（分析化學(xué)專業(yè)論文）尖吻蝮蛇fixfxbps的抗凝血和降血壓活性機(jī)理及fixfx親和純化的研究.pdf

y 1 嬲必 u n i v e r s i t yo fs c i e n c ea n dt e c h n o l o g y o fc h i n a adi s s e r t a t i o nf o rd o c t o r sd e g r e e i d e n t i f i c a t i o no fa n t i c o a g u l a n t h y p o t e n s i v e e f f e c to ff i x f x - - b p sf r o m t h ev e n o mo fa g k i s t r o d o na c u t u sa n d c o n f o r m a t i o n s p e c i f i ca f f i n i t y p u r i f i c a t i o no ff a c t o ri xa n df a c t o r x ： a u t h o r sn a m e ： s h e nd e n g k e s p e c i a l i t y ：a n a l y t i c a lc h e m i s t r y s u p e r v i s o r ：a s s o c p r o f x ux i a o l o n g p r o f s uq i n g d e f i n i s h e dt i m e ：m a y3 仇，2 0 11 ； 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明 本人聲明所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行研究工作所取得的成 果。除已特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含任何他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫 過的研究成果。與我一同工作的同志對本研究所做的貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確 的說明。 作者簽名：簽字日期： 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)學(xué)位論文授權(quán)使用聲明 作為申請學(xué)位的條件之一，學(xué)位論文著作權(quán)擁有者授權(quán)中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)擁 有學(xué)位論文的部分使用權(quán)，即：學(xué)校有權(quán)按有關(guān)規(guī)定向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交 論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱，可以將學(xué)位論文編入中國學(xué) 位論文全文數(shù)據(jù)庫等有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制 手段保存、匯編學(xué)位論文。本人提交的電子文檔的內(nèi)容和紙質(zhì)論文的內(nèi)容相一致。 保密的學(xué)位論文在解密后也遵守此規(guī)定。 仞公開口保密( 年) 作者簽名： 簽字日期： 導(dǎo)師簽名：2 主二! e 型! 一導(dǎo)師簽名：l 受二! e 型一 簽字日期：絲! l 生二2 目錄 第一章綜述1 1 1 血液凝吲與蛇毒調(diào)節(jié)凝血蛋白的研究進(jìn)展l 1 1 1j f i 【液凝固的生理過程l 1 1 2 調(diào)節(jié)血液凝固過程的c 一型凝集素類似蛋白3 1 2 凝m 因子i x x 結(jié)合蛋白家族的研究進(jìn)展6 1 2 1 凝m 因子i x x 結(jié)合蛋白家族的發(fā)現(xiàn)6 i 2 2 凝j f f l 因子i x x 結(jié)合蛋白家族的生理生化性質(zhì)8 1 3 凝向因子和凝f f i l 因子x 及它們純化方法的研究進(jìn)展l l i 3 i 凝血因子i x 研究進(jìn)展1 1 i 3 2 凝血因子x 研究進(jìn)腱m i 3 3 凝血因子i x 的純化1 6 1 3 4 凝j n l 岡子x 的純化1 8 第二章蛇毒抗凝血因子a c fi i 抗凝血活性及其機(jī)理、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及 其影響因素對活性的影響2 7 2 1 引言2 7 2 2 實(shí)驗(yàn)儀器和材料2 7 2 2 1 實(shí)驗(yàn)儀器2 7 2 2 2 實(shí)驗(yàn)材料2 8 2 3 實(shí)驗(yàn)方法2 8 2 3 ia c fi 和a c fi i 的純化2 8 2 3 2a c fi 和a c fi i 的對大鼠在體抗凝血實(shí)驗(yàn)2 9 2 3 3a c fi i 和f x 的電泳結(jié)合實(shí)驗(yàn)2 9 2 3 4 表面等離子體共振法( s p r ) 測定a c fi i 和f x 的結(jié)合動力學(xué)2 9 2 3 5 表面等離子體莢振法( s p r ) 測定a c