【畢業(yè)學位論文】(Word原稿)柑橘木虱內生細菌群落結構及影響因素的研究-微生物應用與基因工程

福建農林大學碩士學位論文 1 分類號： 單位代碼： 10389 密 級： 學 號： 1101737 福建農林大學碩士學位論文 柑橘木虱內生細菌群落結構及影響因素的研究 學 科 門 類：理學 一級學科名稱：生物學 二級學科名稱：微生物學 研 究 方 向 ： 微生物應用與基因工程 研 究 生： 指 導 教 師： 研究員 完 成 時 間：二 O 一二年一月 福建農林大學碩士學位論文 2 he of 2013 福建農林大學碩士學位論文 3 獨創(chuàng)性聲明 本人聲明，所呈交的學位（畢業(yè)）論文，是本 人在指導教師的指導下獨立完成的研究成果，并且是自己撰寫的。盡我所知，除了文中作了標注和致謝中已作了答謝的地方外，論文中不包含其他人發(fā)表或撰寫過的研究成果。與我一同對本研究做出貢獻的同志，都在論文中作了明確的說明并表示了謝意，如被查有侵犯他人知識產權的行為，由本人承擔應有的責任。 學位（畢業(yè)）論文作者親筆簽名： 日期： 論文使用授權的說明 本人完全了解福建農林大學有關保留、使用學位（畢業(yè)）論文的規(guī)定，即學校有權送交論文的復印件，允許論文被查閱和借閱 ; 學?？梢怨颊撐牡娜炕虿糠謨?容，可以采用影印、縮印或其他復制手段保存論文。 保密，在 年后解密可適用本授權書。 不保密，本論文屬于不保密。 學位（畢業(yè)）論文作者親筆簽名： 日期： 指導教師親筆簽名： 日期 福建農林大學碩士學位論文 4 目錄 中文摘要 錄 第一章 緒論 1研究背景 2研究現(xiàn)狀 蟲 內共生菌及其與寄主相互關系 研究 3研究方法與技術 6 S 因序列分析的應用 時熒光定量 4本研究的目的和意義 5本研究的技術路線 第二章 柑橘木虱內生細菌培養(yǎng)基的優(yōu)化和鑒定 1 引言 2材料與方法 篩選 6s 3結果與分析 福建農林大學碩士學位論文 5 6s 橘木虱內生細菌生理生化鑒定 4討論 第三章 寄主不同器官和木虱內生菌的研究 1 引言 2 材料和方法 、莖、葉）內生細菌的分離 6S 定 同器官和木虱內生細菌的相關性分析 3結果與分析 同器官和木虱內生細菌的分離與鑒定 同器官和木虱內生細菌相關性關系 第四章 柑橘木虱內生菌 1引言 2材料和方法 3結果與分析 木虱內生菌 4討 論 第五章 木虱內生細菌多樣性及實時熒光定量檢測 福建農林大學碩士學位論文 6 1 引言 2材料與方法 3結果與分析 橘木虱內生 細菌多樣性 6S 6統(tǒng)發(fā)育樹分析 株標準曲線的制備 4 討論 第六章 展望 附錄 參考文獻 福建農林大學碩士學位論文 7 中文摘要 本文主要通過微生物傳統(tǒng)分離鑒定和分子生物學方法相結合研究柑橘木虱內生細菌群落結構以及不同品種柑橘內生細菌與木虱內生細菌的相關性，并對不同溫度處理過的木虱內生細菌 行實時熒光定量分析，期望為柑橘木虱的防治奠定基礎。主要有以下研究結果： 在各種試驗操作條件、培養(yǎng)條件一致的情況下，通過 正交試驗 34）篩選優(yōu)化木虱內生細菌分離培養(yǎng)基，結果表明，在所設計的各種影響因素、水平中，分離柑橘木虱內生細菌最佳的培養(yǎng)基配方為培養(yǎng)基為 淋巴為柞蠶血淋巴、生理鹽水濃度為 0。利用這種培養(yǎng)基可以分離出盡大可能多的柑橘木虱內生細菌。 根據菌 落形態(tài)的差異，將正交試驗中分離到進行初步分類的柑橘木虱內生細菌通過純化培養(yǎng)，提取細菌 行 16s 定。