc

銅對wnt6基因表達及鵝羽絨生產(chǎn)性能影響的試驗方法趙明(吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院長春吉林130118)摘要本文以吉林白鵝為研究對象，飼喂不同添加量銅日糧，結合Wnt6基因表達測定試探討銅對鵝羽絨的促生長作用，重點介紹試驗設計和試驗方法，并提出試驗難點和試驗預期。關鍵詞銅羽絨生產(chǎn)Wnt6基因表達試驗方法前言銅是人類歷史上最早使用的金屬，銅大量存在于各種巖石和礦物中，自然界中銅以CuO、Cu+、Cu2+二種氧化態(tài)形式互相轉化。在生物體中，銅是最基本的微量營養(yǎng)元素之一，大量研究表明1，2，銅至少存在于30多種酶中，銅通過多種酶參與機體的代謝、氧化磷酸化、自由基解毒、黑色素合成等過程，并能維持組織細胞的穩(wěn)定性。在動物生長發(fā)育，免疫功能等方面有重要作用3，4。自20世紀80年代以來，銅一直作為一種有效的促生長劑在畜禽養(yǎng)殖中被廣泛利用，高劑量銅己被認為是一種高效、廉價、使用方便的促生長劑。然而，不少的飼料添加劑廠家、畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)者為了追求效益，在飼料中盲目添加高銅，造成了畜禽銅中毒、亞臨床中毒的發(fā)生。2004年1月，歐盟法規(guī)限制了飼料中銅的添加量標準，鵝最大耐受量100mg/kg5,6。鵝羽絨品質和產(chǎn)量是一類非常重要的經(jīng)濟性狀，在性狀的形成過程中遺傳因素發(fā)揮著主要作用，但目前關于鵝羽絨性狀形成的遺傳調控機理和分子生物學基礎研究尚不多見。近幾年，在哺乳動物、人類和雞方面的研究表明Wnt/-catenin信號傳導途徑是調控毛囊形態(tài)發(fā)生和生長的核心通路，它所涉及的有關因子的基因變異及其表達調控對絨毛的生長發(fā)育具有重要的影響。然而，有些調控通路及其相關基因的分子生物學作用和調節(jié)機制仍然不清楚，而且有些信號分子在哺乳動物與禽類之間存在著較大差異7，8。因此，筆者依據(jù)自己的碩士論文，從銅的促羽絨生長和19種Wnt基因9選取Wnt6做基因表達試驗，試探討不同日糧銅添加量對鵝羽絨的促生長作用，以供有關專業(yè)同學參考，下面介紹實驗方法。1.材料與方法1.1試驗動物從100只2025周齡吉林白鵝中隨機選取24只，分為4組，每組6只，分別編號，稱體重，采用翻肛鑒別性別。1.2技術路線注示：CK（對照組）：試驗日糧0mg/kg銅添加量。T1（試驗一組）：試驗日20mg/kg銅添加量。T2（試驗二組）：試驗日50mg/kg銅添加量。T3（試驗三組）：試驗日80mg/kg銅添加量。附：不同Cu添加量日糧配置方法先根據(jù)整個試驗期計算好基礎日糧的總體飼喂量，根據(jù)下圖配方配好基礎日糧，再根據(jù)各試驗組不同的Cu添加量計算出每組試驗日糧的CuSO4.5H2O需要量，研磨成極細的粉末后采用逐級預混的方法配置，最后用混料機混合10分鐘以上，以保證Cu充分混勻，防止部分飼料中Cu含量超標，引起銅中毒。如果是夏天可以采用噴霧法配置，這樣保證銅混合充分均勻，但要及時對試驗日糧進行干燥處理，防止其受潮霉變。1.3基礎日糧配方1.4飼養(yǎng)試驗飼喂：第一次上料給水，8：00，只鵝給料量100150g；第二次上料給水，12：00，只鵝給料量100150g；第三次上料給水：16：00，只鵝給料量150200g。要求：（1）每天早晨上料前要清除前一天剩余飼料，并稱重。（2）每天早晨要清洗飲水器，然后一天三次加注凈水。（3）打掃衛(wèi)生、消毒：每天早晨飼喂前清除舍內糞便，清除的糞便堆積到指定地點，鵝舍每周消毒12次。（4）記錄：試驗期間（包括試驗準備期、預試期、試驗期、試驗后處理）。1.5試驗方法1.5.1拔毛部位劃分背部，包括頸部以后，翅膀與骼骨聯(lián)線以上的部位；胸部，在背部以下，后面以龍骨劍突為界；腹部，龍骨劍突以后，骸骨與坐骨聯(lián)線以下的部位10。1.5.2拔毛和采血1.5.2.1預試期(15天)結束后第一次拔毛，測量羽毛相關數(shù)據(jù)。試驗期(45天)結束后第二次拔毛，測量羽毛相關數(shù)據(jù)。1.5.2.2羽絨生長性狀的測量方法測量絨朵長：用千分卜尺量取絨朵根部至尖部長度。