fi i 和f i x 的結(jié)合動力學(xué)3 0 2 3 6 等溫滴定微肇?zé)岱? i t c ) 測定a c fi i 和金屬離子的結(jié)合動力學(xué)3 0 2 3 7 熒光分光光度法測定金屬離子對a c fi i 的熱力學(xué)穩(wěn)定性和的影響3 1 2 3 8 熒光分光光度法測定金屬離子對a c fi i 的化學(xué)穩(wěn)定性的影響3 2 2 3 9n - - 色譜法( c d ) 測定金屬離子對a c fi i 的熱穩(wěn)定性的影響3 3 3 3 8 快速蛋白質(zhì)液相層析( f p l c ) 分離f i x 和f x 7 4 3 3 9 離效液相色譜一電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法( l c e s i m s m s ) 分析7 4 3 3 1 0 表而等離子體共振法( s p r ) 測定a c fi i 與f i x f x 的結(jié)合活性7 5 3 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果7 5 3 4 1 凝血因子i x 和凝血兇子x 的混合物的分離制備7 5 3 4 2f p l c 對凝血因子和凝血因子x 進(jìn)一步純化7 7 3 4 3 測定酶活力并計(jì)算婀步色譜法的收牢7 8 3 4 4 鳥槍法蛋白質(zhì)組學(xué)攀定凝i i i 【因子l x 及凝j f i i 因子x 7 9 3 4 5s p r 鑒定凝【缸因子i x 及凝j f i 【網(wǎng)子x 與a c f 的結(jié)合活性8 2 3 5 實(shí)驗(yàn)討論8 3 第四章蛇毒多功能蛋白a c fi i 降血壓活性及其機(jī)理8 9 4 1 引吉8 9 4 2 實(shí)驗(yàn)儀器和材料8 9 4 2 1 實(shí)g 僉儀器8 9 4 2 2 實(shí)驗(yàn)材料8 9 4 3 實(shí)驗(yàn)方法9 0 4 3 1 大鼠在體心血管實(shí)驗(yàn)9 0 4 3 2 離體j f | 【管環(huán)的舒張實(shí)驗(yàn)9 0 4 3 3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析9 1 4 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果9 l 4 4 1a c fi i 對麻醉的正常血壓大鼠的降血壓作剛9 l 4 4 2a c fi i 介導(dǎo)n o 釋放的降血壓作心9 4 4 4 3a c fi i 對苯腎上腺素預(yù)收縮的動脈血管環(huán)的舒張作用9 6 4 4 4n o 介導(dǎo)a c fi i 對動脈j f i 【管環(huán)的舒張作用9 8 4 5 實(shí)驗(yàn)討論9 9 致謝1 0 6 在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與取得的其他研究成果1 0 7 摘要 摘要 c 型凝集素類似蛋白具有與c 型凝集素類似的結(jié)構(gòu)，但沒有凝集素活性。 蛇毒中c 型凝集素類似蛋白具有多種生物活性，包括抗凝覷和f f i l 小板調(diào)節(jié)活性。 凝血兇子i x 凝血因子x 結(jié)合蛋白屬于c 型凝集素類似蛋白，它們廣泛存在于蝰 科蛇毒巾。它們都是通過與虹液巾凝血因子或者凝i f i l 因子x 結(jié)合來抑制凝血 反應(yīng)，所有結(jié)合反應(yīng)都依賴于c a 2 + 等離子。尖吻蝮蛇蛇毒中抗凝血因子i ( a c fi ) 和抗凝血因子i i ( a c fi i ) 是凝血因子i x x 結(jié)合蛋白家族中的兩個(gè)新成員。本 論文主要研究金屬離子對a c fi 和a c fi i 的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和功能的影響、a c fi 和a c fi i 對m 液循環(huán)系統(tǒng)的影響以及它們在親和純化凝血因子i x 和凝血因子x 方面的應(yīng)用。全文分為四章。 第一章：我們對凝缸過程分子機(jī)理、凝血因子i x 和凝缸因子x 等重要凝【f i l 因子的性質(zhì)和功能、凝血兇子和凝血因子x 純化技術(shù)、c 型凝集素類似蛋白 以及凝血兇子i x x 結(jié)合蛋白家族等進(jìn)行了綜述。 第二章：我們研究了a c fi 和a c fi i 在體內(nèi)抗凝札活性、堿土金屬離子與 a c fi 和a c fi i 的結(jié)合反應(yīng)以及它們對a c fi 和a c fi i 的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和功能的 影響。a c fi 和a c fi i 在老鼠體內(nèi)表現(xiàn)出顯著的抗凝血活性，它們都顯著延長 a p t t 和p t ，都對t t 沒有影響，表明它們的抗凝m 作用與抑制凝麻因子x 活性有關(guān)。非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和表面等離子共振的結(jié)果都顯示，a c fi i 與f x a 結(jié)合反應(yīng)不是絕對依賴于c a 2 + ，m 9 7 + 、s r 2 + 和b a l + 也可以誘導(dǎo)a c fi i 與 f x a 結(jié)合反應(yīng)。