5氟尿嘧啶對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用機(jī)制的研究.doc

5氟尿嘧啶對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用機(jī)制的研究作者：張德海張晴張翠云高振月【摘要】目的研究5氟尿嘧啶抑制人肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用方式。方法用不同濃度的5氟尿嘧啶處理體外培養(yǎng)的人肺癌A549細(xì)胞，應(yīng)用MTT法、倒置相差顯微鏡和吖啶橙染色法分析檢測(cè)A549細(xì)胞存活率的變化及細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果不同濃度的5氟尿嘧啶處理A549細(xì)胞，隨著藥物濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率明顯下降；且低濃度使細(xì)胞呈鋪展?fàn)顟B(tài)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)空泡增多，吖啶橙染色顯示酸性膜泡增多，高濃度使細(xì)胞變圓，出現(xiàn)凋亡狀態(tài)。結(jié)論5氟尿嘧啶能明顯抑制A549細(xì)胞的生長(zhǎng)，低濃度誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬，高濃度引起細(xì)胞凋亡?！娟P(guān)鍵詞】5氟尿嘧啶；肺癌；自噬；凋亡【Abstract】ObjectiveTostudytheinhibitiveeffectof5fluorouracilonthegrowthofhumanlungcarcinomacellsA549.MethodsWithdifferentconcentrationsof5fluorouracilinvitroprocessingofhumanlungcancerA549cells,MTTassay,invertedmicroscopeandacridineorangestainingwereusedtodeterminecellviabilityandmorphologicalchanges.ResultsUsingdifferentconcentrationsof5fluorouraciltodealwithA549cells,withtheincreaseindrugconcentrationandtreatmenttime,cellsurvivalratedecreasedsignificantly；andlowconcentrationof5fluorouracilinducedthecellspreadandincreasedvacuolizationwithinthecytoplasm,acridineorangestainingshowedanincreaseinacidicvesicles,highconcentrationmadethecellroundandcellapoptosis.Conclusion5fluorouracilinhibitedthegrowthofA549cellssignificantly,withautophagybylowconcentrationsandapoptosisbyhighconcentrations.【Keywords】5fluorouracil，lungcancer，autophagy，apoptosis5氟尿嘧啶(5fluorouracil,5Fu)是臨床上常見的抗腫瘤化療藥物，它可以抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)1,常用于治療結(jié)直腸癌、消化道癌、乳腺癌、絨毛膜上皮癌等多種惡性腫瘤。5Fu是一種嘧啶類似物,可在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化成不同的細(xì)胞毒性代謝產(chǎn)物，與DNA和RNA結(jié)合，從而干擾DNA和RNA的合成，從而起到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，但其抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制尚不清楚。近年來，國(guó)內(nèi)外許多研究表明，5氟尿嘧啶抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)是通過誘導(dǎo)細(xì)實(shí)現(xiàn)的2，3；而也有研究證明，5氟尿嘧啶能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬4。本研究以人肺腺癌A549細(xì)胞為例，來探討5氟尿嘧啶抑制人肺腺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制，以期為臨床治療提供理論依據(jù)。1材料與方法1.1材料人肺腺癌A549細(xì)胞，HAMS/F12細(xì)胞培養(yǎng)液(美國(guó)GIBCOBRL公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，胰酶(上海生工)，二甲基亞砜(Sigma公司)。5氟尿嘧啶(深圳萬樂藥業(yè)有限公司)用二甲基亞砜(DMSO)溶解。1.2細(xì)胞培養(yǎng)A549肺癌細(xì)胞系在含10%胎牛血清的HAMS/F12培養(yǎng)基中，置于37，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3d半量換液傳代，實(shí)驗(yàn)中選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。5Fu用DMSO溶解成1mol/L儲(chǔ)存液-20保存，使用前用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。