如何提高核酸純度--提高OD260 OD230比值的方法.doc

如何提高核酸純度 即提高OD260 /OD230 比值方法什么是OD260 /OD230 ？核酸所含嘌呤和嘧啶分子具有共軛雙鍵，在260nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰。鹽離子等其他污染物在OD230 處有最大吸收峰，所以O(shè)D260 /OD230用來(lái)評(píng)估樣品中是否存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸OD260 /OD230 的比值應(yīng)大于2.0。如何提高OD260 /OD230 ？請(qǐng)先看小新做的幾個(gè)實(shí)驗(yàn)。以下實(shí)驗(yàn)均是使用Simgen全血DNA小量試劑盒（Cat.No.3001050）從400 l全血中分離純化的基因組DNA，在微量紫外分光光度計(jì)上測(cè)定的核酸數(shù)據(jù)。第一輪，按照說(shuō)明書(shū)常規(guī)步驟操作，加完洗滌液Buffer WA后立即離心，測(cè)定結(jié)果如下測(cè)定結(jié)果中OD260 /OD230比值太低，是不是表明里面的鹽分等污染物殘留太多了？我們之所以控制OD260 /OD230比值，主要是為了下游實(shí)驗(yàn)不受影響，因?yàn)橛行┪廴疚飼?huì)對(duì)后續(xù)的一些反應(yīng)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生抑制作用。為了知道本次提取的DNA對(duì)PCR實(shí)驗(yàn)有沒(méi)有影響，小新取了18l作模板（40l體系）進(jìn)行全血1.3 kb PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增并沒(méi)有任何抑制現(xiàn)象。 下面是PCR產(chǎn)物電泳圖：引物:人全血1.3 kb -球蛋白引物+ 為人全血DNA PCR產(chǎn)物陽(yáng)性對(duì)照1/2/3/4為PCR產(chǎn)物電泳條帶5/6/7/8為基因組DNA電泳條帶實(shí)際上單純從OD260 /OD230的數(shù)值上來(lái)判斷鹽分是否殘留過(guò)高并不準(zhǔn)確：即使殘留相同濃度的鹽分在核酸溶液中，某些鹽分在230nm處有強(qiáng)吸收峰的，也會(huì)嚴(yán)重降低OD260 /OD230的比值。但這并不等于核酸就不能使用了，第一輪實(shí)驗(yàn)獲得的DNA用作PCR的模板并沒(méi)有出現(xiàn)抑制現(xiàn)象就證明了這一點(diǎn)（本次PCR體系40 l，加入了接近一半反應(yīng)體系（18 l）的模板）。當(dāng)然，也正是因?yàn)檫@種在230nm有強(qiáng)吸收峰的雜質(zhì)的存在，為我們提供了減少鹽分殘留的線索。雖然PCR實(shí)驗(yàn)沒(méi)有因?yàn)镺D260 /OD230比值低受到影響，但是如果有辦法提高這個(gè)比值豈不是更好。之后，小新踏上了提高OD260 /OD230比值之旅。第二輪實(shí)驗(yàn)，小新在原有步驟上做了一點(diǎn)改變：在加完洗滌液Buffer WA后蓋上核酸純化柱的蓋子靜置了5min再離心，最后的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)OD260 /OD230平均值就有了明顯的提高?？聪聢D說(shuō)明浸泡洗滌法是有用的，但是還是離2.0以上相差甚遠(yuǎn)。第三輪實(shí)驗(yàn)，小新又重做一遍，其他條件都不變，在加完Buffer WA后開(kāi)蓋靜置5min，最終測(cè)定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)OD260 /OD230的值均已超過(guò)1.5，有一組數(shù)據(jù)已經(jīng)到達(dá)2.0以上。同樣都是靜置，這兩輪實(shí)驗(yàn)最終造成不同的結(jié)果，這是什么原因呢？第二輪實(shí)驗(yàn)在加洗滌液Buffer WA后室溫靜置了5 min, 其目的就是讓吸附膜上殘留的鹽分等污染物更充分地溶解到洗滌液中。第三輪實(shí)驗(yàn)中加了洗滌液Buffer WA后開(kāi)蓋靜置，可以使核酸吸附膜的上下的氣壓保持平衡，洗滌液在重力的作用下會(huì)緩慢滲透過(guò)吸附膜（如果仔細(xì)觀察，會(huì)發(fā)現(xiàn)洗滌液有滴下的趨勢(shì)），這樣鹽分等污染物就會(huì)沖洗得更徹底，所以最后OD260 /OD230的比值會(huì)更高。如果采用第三輪實(shí)驗(yàn)方案還覺(jué)得鹽分殘留高的話，就要考慮除吸附膜之外鹽分殘留的來(lái)源了。第四輪實(shí)驗(yàn)，小新在加洗滌液Buffer WA時(shí)，吸頭在核酸純化柱管口沿著管壁一圈清洗下去，然后再開(kāi)蓋靜置5min。最后的測(cè)定數(shù)據(jù)十分完美，全都在2.0以上。由于在靠近純化柱管口，就是與管蓋接觸的周?chē)糠质窍礈煲鹤铍y清洗到的死角，所以第四輪實(shí)驗(yàn)在加洗滌液Buffer WA時(shí)，吸頭對(duì)準(zhǔn)核酸純化柱管口沿著管壁一圈清洗下去，然后再開(kāi)蓋靜置5min，則能將管壁上殘留的雜質(zhì)也全部帶走，所以最后的測(cè)定數(shù)據(jù)也全都在2.0以上了?？赐赀@幾個(gè)實(shí)驗(yàn)，我們可以把提高核酸OD260 /OD230的方法歸納為兩個(gè)，其一是浸泡法，其中開(kāi)蓋靜置比閉蓋靜置的效果要好很多，浸泡時(shí)間在5-10分鐘左右。其二是沖洗法，沖洗易被忽略的死角，將污染物去除的更徹底。兩個(gè)方法都可以在