與a c fi i 結(jié)合的金屬離子半徑不僅顯著影響金屬離子與a c f1 i 結(jié)合親和性，而且電顯著影響a c fi i 抗g d n h c l 變性和熱變性的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。 而與凝血因子x 結(jié)合的金屬離了半徑顯著影響a c f1 i 與f x 結(jié)合親和性。金屬 離子對a c fi i 親和性強(qiáng)弱和金屬離子誘導(dǎo)a c fi i 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的能力大小遵循相 i 剛頃序：c a 2 + s r 2 + b a ”。而金屬離予誘導(dǎo)的a c fi i 與f x 結(jié)合反應(yīng)的能力大 小為：m 9 2 + c a 2 + s p b a ”。雖然m g ：+ 對a c fi i 的親和性最低，但m g ：+ 誘 導(dǎo)a c fi i 與f x 結(jié)合反應(yīng)能力最強(qiáng)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，金屬離子與a c fi i 結(jié)合能顯著增強(qiáng)a c fi i 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，但金屬離子與a c fi i 的結(jié)合反應(yīng)不是a c f i l 與f x a 發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的前提條件；金屬離子與f x a 結(jié)合反應(yīng)才是a c fi i 與f x a 相互識別的前提條件。另外，a c fu 是基于金屬離子半徑選擇結(jié)合c a 2 + 。 第三章：我們利用凝血因子i x x 結(jié)合蛋白作為親和配基，建立了快速高效 親和純化凝魄因子和凝血岡子x 的方法。新配綮結(jié)合凝血因子i x 及凝缸因 子x 的親和能力強(qiáng)，而且在溫和的條件下就可以方便地洗脫下來凝血兇子和 摘要 凝f f i l 岡子x 。通過凝血因子i x x 結(jié)合蛋白親和柱層析，可以直接從任何血漿中 分離出僅含有凝血因子和凝血凼予x 的混合物。再經(jīng)過f p l c 共兩步色譜就 可l c d 時(shí)得到高純度的凝血因子和凝血因子x 。該方法純化效率和產(chǎn)率與單克 隆抗體親和層析方法相當(dāng)。單克隆抗體的制備方法繁瑣，抗體價(jià)格昂貴，而抗體 不穩(wěn)定。而新配基凝血因子i x x 結(jié)合蛋白是天然配基，長期穩(wěn)定，價(jià)格便宜， 很方便大規(guī)模工業(yè)制備。另外，用單克隆抗體親j f l i 層析只能從一個(gè)特定動物血漿 巾純化一種凝贏網(wǎng)子，而用新親和層析方法可以從任何【f i l 漿和溶液中同時(shí)純化出 a b s t r a c t a b s tr a c t c t y p el e c t i n - l i k ep r o t e i n s ( c l p s ) h a v es i m i l a rs m a c m r e st o t h a to fc - t y p e l e c t i n s ，b u tt h e yh a v en ol e c t i na c t i v i t y t h ec l p sf r o ms n a k ev e n o m h a v eav a r i e t yo f b i o l o g i c a la c t i v i t i e s ，i n c l u d i n ga n t i c o a g u l a n t - a n dp l a t e l e t - m o d u l a t i n ga c t i v i t i e s a f a m i l yo fc o a g u l a t i o nf a c t o ri x f a c t o rx b i n d i n gp r o t e i n ( i x x - b p ) w h i c hb e l o n g st o c l p sh a sb e e ni d e n t i f i e df r o mt h ev e n o m so fd i f f e r e n ts n a k es p e c i e s i x x - b p s i n t e r a c tw i t ht h e7 - c a r b o x y g l u t a m i ca c i d ( g l a ) d o m a i no ff a c t o ri x i x aa n d o rf a c t o r x x ai nac a 2 + - d e p e n d e n tm a n n e ra n dt h e r e b yb l o c kt h ea m p l i f i c a t i o no ft h e c o a g u l a t i o nc a s c a d e a n t i c o a g u l a t i o nf a c t o ri ( a c fi ) a n da n t i c o a g u l a t i o nf a c t o ri i ( a c fi dp u r i f i e df r o mt h ev e n o mo fa g k