1.3實(shí)驗(yàn)分組根據(jù)加入的5氟尿嘧啶濃度不同將細(xì)胞分組：對(duì)照組；加藥組(分別為5、10、20、40、80、100、200、300、400M)。將各組細(xì)胞接種到24孔和96孔板中，每孔細(xì)胞濃度為2104/ml，置于37、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后加藥，分別于加藥后24、48h進(jìn)行觀察和分析。1.4細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察各組細(xì)胞加藥24、48h后，倒置相差顯微鏡下觀察24、48h細(xì)胞形態(tài)變化。1.5MTT法檢測(cè)細(xì)胞琥珀酸脫氫酶的活性將上述培養(yǎng)于96孔板中的細(xì)胞根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組加入不同濃度的5氟尿嘧啶，于各組藥物處理終止前4h每孔加入5mg/mlMTT液20l，繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后小心吸出各孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入100lDMSO，振蕩至結(jié)晶全部溶解，酶標(biāo)儀上570nm測(cè)定光密度(OD值)。取各平行孔OD值的平均值,根據(jù)下式計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率:存活細(xì)胞%=(實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)100%(以不含細(xì)胞的培養(yǎng)液為空白組調(diào)零)。1.6吖啶橙染色觀察細(xì)胞質(zhì)內(nèi)酸性膜泡變化上述培養(yǎng)于24孔板中的細(xì)胞用不同濃度的5氟尿嘧啶處理48h后，將舊培養(yǎng)液吸出，PBS洗兩遍，加入兩滴0.1mg/ml吖啶橙染液染色1min，PBS洗兩遍，于倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以xs表示,經(jīng)重復(fù)測(cè)量資料的方差分析,P<；0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.15氟尿嘧啶對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響用MTT法檢測(cè)了5氟尿嘧啶對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響(表1)。用5、10、20、40、80、100、200、300、400M的5氟尿嘧啶，分別處理A549細(xì)胞24、48h。數(shù)據(jù)顯示，5氟尿嘧啶對(duì)A549細(xì)胞的影響表現(xiàn)出一定的濃度和時(shí)間依賴性關(guān)系。隨藥物處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率降低；隨藥物濃度的增加，細(xì)胞存活率也表現(xiàn)出降低趨勢(shì)。表15Fu對(duì)A549細(xì)胞存活率的影注：?jiǎn)我蛩胤讲罘治鯬<；0.01，進(jìn)一步兩兩比較(同一時(shí)間段不同加藥濃度組與對(duì)照組相比)P均小于0.012.25氟尿嘧啶對(duì)A549細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響：A549細(xì)胞經(jīng)不同濃度的5氟尿嘧啶處理48h后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化(圖1)，發(fā)現(xiàn)10100M處理組細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)明顯的空泡化，且10、20M組空泡化現(xiàn)象尤其明顯；300M處理組細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡特征；400M處理組除有凋亡外還出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞壞死現(xiàn)象。2.3吖啶橙染色觀察細(xì)胞質(zhì)變化為了進(jìn)一步明確5氟尿嘧啶處理A549細(xì)胞后引起的細(xì)胞質(zhì)的變化，我們用吖啶橙染色來觀察細(xì)胞質(zhì)內(nèi)酸性膜泡的變化。不同濃度的5氟尿嘧啶處理A549細(xì)胞48h后，吖啶橙染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖2)，與對(duì)照組相比5氟尿嘧啶處理組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)酸性膜泡均明顯增多，且10、20M處理組尤為明顯，這與形態(tài)觀察結(jié)果一致。3討論目前，多數(shù)學(xué)者將細(xì)胞的死亡形式分為凋亡(apoptosis)、自噬性細(xì)胞死亡(autophagy)和壞死(necrosis)三種類型5，6，其中凋亡和自噬性細(xì)胞死亡屬于程序性細(xì)胞死亡(programmedcelldeath)，分別被稱為型程序性細(xì)胞死亡和型程序性細(xì)胞死亡。多年來，人們對(duì)型程序性細(xì)胞死亡細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)、參與分子及其調(diào)控機(jī)制的研究頗多，對(duì)其在抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用較為了解，而對(duì)型程序性細(xì)胞死亡細(xì)胞自噬，了解較少。自噬是細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)成分被溶酶體降解的統(tǒng)稱，它是真核細(xì)胞所特有的，負(fù)責(zé)長(zhǎng)壽命蛋白和一些細(xì)胞器的降解再利用7，在生物體的發(fā)育、正常生理活動(dòng)和許多疾病中發(fā)揮重要作用。