【畢業(yè)學(xué)位論文】(Word原稿)養(yǎng)豬發(fā)酵床墊料微生物群落動(dòng)態(tài)及其對(duì)豬細(xì)菌病原生防作用的研究-農(nóng)藥學(xué)

分類號(hào)： 單位代碼： 10389 密 級(jí)： 學(xué) 號(hào)： 建農(nóng)林大學(xué) 碩士學(xué)位論文 養(yǎng)豬發(fā)酵床墊料微生物群落動(dòng)態(tài)及其對(duì)豬細(xì)菌病原生防 作用 的研究 學(xué) 科 門 類： 農(nóng)學(xué) 一級(jí)學(xué)科名稱： 植物保護(hù) 二級(jí)學(xué)科名稱： 農(nóng)藥學(xué) 研 究 方 向： 環(huán)境微生物 研 究 生： 指 導(dǎo) 教 師 ： 教授 研究員 研究員 完 成 時(shí) 間： 二 O 一一 年四月 s of on 2011 獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人聲明，所呈交的學(xué)位（畢業(yè)）論文，是本人在指導(dǎo)教師的指導(dǎo)下獨(dú)立完成的研究成果，并且是自己撰寫的。盡我所知，除了文中作了標(biāo)注和致謝中已作了答謝的地方外，論文中不包含其他人發(fā)表或撰寫過的研究成果。與我一同對(duì)本研究做出貢獻(xiàn)的同志，都在論文中作了明確的說明并表示了謝意，如被查有侵犯他人知識(shí)產(chǎn)權(quán)的行為，由本人承擔(dān)應(yīng)有的責(zé)任。 學(xué)位（畢業(yè)）論文作者親筆簽名： 日期： 論文使用授權(quán)的說明 本人完全了解福建農(nóng)林大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位（畢業(yè)）論文的規(guī)定，即學(xué)校有權(quán)送交論文的復(fù)印件 ，允許論文被查閱和借閱 ; 學(xué)?？梢怨颊撐牡娜炕虿糠謨?nèi)容，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存論文。 保密，在 年后解密可適用本授權(quán)書。 不保密，本論文屬于不保密。 學(xué)位（畢業(yè)）論文作者親筆簽名： 日期： 指導(dǎo)教師親筆簽名： 日期： 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 i 目錄 中文摘要 . I . 一章 緒 論 . 1 1 畜禽養(yǎng)殖污染現(xiàn)狀 . 1 2 豬常見細(xì)菌性病害 . 2 豬大腸桿菌病 . 2 豬沙門氏菌病 . 3 豬鏈球菌病 . 3 巴氏桿菌病 . 4 豬副嗜血桿菌病 . 4 其他細(xì)菌性病害 . 4 3 微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬技術(shù)簡(jiǎn)介 . 5 4 脂肪酸生物標(biāo)記在微生物群落研究中的應(yīng)用 . 6 5 本研究的目的及意義 . 7 第二章 養(yǎng)豬發(fā)酵床墊料微生物組成結(jié)構(gòu)的變化 . 8 1 引言 . 8 2 材料與方法 . 8 養(yǎng)基和試劑 . 8 品采集與處理： . 8 生物的分離與培養(yǎng)： . 8 料中各種微生物的數(shù)量計(jì)算方法： . 9 3 結(jié)果與分析 . 9 生物發(fā)酵床細(xì)菌數(shù)量變化 . 9 生物發(fā)酵床真菌數(shù)量變化 . 9 生物發(fā)酵床放線菌數(shù)量變化 . 10 4 討論 . 10 第三章 養(yǎng)豬發(fā)酵床墊料 微生物群落多樣性 . 12 1 引言 . 12 2 材料與方法 . 12 試菌株 . 12 養(yǎng)基和試劑 . 12 株的 取 . 12 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 定 . 12 6S 列分析 . 13 3 結(jié)果與分析 . 13 質(zhì)墊層細(xì)菌的 16s 定 . 13 同使用時(shí)間基質(zhì)墊層可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性變化 . 