i z t r o d o na c t t t u sa r et w om e m b e r so ft h e i x x b pp r o t e i nf a m i l y i nt h i st h e s i s ，t h ee f f e c t so fm e t a li o n so nt h es t m c t u r a l s t a b i l i t ya n df u n c t i o no f a c f ia n da c fi i ，t h eh y p o t e n s i v ee f f e c t so f a c fia n da c f i io nt h ec a r d i o v a s c u l a r s y s t e m ，a n d t h e i ra p p l i c a t i o ni nt h ep u r i f i c a t i o no f c o a g u l a t i o nf a c t o ri xa n dc o a g u l a t i o nf a c t o rx h a v eb e e ni n v e s t i g a t e d t h ew h o l e t h e s i si sd i v i d e di n t of o u rc h a p t e r s t h ef i r s tc h a p t e rg i v e sab r i e fo v e r v i e wo ft h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo f c o a g u l a t i o np r o c e s s ，t h ec h a r a c t e ra n df u n c t i o no ft h ei m p o r t a n tc o a g u l a t i o nf a c t o r s ， e s p e c i a l l y o nc o a g u l a t i o nf a c t o ri xa n dc o a g u l a t i o nf a c t o rx ，t h ep u r i f i c a t i o n t e c h n o l o g yo fc o a g u l a t i o nf a c t o ri x x ，c t y p el e c t i n l i k ep r o t e i n s ，a n dc o a g u l a t i o n f a c t o ri x , x b i n d i n gp r o t e i nf a m i l y i nt h es e c o n dc h a p t e r , t h ea n t i c o a g u l a n ta c t i v i t yo fa c fia n da c fhi nv i v o ，t h e t h e r m o d y n a m i c so ft h eb i n d i n go fa l k a l i n ee a r t hm e m li o n st oa c f i ia n dt h e i re f f e c t s o nt h es t a b i l i t yo fa c fi ia n dt h eb i n d i n go fa c f t of x aw e r ei n v e s t i g a t e db y i s o t h e r m a lt i t r a t i o nc a l o r i m e t r y , f l u o r e s c e n c e ，d i f f e r e n t i a ls c a n n i n gc a l o r i m e t r ya n d s u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e ，r e s p e c t i v e l y b o t ha c fia n da c fi ie x h i b i th i g h a n t i c o a g u l a t i o na c t i v i t yi nv i v o t h eb i n d i n go fa c f t of x ad o e sn o th a v ea n a b s o l u t er e q u i r e m e n tf o rc a + m 9 2 + ，s f - + a n db a 2 + c a l li n d u c et h eb i n d i n go fa c f i i t of x a t h er a d i io ft h ec a t i o n sb o u n di na c fi ic r u c i a l l ya f f e c tt h eb i n d i n ga f f i n i t y o fa c fi it oc a t i o n sa n dt h es t r u c t u r a ls t a b i l i t yo fa c f i ia g a i n s tg d i l h c la n dt h e r m a l d e n a t u r a t i o n w h i l et h er a d i io fc a t i o n sb o u n di nf x am a r k e d l ya f f e c to n 也eb i n d i n g a f f