近年來許多研究表明，自噬與腫瘤的關(guān)系非常密切，像凋亡一樣，自噬在調(diào)節(jié)癌癥的發(fā)生，發(fā)展和決定腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌治療的反應(yīng)等方面起著很重要的作用，然而，對(duì)這一作用，研究者們頗有爭(zhēng)議，至今尚無定論。本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞存活率檢測(cè)結(jié)果表明(表1)，用不同濃度的5氟尿嘧啶處理A549細(xì)胞24、48h，細(xì)胞存活率均呈現(xiàn)濃度和時(shí)間的依賴性關(guān)系，說明5氟尿嘧啶具有抑制肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示(圖1)，隨5氟尿嘧啶濃度的增高，細(xì)胞表現(xiàn)出不同的反應(yīng)：低濃度(<；200M)時(shí)，細(xì)胞呈鋪展?fàn)顟B(tài)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)空泡增多；高濃度(300M)時(shí)，細(xì)胞變圓，出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。這一結(jié)果提示，5氟尿嘧啶抑制肺腺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)的作用方式可能是低濃度時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬、高濃度時(shí)引起細(xì)胞凋亡。細(xì)胞自噬可能是在應(yīng)激條件下被激活，起到延緩細(xì)胞凋亡的作用。為了進(jìn)一步證實(shí)5氟尿嘧啶低濃度時(shí)是否誘導(dǎo)了細(xì)胞自噬的發(fā)生，我們采用吖啶橙染色方法來觀察自噬泡(autophagicvacuoles)是否存在。吖啶橙染色結(jié)果顯示(圖2)，不同濃度的5氟尿嘧啶處理細(xì)胞后，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的酸性膜泡增多，而且5氟尿嘧啶10、20M處理組細(xì)胞內(nèi)酸性膜泡最多，隨藥物濃度的增高，細(xì)胞內(nèi)酸性膜泡逐漸減少。近年來，用吖啶橙染色法來觀察應(yīng)激條件下細(xì)胞質(zhì)內(nèi)酸性膜泡的變化，已經(jīng)成為一種常用的鑒別細(xì)胞自噬的方法8。因此，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5氟尿嘧啶低濃度處理A549細(xì)胞時(shí)，誘導(dǎo)了細(xì)胞自噬的發(fā)生。以往許多研究表明，5氟尿嘧啶抗腫瘤的機(jī)制是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的，而如今臨床治療發(fā)現(xiàn)，5氟尿嘧啶的耐藥性在治療過程中已變得非常普遍，成為治療失敗的重要原因。最新有研究證明，5氟尿嘧啶能夠誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生自噬9，提示自噬在5Fu治療腫瘤的過程中有不可忽視的作用。我們上述研究也發(fā)現(xiàn)，低濃度的5氟尿嘧啶能誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞發(fā)生自噬，高濃度的5氟尿嘧啶能引起A549細(xì)胞凋亡甚至壞死。因此，探索腫瘤細(xì)胞自噬的機(jī)制，阻斷自噬的發(fā)生，降低腫瘤耐藥性，可能是降低藥物毒性提高腫瘤治療效率的新策略。(致謝：感謝濱州醫(yī)學(xué)院李尊嶺老師饋贈(zèng)人肺腺癌A549細(xì)胞。)【參考文獻(xiàn)】1YamaguchiF,KamitoriK,SanadaK,etal.Raresugardalloseenhancesantitumoreffectof5fluorouracilonthehumanhepatocellularcarcinomacelllineHuH7J.JBiosciBioeng，2008，106(3):248252.2ChenCY,JiaJH,ZhangMX,etal.Comparativeproteomicsofapoptosisinitiationinducedby5fluorouracilinhumangastriccancerJ.ChinJPhysiol，2006,49(1):3138.3QinL,ZhangX,ZhangL,etal.DownregulationofBMI1enhances5fluorouracilinducedapoptosisinnasopharyngealcarcinomacellsJ.BiochemBiophysResCommun，2008，371(3):531535.4VonBltzingslwenI,JontellM,HurstP,etal.5FluorouracilinducesautophagicdegenerationinratoralkeratinocytesJ.OralOncol，2001,37(6):537544.5EdingerAL,ThompsonCB.Deathbydesign:apoptosis,necrosisandautophagyJ.CurrOpinCellBiol，2004,16(6):663669.6SingletaryK,MilnerJ.Diet,autophagy,andcancer:areviewJ.CancerEpidemiolBiomarkersPrev，2008，17(7):15961610.7FarreJC,SubramaniS.Peroxisometurnoverbymicropexophagy:anautophagyrelatedprocessJ.TrendsCellBiol,2004,14(9):515523.8LiuK,TangQ,FuC,etal.