15 4 討論 . 18 第四章 養(yǎng)豬發(fā)酵床墊料微生物脂肪酸生態(tài)學(xué)特性 . 20 1 引言 . 20 2 材料與方法 . 20 本采集與保存 . 20 肪酸提取試劑 . 20 肪酸鑒定儀器 . 21 肪酸提取步驟 . 21 測(cè) . 21 據(jù)分析 . 21 3 結(jié)果與分析 . 22 生物脂肪酸生物標(biāo)記總量的變化動(dòng)態(tài) . 22 生物脂肪酸生物標(biāo)記在基質(zhì)墊層中的分布 . 23 質(zhì)墊層微生物脂肪酸生物標(biāo)記的分布特性 . 23 質(zhì)墊層 物標(biāo)記多樣性分析 . 32 4 討論 . 33 第五章 微生物發(fā)酵床墊料豬細(xì)菌病原種群動(dòng)態(tài) . 35 1 引言 . 35 2 材料與方法 . 35 養(yǎng)基和試劑 . 35 品采集與處理： . 35 腸桿菌和沙門氏菌的分離與培養(yǎng)： . 35 料中大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量的計(jì)算方法： . 36 腸桿菌和沙門氏菌的特異性檢測(cè) . 36 3 結(jié)果與分析 . 37 生物發(fā)酵床中大腸桿菌特異性檢測(cè)及其時(shí)空分布動(dòng)態(tài) . 37 生物發(fā)酵床中沙門氏菌菌群特異性檢測(cè)及其時(shí)空分布動(dòng)態(tài) . 38 生物發(fā)酵床微生物群落與豬病原菌相關(guān)性分析 . 39 質(zhì)墊層磷脂脂肪酸（ 物標(biāo)記和病原菌數(shù)量的相關(guān)性分析： . 40 4 討論 . 41 第六章 養(yǎng)豬發(fā)酵床墊料細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種及其對(duì)豬細(xì)菌病原抑制作用 . 43 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 引言 . 43 2 材料與方法 . 43 試菌株與培養(yǎng)基 . 43 種活化： . 43 菌圈法測(cè)定： . 44 勢(shì)種的確定 . 44 3 結(jié)果與分析 . 44 生物發(fā)酵床細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種的確定 . 44 生物發(fā)酵床細(xì) 菌對(duì)靶標(biāo)大腸桿菌和沙門氏菌的抑制效應(yīng) . 46 4 討論 . 48 第七章 結(jié)論與展望 . 50 1 結(jié)論 . 50 2 展望 . 51 參考文獻(xiàn) . 52 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 I 摘要 生豬疫病一直是困擾養(yǎng)豬業(yè)的一道難題，豬舍的不良環(huán)境是許多疾病的誘因，只有給豬提供舒適、干凈的生活環(huán)境才能減少生豬疫病的發(fā)生，提高生豬的生產(chǎn)能力。微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬作為近年我 國(guó)引進(jìn)的一種新興養(yǎng)豬模式，實(shí)現(xiàn)了養(yǎng)豬無臭味，零排放的目的。利用發(fā)酵床養(yǎng)豬最大的好處是給豬在其生態(tài)環(huán)境中創(chuàng)造了一道益生菌抵抗有害菌的天然防線，提高了動(dòng)物的免疫水平，大大降低了發(fā)病率、死亡率。 本研究采用平板分離法和磷脂脂肪酸（ 對(duì)微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬豬舍基質(zhì)墊層微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性 、 病原菌分布動(dòng)態(tài)進(jìn)行研究 ，結(jié)果如下 ：（ 1） 通過系統(tǒng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵床豬舍基質(zhì)墊層中含有豐富的微生物種群，從基質(zhì)墊層中分離的細(xì)菌經(jīng)鑒定，屬于 22 個(gè) 不同 屬。