i n i t yb e t w e e na c f i ia n df x a t h eb i n d i n ga f f i n i t i e so fa c fi if - 0 rc a t i o n sa n dt h e c a p a c i t i e so fm e t a l i n d u c e ds t a b i l i z a t i o no fa c f i if o l l o wt h es a m et r e n dc a 2 十 s ，+ i a b s t r a c t a a + t h em e t a l i n d u c e db i n d i n ga f f i n i t i e so fa c fi it of x af o l l o wt h e 仃e n dm 9 2 + c a 2 + s f f + b a 2 + a l t h o u g hm g + s h o w ss i g n i f i c a n t l yl o wb i n d i n ga f f i n i t yw i t h a c f ，m g pi st h em o s te f f e c t i v et oi n d u c et h eb i n d i n go fa c f w i t hf x a o u r o b s e r v a t i o n ss u g g e s tt h a t i nb l o o d ，t h eb i n d i n g so fc a ：+ i nt w os i t e so fa c fi i i n c r e a s et h es t r u c t u r a ls t a b i l i t yo fa c fi i ，b u tt h e s eb i n d i n g sa r en o te s s e n t i a lf o rt h e b i n d i n go fa c f1 1w i t h a ，a n dt h a tt h eb i n d i n go fm 9 2 + a n dc a 2 + t of x am a yb e e s s e n t i a lf o rt h er e c o g n i t i o nb e t w e e nf x aa n da c fi i l i k ec a 2 + ，t h ea b u n d a n tm 9 2 + i nb l o o da l s op l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nt h ea n t i c o a g u l a t i o no f a c f i i i nt h et h i r dc h a p t e r , w eh a v e d e v e l o p e da nr a p i da f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y p r o c e d u r eu s i n gc o a g u l a t i o nf a c t o ri x f a c t o rx - b i n d i n gp r o t e i n s 雒n o v e la f f i n i t y l i g a n d st oi s o l a t ec o a g u l a t i o nf a c t o ri xa n dc o a g u l a t i o nf a c t o rxf r o mp l a s m a t h e n a t i v ea f f i n i t y l i g a n d se f f i c i e n t l yb i n df i x f xa n dr e l e a s et h e mu n d e rv e r ym i l d c o n d i t i o n s f i xa n df xc a nb es i m u l t a n e o u s l yp u r i f i e df r o mu n c l a r i f i e dp l a s m ab y i x x b p sa f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yf o l l o w e db yh p l cw i t hap u r i f i c a t i o nf a c t o ra n d y i e l ds i m i l a rt ot h a to fm o n o c l o n a la n t i b o d yi m m u n o a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y i n c o n t r a s tt om o n o c l o n a la n t i b o d yt h a ti sc u m b e r s o m e ，e x p e n s i v ea n ds u f f e rf r o mi t s i n s t a b i l i t y ，t h en o v e la f f i n i t yl i g a n d si x x - b p sa r el o n g t e r ms t a b l ea n dc h e a pt o p r e p a r e i n l a r g e s c a l e i n a d d i t i o n ，m o n