內生細菌經鑒定分別為 木糖葡萄球菌 （ 葡萄球菌屬 （ 、 芽孢桿菌屬 （ 、不可培養(yǎng)腸桿菌屬（ 、 短小桿菌屬 （ 、 微桿菌屬 （ 、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（ 檸檬色短小桿菌（ 利用優(yōu)化后 2個隨機選取的柑橘品種的不同部位的內生細菌以及其上面的五齡木虱內生細菌進行分離鑒定，分析其相關性，結果表明 參考 3種昆蟲 取方法和試劑盒法提取木虱內 生菌 通過利用原核生物細菌 16s 用引物特異性地將內生細菌 增出來，結果顯示，改進的 3種方法提取的總 整性較低， 增需要進一步摸索。 劑盒法提取 的總 度相對較低，但是濃度為 12 15 L， 1增產物可以很好的進行克隆測序。由于 劑盒法提取柑橘木虱內生菌 作簡單，結果穩(wěn)定，純度高，重復性好，節(jié)省時間，所以針對木虱內生菌總 劑盒提取法應為首選方法。 利用效果較好的試劑盒法提取木虱內生細菌 過分子生物學技術以 16果顯示隨機挑取的 100 個克隆子進行測序比對分析后， 11 個克隆子經 16S 定為 15 個為 16 個為 63 個為 別為 1 個，最高相似度分別為 99%、 100%。系統(tǒng)發(fā)育樹分福建農林大學碩士學位論文 8 析結果為 建的標準曲線判定系數(shù)分別達到 在 上， 說明模板濃度與 之間呈非常良好的線性關系，回歸方程分別為為 一 + 一 + 木虱體內 均含量成蟲與若蟲及溫度處理后的成蟲木虱平均含量差異顯著，若蟲和處理后成蟲體內平均含量差異顯著，同一齡期成蟲 250C 處理結果與 350C 處理 1d、 3d 后結果差異不顯著，但與處理 5d 后差異顯著。 成蟲與若蟲體內含量差異不顯著，但與同一齡期成蟲處理后差異顯著。同一齡期溫度處理后差異不顯著。本研究將傳統(tǒng)的微生物分析技術和分子生物學技術相結合，多方面探索柑橘木虱內生細菌群落結構及相關性因素，為柑橘木虱和柑橘黃龍病的生物防治提供新思路和理論依據。 關鍵詞：柑橘木虱；內生細菌；群落結構； 16因；實時熒光定量 建農林大學碩士學位論文 9 by of of by we to a 9 (34) to of in of SB is to of on of 6s NA SB to 2 of of on to - - - - - - - to 6s of to NA CR a NA is 2 15 L, it be L. be to NA so in of of NA be NA by 6NA to 00 11 6 s 15 16 63 建農林大學碩士學位論文 10 9% 00%, - - - - - - - of it t t = t = x + in of of by a is 50C no d, 3 d 50C, d. no of by to in of a of 16NA 建農林大學碩士學位論文 11 第一章 緒論 1 研究背景 橘黃龍病的發(fā)生及危害 柑橘黃龍病 (導致柑橘減產最后死亡的一種世界性的嚴重的病害，具有毀滅性 (鄧超， 2010；孫大光， 2012)。在不同國家 (地區(qū) )，該病曾有不同的名稱，中國大陸稱為黃龍病，臺灣稱為立枯病 (1，印度稱為梢枯病 (菲律賓稱為葉斑駁病 (，印度尼西亞稱為葉脈韌皮部退化病 ( ，南非稱為青果病 ( 等。 