（ 2） 微生物發(fā)酵床中細(xì)菌是優(yōu)勢(shì)菌，分布數(shù)量達(dá)到了 108 數(shù)量級(jí)，其群落動(dòng)態(tài)呈 現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)， 而 真菌和放線菌的 分布 數(shù)量相對(duì)于細(xì)菌低 3 4個(gè)數(shù)量級(jí)。 （ 3） 基質(zhì)墊層有一定量大腸桿菌和沙門氏菌分布， 但是墊料使用一段時(shí)間后，其分布數(shù)量呈現(xiàn)不斷下降趨勢(shì)，至第 5 個(gè)月，降至一個(gè)極低的水平。 大腸桿菌 分布數(shù)量 與細(xì)菌 呈現(xiàn) 顯著負(fù)相關(guān)（ r=與放線菌顯著正相關(guān)（ r=沙門氏菌 分布數(shù)量 與細(xì)菌 呈 顯著負(fù)相關(guān)（ r=與真菌（ r=放線菌（ r=顯著正相關(guān)。（ 4）發(fā)酵床技術(shù)使用的 先導(dǎo) 菌短短芽孢桿菌（ 基質(zhì)墊料中 以優(yōu)勢(shì) 菌 穩(wěn)定存在， 并 對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌有明顯的抑制作用。通過抑菌圈實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)墊層 有些 細(xì)菌對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌有明顯的抑制作用，能有效抑制病原微生物的生長(zhǎng)。其中發(fā)酵床基質(zhì)墊料 中的 芽孢桿菌屬細(xì)菌對(duì)生豬疫病防治中 起 主要作用。 （ 5）采用磷脂脂肪酸（ ，分析不同使用時(shí)間 發(fā)酵床基質(zhì)墊層微生物群落 結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化 ， 結(jié)果從不同使用時(shí)間 發(fā)酵床基質(zhì)墊層共檢測(cè)出了 41 個(gè)脂肪酸生物標(biāo)記， 表明 基質(zhì)墊層中含有大量 不同 的微生物 類型；分析 墊料使用過程中 多樣性 指數(shù)變化 ，發(fā)現(xiàn)各多樣性指數(shù)變化 不大， 表明發(fā)酵床墊料 群落結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定。 關(guān)鍵詞：微生物發(fā)酵床；細(xì)菌性病害；微生物群落；磷脂脂肪酸；生物防治 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 he a a in a It of of by a a of in to a to of In of of in of as (1) As in (2)of in at a 108 g of 103 104 g. 22 (3) in a of of to at a It (4) as a be in as to . . by . . It . an in (5) of in of 1 a in it of of 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 第一章 緒 論 隨著 畜牧業(yè)生產(chǎn)規(guī)模日益擴(kuò)大 ，我國(guó)以集約化 和 規(guī)?；癁橹鞯男笄蒺B(yǎng)豬業(yè)得到 了 迅猛發(fā)展，為提高城鄉(xiāng)居民 的 生活水平 作 出了巨大貢 獻(xiàn)， 但是 與此同時(shí)養(yǎng)豬業(yè)也成為農(nóng)村面源污染的主要來源之一，破壞了生態(tài)環(huán)境，嚴(yán)重阻礙了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展 1。 近幾年 ， 從日本引進(jìn)并迅速在中國(guó)改進(jìn)、推廣、應(yīng)用的微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬技術(shù)取得了很大的成效。