o c l o n a la n t i b o d yi m m u n o a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h yi su s e dt op u r i f yf i xo n l yf r o mt h es p e c i f i cp l a s m a ，w h i l et h en e w a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yc a nb eu s e dt op u r i f yb o t hf i xa n df xf r o ma n yu n c l a r i f i e d p l a s m ao rs o l u t i o n s t h i sn e wa f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yh a sp o t e n t i a la p p l i c a t i o nf o r t h ei n d u s t r i a ls c a l ep u r i f i c a t i o no ff i xa n df xf o rs p e c i f i cr e p l a c e m e n tt h e r a p yi n h e m o p h i l i aba n dp a t i e n t sw i t hf xd e f i c i e n c y i nt h ef o u r t hc h a p t e r , t h ee f f e c t so fa c fia n da c fi io nt h em e a na r t e r i a lb l o o d p r e s s u r e ( m a b p ) a n d h e a r tr a t e ( h r ) i na n e s t h e t i z e dr a t sh a v e b e e ni n v e s t i g a t e d t h e r e s u l t si n d i c a t et h a ta c fi ii n d u c e sad o s e - d e p e n d e n tr e s p o n s ei nr a t sw i t has h o r tf a s t d r o po fm a b pf o l l o w e db ya ni n c r e a s ea n dt h e nal o n g e rl a s t i n gs l i g h td e c r e a s ei n m a b p , b u td o e sn o to b v i o u s l ya f f e c th r a c fi i i n d u c e dh y p o t e n s i o ni ss i g n i f i c a n t l y b l o c k e db yt h en os y n t h a s ei n h i b i t o rn o m e g a - l a r g i n i n em e t h y le s t e r ( l n a m e ) a c fi i p r o d u c e sac o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n tr e l a x a t i o no fr a ta o r t i cr i n g sw i t h f u n c t i o n a l e n d o t h e l i u m t h ea c fi i i n d u c e dv a s o d i l a t a t i o ni sc o m p l e t e l yi n h i b i t e db y r e m o v a lo fe n d o t h e l i u ma n ds i g n i f i c a n t l yi n h i b i t e db yp r e t r e a t m e n tw i t hl - n a m e t h e s eo b s e r v a t i o n sd e m o n s t r a t et h a ta c fi ii n d u c e s h y p o t e n s i o nt h r o u g ha n e n d o t h e l i u m - d e p e n d e n tv a s o d i l a t i o n ，w h i c hi ss t r o n g l ym e d i a t e db yt h er e l e a s eo fn o i v a b s 扛a c t f r o me n d o t h e l i u m t h e r e f o r e ，a c fi i i ss of a ri d e n t i f i e d a st h ef i r s t u n i q u e b i f u n c t i o n a l p r o t e i n i nt h e i x x b pf a m i l y t h a th a sb o t h a n t i c o a g u l a n ta n d h y p o t e n s i v ee f f e c t so i lt h eb l o o do fr a t st h r o u g hd i f f e r e n tp a t h w a y s h o w e v e r , a c fi d o e sn o ts h o wa n yh y p o t e n s i v ee f f e c ti nr a t s v 第一章緒論 第一章緒論弟一早珀比 1 1 血液凝固與蛇毒調(diào)節(jié)凝血蛋白的研究進(jìn)展 1 1 1 血液凝固的生理過程 血液凝固反應(yīng)是人或動物的一個(gè)重要的自我保護(hù)的生理反應(yīng)，血液凝固過程 的生理意義在于，它在血管損傷后維護(hù)一個(gè)完整封閉的高壓循環(huán)系統(tǒng)。