測量絨朵羽小枝的細度：將絨朵制成游離纖維玻片標本，用顯微纖維投影儀測每根羽枝的直徑，個個體每個部位測定50根羽小絲。測量千朵重：在每個部位隨機抽取1000個絨朵用力分之電子天平稱重。測定自然含水量：自然含水量(%)=原毛重量(g)-絕對干燥羽毛重量(g)/原毛重量(g)100測定耗氧指數(shù)：耗氧指數(shù)(氧的毫克數(shù)/100克試樣)=8100(A-B)N。測定含脂率：含脂率(%)=(抽提后+包重)-(抽提前十包重)/試樣重。附：鵝活體拔毛的方法：先給要拔絨的鵝用10ml注射器灌喂20ml高度白酒，觀察3-5分鐘后，等鵝反應遲緩后再進行拔絨，可以使鵝比較老實便于拔絨，酒精也可以使毛孔擴張方便拔絨，防止拔斷絨毛，保存絨朵完整。1.5.2.3采血：分離血清，檢測不同銅含量對血液乳酸脫氫酶(LDH)、谷丙轉氨酶(GPT)、谷草轉氨酶(GOT)、銅鋅超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)、銅藍蛋(CP)、谷朧甘膚過氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)活性的影響11。采集皮膚、提取毛囊RNA：分析不同劑量的銅對wnt6基因mRNA相對表達水平。1.5.3實驗室線圖采樣提取RNAOD值及濃度調濃度值（按最小濃度）翻轉成CDNA設計引物普通PCR摸索條件上機（熒光定量PCR）數(shù)據(jù)（分析）附：基因表達相關試驗采用試劑盒方法，對照試劑盒說明書按步驟進行即可。1.5.4資料處理對小同部位及各周齡絨朵長、羽小枝細度、千朵重進行差異顯著性比較。全部數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析由SPSS11.0軟件的One一二yANOVA程序完成。2.試驗的難點和預期2.1難點(1)添加多種維生素復合添加劑可以減少試驗鵝分組、飼喂不同日糧和第一次拔絨后的應激反應。(2)在低溫條件下要防止拔絨時傷到皮膚，使鵝凍傷，要保留羽毛。(3)提取RNA時要防止變性。2.2預期(1)在防止畜禽產(chǎn)品重金屬Cu殘留超過100mg/kg的標準基礎上，討論試驗組鵝羽絨促生長最佳添加量是試驗設計的哪個梯度，更具體的銅添加量有待進一步研究。(2)通過基因表達試驗測試wnt6是否是wnt基因組控制鵝羽絨生長的主控基因。Wnt6調節(jié)鵝近軸外胚層體節(jié)的發(fā)育和細胞的組織，是分化完成的關鍵，鳥類胚發(fā)育過程中，Wnt6誘導神經(jīng)脊的形成，如Wnt信號受到抑制則擾亂神經(jīng)脊的形成。在鵝的Wnt信號家族中，共存在多少種Wnt分子，其中哪幾種Wnt分子參與了羽絨發(fā)育調控過程，相應Wnt分子的激活和抑制因子如何，該途徑下游還與哪些調控因子有關等，有待于進一步研究。參考文獻1BonhamM，O，connorJM，HanniganBM，eta1.TheimmunesystemasaphysiologicalindicatorofmarginalcopperstatusJ.BritishJournalofNutrition.2002，87(3):393-403.2柴春彥，石發(fā)慶，劉國艷.搖擺病奶牛體內銅狀態(tài)及其與NO水平的關系J.黑龍江畜牧獸醫(yī).2001，7，1-3.3StabelJR，SpearsJW.EffectofcopperonimmuneFunctionanddiseaseresistanceJ.AdvancesExperimentalMedicineandBiology.1989，258(2):243-252.4PercivalSS.CopperandimmunityJ.AmericanJournalOfClinicalNutrition.1998，67(9):1064-1068.5丁伯良.動物中毒病理學M.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2001，189-190.6鄧科敏.實驗性鵝銅中毒機理研究D.西南大學，2008.7徐日福，吳偉，高光.鵝羽絨發(fā)生發(fā)育的分子調控機理研究進展.經(jīng)濟動物學報，第10卷，第2期.8徐日福，吳偉，徐慧.鵝羽絨生長發(fā)育調控機理研究進展.中國家禽，2006年，第28卷，第20期.9向陽，