該技術(shù)主要借助于養(yǎng)豬墊料中 先導(dǎo) 微生物 （糞污降解菌） 的作用， 利用先導(dǎo)微生物啟動(dòng)墊料發(fā)酵，形成以先導(dǎo)菌為優(yōu)勢(shì)菌的微生物群落結(jié)構(gòu)， 達(dá)到降解畜禽排泄物，減少了污染的目的。許多研究表明 2發(fā)酵床養(yǎng)豬與傳統(tǒng)的養(yǎng)豬模式相比， 可以在 很大程度上改善 豬的生活環(huán)境，豬疾病的發(fā)生情況明顯降低，死亡率下降 。 1 畜禽養(yǎng)殖污染現(xiàn)狀 隨著畜牧 業(yè)規(guī)?；a(chǎn)的不斷發(fā)展，不可避免地 會(huì) 對(duì)周圍 的 環(huán)境 造成 污染。畜產(chǎn)廢棄物中 的 糞便及污水 的 數(shù)量最大，如 果 不經(jīng)處理隨意 地 向周邊排放，不僅 僅 危害家畜本身，對(duì)周圍環(huán)境的 空氣、 水體、土壤和作物造成嚴(yán)重 的 污染，還 將 會(huì)成為 寄生蟲 、 畜禽傳染病 和人畜共患病的傳染源。因此解決養(yǎng)豬業(yè) 中 的糞污排放問題對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展有著重 要 的意義。畜牧生產(chǎn)對(duì)周圍環(huán)境 造成 的污染主要包括以下幾個(gè)方面： （ 1）惡臭氣體污染： 養(yǎng)殖場(chǎng)惡臭除 了 畜禽的 呼出氣體、 皮膚分泌物、外激素等特有的 臭氣外，還有來自 糞便 在堆放過程中有機(jī)物的腐敗分解所產(chǎn)生的 硫化物、 氨氣 、吲哚等 200 多種惡臭物質(zhì)。這些惡臭物質(zhì)會(huì) 對(duì)人的神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生刺激 ，對(duì)呼吸中樞產(chǎn)生毒害，使人感到 惡心、 頭痛，嚴(yán)重影響人們生活 的 質(zhì)量，同時(shí)也 會(huì) 影響到畜禽的健康生長(zhǎng)。 在這些惡臭氣體中，影響最為嚴(yán)重的是硫化氫和氨氣。當(dāng)硫化氫濃度達(dá)到 200 300 時(shí)，會(huì)引起畜禽輕度中毒；氨氣濃度達(dá)到 50 時(shí)，仔豬的增重率下降 12%，達(dá)到 100150 時(shí)，增重率下降 30%5。 （ 2）病原微生物污染：畜禽體內(nèi)的微生物主要通過 其 消化道排出體外，糞便為 其 主要載體。病豬和帶菌豬的糞便中含有 細(xì)菌、病毒、 寄生蟲，這 些病原微生物在糞便中 的感染性可以維持 很長(zhǎng)時(shí)間。同時(shí)，由養(yǎng)殖場(chǎng)排出的大量粉塵 中 攜帶著 數(shù)量 和種類眾多的微生物，為微生物提供營(yíng)養(yǎng)和庇護(hù)，大大增強(qiáng)了微生物的活力 、 延長(zhǎng) 了其生存 的 時(shí)間，這些塵埃和微生物可 以 隨風(fēng)傳播，從而擴(kuò)大了污染和危害范圍。這些病原微生物如 果 不適當(dāng)處理， 將 會(huì)成為危險(xiǎn)的傳染源，造成疫病 的 傳播，不僅影響畜禽健康生長(zhǎng)， 同事 也會(huì)威脅 到 人體健康。 （ 3）藥物、添加劑污染：在飼料中添加抗生素等藥物可以提高畜禽的生產(chǎn)力和抗病力 。 因此，養(yǎng)殖場(chǎng)中普遍采用抗生素來 預(yù)防 畜禽疾病。但 由于 長(zhǎng)期盲目地 在 飼料中添加抗生素等藥物 ， 引 起畜禽體內(nèi) 的 殘留，蓄積， 并 通過生物鏈進(jìn)入人體，長(zhǎng)期積累在人體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生毒副作用，危害人體的健康。有些 抗生素 及 化學(xué)藥物 殘留如 鏈霉素 、 青霉素 以福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 2 及新生霉素 等 會(huì)使人發(fā)生過敏反應(yīng)甚至更 為 嚴(yán)重的后果。有些農(nóng)藥、治療用化學(xué)藥品和霉菌素等通過畜禽產(chǎn)品的殘留形式轉(zhuǎn)移到人體，逐漸在人體中積累、濃縮、損害組織、甚至導(dǎo)致癌變。 （ 4）金屬元素污染：在飼料中添加一些可以調(diào)節(jié)動(dòng)物代謝的元素，如 鋅 、 銅 、鐵、砷等微量元素， 可以 在 一定程度上增強(qiáng)畜禽 的 抗病能力，提高畜禽的生長(zhǎng)性能，但這些元素被畜禽直接吸收利用的很少，更多是通過糞便 而 排出體外。這 些含在畜禽糞便中的金屬元素如 果 不合理處理 的話 ， 將 會(huì)造成嚴(yán)重的后果，一旦 污染 土壤，作物在污染的土壤中生長(zhǎng)時(shí)，有害元素被作物大量吸收后會(huì)殘留在農(nóng)產(chǎn)品中，通過食物鏈進(jìn)入動(dòng)物或人體，對(duì)人體健康造成威脅。 （ 5）氮、磷污染：畜禽糞便中含有大量的無機(jī)態(tài)氮、磷和氮、磷化合物。據(jù)報(bào)道，豬大約將 食入氮和 食入磷排出體外 6，畜禽糞便中的氮、磷可以轉(zhuǎn)化成硝酸鹽和磷酸鹽，并通過 雨水沖刷 或 下滲 流入河流湖泊，造成 地表水源 和 地下水源 的 污染，造成水體的富營(yíng)養(yǎng)化，使藻類 及 其他水生植物大量繁殖，這些水生植物 消耗 水體中的溶解氧，導(dǎo)致水生動(dòng)物缺氧死亡，死亡的水生動(dòng)物腐爛后，會(huì)進(jìn)一步加劇水體惡化。在我國(guó)一些地方，飲用水中 含量高達(dá) 300 ，超過飲用水 小于 50 的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，醫(yī)學(xué)研究表明，引用水中 含量超過 90 將會(huì)危及人體健康 7。 2 豬常見細(xì)菌性病害 近年來，在規(guī)?；i場(chǎng)中，豬細(xì)菌病的危害愈加嚴(yán)重，在一些免疫抑制疾病發(fā)生的地區(qū)尤為常見。中國(guó)工程院院士陳煥春教授指出當(dāng)前規(guī)模豬場(chǎng)病毒病趨向緩和 ， 而細(xì)菌病則呈上升態(tài)勢(shì) 8。其中鏈球菌、大腸桿菌、巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌為 4種主要細(xì)菌 病。 大腸桿菌病 大腸桿菌（ 1885年由 直被認(rèn)為是人和動(dòng)物腸道內(nèi)的正常菌群的主要成員之一，直到 20世紀(jì)中葉，人們才認(rèn)識(shí)到一些特殊血清型的大腸桿菌對(duì)人和動(dòng)物有病原性，尤其 容易 引起嬰兒和幼畜的嚴(yán)重腹瀉和敗血癥。 1955年， 大腸桿菌對(duì)環(huán)境的抵抗力不強(qiáng)， 60 15 其滅活 ，一般的消毒藥品都易將其殺死。大腸桿菌有 體抗原）、 面抗原）和 毛抗原）三種。 ，屬于磷脂、多糖和蛋白質(zhì)的復(fù)合物，也就是菌體內(nèi)毒素，耐熱。 多數(shù)都為包膜物質(zhì)，也有一些為菌毛，如 起仔豬黃痢的大腸桿菌菌毛，最常見的是 有鞭毛的菌株中存在，與致病性無關(guān)。致病性大腸桿菌與大量存在于腸道內(nèi)的非致病性大腸桿菌，在形態(tài)、染色、培養(yǎng)特性和生化反應(yīng)等反面并無差別，但在抗原構(gòu)造上有所不同。 豬大腸桿菌?。?由致病性大腸桿菌引起豬腸道傳染病，主要表現(xiàn)為仔豬黃?。?仔豬白痢（ 仔豬水腫?。?of 種 9。仔豬黃痢多發(fā)生于 1周齡以內(nèi)的哺乳仔豬，尤其是福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 3 1 3日齡仔豬。通常一頭仔豬發(fā)病，很快會(huì)傳至整窩，死亡率極高。一年四季均有發(fā)生。仔豬白痢主要引起 10 30日齡仔豬非敗血性、急性腸道傳染病，影響仔豬生長(zhǎng)發(fā)育。 1020日齡發(fā)病最多。一年四季均可發(fā)生，嚴(yán)冬、炎熱及陰雨連綿季節(jié)發(fā)病較多。仔豬白痢和仔豬黃痢稱為仔豬腹瀉性大腸桿菌病。仔豬水腫病是由致病性大腸桿菌引起的一種 急性、散發(fā)性腸毒血癥。該病的發(fā)病率不高，但病死率很高，常出現(xiàn)內(nèi)毒素中毒的休克癥狀并迅速死亡。通常由帶菌母豬傳給仔豬，呈地方性流行。該病主要發(fā)生于斷乳的仔豬，4月