【i i l 管壁的 損傷和血液從血管的外滲都會迅速觸發(fā)凝血反應(yīng)，完成修復(fù)和l t 血作用【l ，2 】。 血液凝固的過程，是血液經(jīng)一系列酶促反應(yīng)，纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗芙獾睦w維蛋 白，血液由溶膠狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z狀態(tài)的生化過程【3 】。凝血系統(tǒng)的功能正常與否 嚴(yán)重影響人類的健康，很多疾病都和凝血系統(tǒng)有著直接或是間接的聯(lián)系，所以深 入研究凝血系統(tǒng)意義重大。 正常的凝j 1 ) l 過程是f f i l 液中一系列凝l f i l 因子相繼酶解激話的過程，最終形成纖 維蛋白。參與凝血的因子有十余種，除c a ：+ 和磷脂外其余凝血因子均為蛋白質(zhì)， 其中起到關(guān)鍵作用的有多個(gè)凝血因子，包括：一，凝血因子i ，纖維蛋白原 ( f i b r i n o g e n ) ，其7 鏈c 端氨基酸與缸小板糖蛋白l i b i l i a 結(jié)合，從而誘發(fā)血小板的 聚集，同時(shí)纖維蛋白原也參與凝血反應(yīng)的其他多個(gè)過程 4 】。二，凝血因子i i ， 凝血酶原( p r o t h r o m b i n ) ，其2 7 3 位精氨酸2 7 4 位蘇氨酸鍵處可以被活化凝血因 子x 活化凝血因子v 復(fù)合物( f x a f 、，a ) 裂解而激活成為凝【f i l 酶。凝m 酶的結(jié)構(gòu) 含有重鏈a 及輕鏈b ，由二硫鍵連接，分子量為3 6k d ，其主要生理活性是激活 多種凝血兇予并誘導(dǎo)血小板的聚集反應(yīng)【5 】。三，凝血因子i i i ，組織因子( t i s s u e f a c t o r ，t f ) ，它是一種穿膜糖蛋白，由2 6 3 個(gè)a a 組成，其n 端有一2 1 9 個(gè)氦基 酸殘基的肽段，在膜外，則是f v i i 及f v i i a 的受體【6 。t f 在外源凝血系統(tǒng)中起 重要作用，細(xì)胞表而的t f 與阻漿中的凝f f i l 因子v i i ( f v i i ) 結(jié)合形成的復(fù)合物， 在活化凝血因子x ( f x a ) 的作用下，可激活為t f f v i i a ，后者參與活化凝缸因 子i x ( f i x ) 及凝血因子x ( f x ) ，活化凝血因子i x ( f i x a ) 與活化因子l ( f v i i a ) 所形成的復(fù)合物又可激活f x 【7 】。四，凝衄因子v ( f a c t o rv ，f v ) ，由2 1 9 6 個(gè) a a 組成的單鏈糖蛋白，其分子量為3 3 0k d 【8 】。f v 有a 、b 、c 三個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)，排 列城序?yàn)閍 1 a 2 b a 3 c l - c 2 。在凝血酶作用下，f v 裂解除去b 區(qū)形成重鏈a 1 a 2 ( 分子量1 0 5k d ) 及輕鏈a 3 c 2 ( 分子量7 3k d ) 由c a 7 + 連接。另外，f x a 及纖溶 酶也能激活f v 。m 能夠與f x a 形成復(fù)合物，從而激活凝血酶原成為凝血酶 9 】。 第一章緒論 五，凝血因子v i i ( f a c t o r v i i ，f ) ，其輕鏈上的上皮生長因子( e g f ) 結(jié)構(gòu)域 有個(gè)非谷氨酸依賴的c a 2 + 結(jié)合部位，這是f v i i 被活化所必需的。t f - f v i i a 復(fù) 合物在凝血過程的引發(fā)起始階段中發(fā)揮重要作用，它可以激活f x 和f 。此外， f v i i a 在磷脂和c a 2 + 存在的條件下也能夠活化f x 。六，凝【f i l 因子v i i i ( f a c t o r v i i i ， 第章緒論 詈 圖1 1血液凝固過程的引發(fā)起始階段 f i g 1 1t h em e c h a n i s mo fi n i t i a t i o no f t h r o m b i np r o d u c t i o n 圖1 2 血液凝固過程的擴(kuò)大凝固階段 f i g 1 2a m p l i f i c a t i o n ：b u r s to f t h r o m b i np r o d u c t i o n 1 1 2 調(diào)節(jié)血液凝固過程的c 一型凝集素類似蛋白 c 型凝集素類似蛋白( c l p ) 具有多種生物活性，包括抗凝衄和血小板調(diào)節(jié) 活動，但沒有凝集素的活性【2 1 ，2 2 。在過去的幾十年里，從各種蛇的毒液都發(fā) 3 詈 圃 廣 一 回 囤 圓 圓 廠 一 一 一 r-，： 囤 臥 圃 圃 圓 圓 圈 一 一 第一章緒論 現(xiàn)了具有各種生理活性的c 型凝集素類似蛋白家族成員。c l p 由異源二聚體或異 源多聚體組成，而蛇毒來源的c l p 都是金屬離子依賴性的二聚體或多聚體。這些 c l p 包括凝j f 【l 岡子) ( 的結(jié)合蛋白 2 3 、凝皿因子x 激活劑 2 4 】、凝m 酶原激活 劑【2 5 等等。蛇毒中發(fā)現(xiàn)的c l p 的基本結(jié)構(gòu)包括兩個(gè)同源皿基：亞基a ( a 鏈) 1 4 _ 1 5k d a 和的亞然b ( b 鏈) 1 3 1 4k d a 。這些亞基均含有一個(gè)離子依賴性的糖類 識別結(jié)構(gòu)域， c l p 會發(fā)生在各種各樣的低聚，包括c 【p ，( a p ) 2 ，( a p ) 4 。這些c l p 的各個(gè)亞基通過二硫鍵相互連接【2 6 ，2 7 。 c l p 構(gòu)成的新蛋白質(zhì)家族，成為闡明凝血和血小板活化所涉及的機(jī)理的有用 工具，并可以用米研究凝血因子和缸小板糖蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。 表1 1 對凝血系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)作用的蛇毒來源的c 型凝集素( c l p ) 表1 1 中列出了一系列影響凝f f i l 系統(tǒng)的c l p ，按它們的生理活性可以分為四 類：抗凝血活性，促凝血活性以及血小板活性的調(diào)制器( 激動荊和拮抗劑) 。 4 第一章緒論 第一類，抗凝血活性蛋白，包括凝血因子x 結(jié)合蛋白( x b p ) 3 0 ，凝血因 子i x 結(jié)合蛋白( i x b p ) 2 8 t 和凝血因子i x x 結(jié)合蛋白( i x x - b p ) 【4 2 ，它們 都是二硫鍵相連的異二聚體的c 型凝集素類似蛋白，它們的抗凝向活性大部分是 c a 2 + 依賴型的。另外，b o t h r o j a r a c i n ，是一個(gè)具有抗凝血活性的類水蛭素凝血酶 抑制劑。雖然它也是c p l ，但是其生物活性并不受c a ”的調(diào)控和影響 3 2 】。 第二類，促凝血活性蛋白，比如具有凝血因子x 的激活活性的r v v - x 【2 4 】、 具有凝血酶原的激活活性的c a r i n a c t i v a s e 1 【3 3 ，它們都是金屬蛋白酶，r v v - x 的 c 型凝集素類似蛋白結(jié)構(gòu)域可以特異性的識別凝血因子x 的g l a 結(jié)構(gòu)域， c a r i n a c t i v a s e 1 的c 型凝集素類似蛋白結(jié)構(gòu)域可以特異性的識別凝札酶原。 圓l 踟a 廠f j 卿圓 訪l 嘲a 廠瞅圓心j 脯v 以圓 ，j阢一1粵p 婦岫i n n l m 。 一 f x a 州8 l 舶 一抽l t 圖1 3 作用凝血過程的c l p f i g 1 3e f f e c t so f m h i b i t o r sa n da c t i v a t o r so f v e n o mc l p so nr e a c t i o n si nt h e b l o o dc o a g u l a t i o nc a s c a d e 第三類，血小板活性激動劑，它們在趣小板上的受體是血小板細(xì)胞膜上的糖 蛋白。b o t r o c e t i n j f l b i t i s c e t i n 會誘導(dǎo)血友病因子( v w f ) 和血小板細(xì)胞膜上的糖蛋 白r b ( g p i b ) 結(jié)合從而激活血小板的聚集，而a l b o a g g r e g i n - b 則直接結(jié)合g p i b 誘 導(dǎo)血小板聚集 3 4 ，3 5 ，4 3 ，4 4 。 5 第一章緒論 第四類，血小板活性拮抗劑，這也是類作用于血小板細(xì)胞膜上的糖蛋白的 c l p ，但是它們產(chǎn)生的生理作用是抑制血小板聚集。e c h i c e t i n ，a g k i c e t i n g l f l a v o c e t i n a 都可以通過與g p i b 結(jié)合而延緩衄小板聚集 3 9 ，4 0 ，4 5 ，4 6 。 f i b r i n o g e n 匕令匝亙?nèi)?圖1 4 作用于血小板的c l p 4 7 】 f i g 1 4c l p sf r o ms n a k ev e n o m t h a tm o d u l a t et h ep l a t e l e tf u n c t i o n 【4 7 】 1 2 凝血因子i x x 結(jié)合蛋白家族的研究進(jìn)展 1 2 1 凝血因子l x x 結(jié)合蛋白家族的發(fā)現(xiàn) 凝m 因子i x ) ( 結(jié)合蛋白是一類通過結(jié)合凝j f i l 因子i x 或者凝衄因子x 而具有 抗凝血活性的蛋白。最初，o u y a n g 等人從尖吻蝮蛇( a g k i s t r o d o na c u t u s ) 蛇毒中 純化到一種不具有酶活性的抗凝血成分，并發(fā)現(xiàn)其可以抑制凝血酶原的激活 【4 8 1 。隨后，t e n g 等人報(bào)道，尖吻蝮蛇蛇毒中的抗凝i f i l 活性成分是通過可逆性的 結(jié)合凝血因子x 而抑