1995 年，在中國福建省福州市召開的國際柑桔病害會議中，決定不用 青果病 這一名稱，統(tǒng)一稱該病害為 黃龍病 (胡文召，周常勇 2010 )。 我國最早在 1919 年廣東省潮汕地區(qū)發(fā)現(xiàn)了柑橘黃龍病（賴傳稚，忠文，黎起秦， 2003）。 1950 年后，柑橘黃龍病在廣東等地柑橘主產區(qū)蔓延開來； 1970 1980 年間，在國內其他個別產區(qū)也被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，其對柑橘產量為害程度不斷加重（白華菊，龍夢玲 2009）。柑橘黃龍病不但在我國發(fā)生，已知的有近 40 個不同的亞洲、非洲、歐洲、南北美國家都發(fā)生了柑橘黃龍?。?2006）；該 病在多個國家的發(fā)生造成了柑橘世界性的減產。 柑橘黃龍病是對于世界柑橘產量造成最具毀滅性的病害。柑橘一旦感染黃龍病，會形成均勻黃化型或著斑駁型黃梢，后期就會表現(xiàn)為一系列癥狀 缺鋅狀花葉等，直接表現(xiàn)經濟壽命短、果品質低劣、產量低 , 造成嚴重的經濟損失（范國成 , 劉波 , 吳如健 , 李韜 , 蔡子堅 , 柯沖 , 2009）。至今，柑橘黃龍病菌還不能人工培養(yǎng)，主要通過控制傳播媒介木虱和生物控制來防治，由于木虱品種的不同和生物防治的局限性，許多國家不能通過防治木虱和生物防治進行有效的消除柑橘黃龍病的危害 ( 1993)。具有柑橘癌癥之稱的柑橘黃龍病，目前，主要通過挖除病株，加強檢疫防疫、嚴防木虱來阻止黃龍病給柑橘產業(yè)造成的損失（ 鄧鐵軍， 2005）。 橘黃龍病病原 研究發(fā)現(xiàn)，引發(fā)柑橘黃龍病的是一種生活在韌皮部難培養(yǎng)的桿菌微生物，目前主要有三個種：亞洲種 (非洲種 ( 和美洲種（ 目前還沒有發(fā)現(xiàn)一種基于植物的以一個宿主特定于黃龍病的反應系統(tǒng)為基礎的診斷方法（ 2008）。 早期，關于黃龍病的病原問題，有過很多爭論。 20 世紀 60 年代前期，有人根據黃龍病病樹中經常檢測到有柑橘衰退病毒 ( 的存在，認為中國臺灣的立枯病、印度的梢枯病和中國大陸的黃龍病的病原是柑橘衰退病毒（ 1963; 陳延熙，梅汝鴻 , 1965） 。 60 年代中期，有人試驗證實印尼葉脈韌皮部和非洲青果病退化病通過嫁接能夠傳染，因此認為病原是病毒?。?1965; 1965）， 70 年代末期，我國研究人員觀察到病原的存在，把它稱為類立克次氏體； 80 年代初中期，研究人員再把它歸屬于類細菌（ 薄壁型細菌（張景寧 , 劉仲健 , 1994）。亞洲黃龍病福建農林大學碩士學位論文 12 病原 ( 和非洲黃龍病病原 ( 通過 16隆測序并在 據庫進行序列比對后，進一步證實黃龍病的病原菌是細菌（ 1994）。研究還發(fā)現(xiàn)中國黃龍病與非洲青果病在傳播媒介、血清學方面和熱敏感性流行區(qū)域都存在一定的差異，分別稱為亞洲型和非洲型（孫大光 , 2012）。 橘黃龍病的傳播 黃龍病的傳播途徑主要是病株與健康植株間的嫁接傳播、病樹接穗繁殖、接穗和病苗的遠距離傳播以及柑橘木虱通過刺吸病株攜帶黃龍病菌后再次刺吸健康植株進行傳播。其中木虱是重要的傳播媒介，木虱 傳播是最重要的一條途徑。另外，黃龍病病原還能夠通過菟絲子寄生進行傳播，但是不能夠通過與汁液的磨擦和與土壤接觸進行傳播（ 莫元妹 , 2009）。 2 研究現(xiàn)狀 橘木虱研究現(xiàn)狀 柑橘木虱（ 昆蟲綱同翅目（ 虱科（ 成蟲個體小，長約 3 體為青灰色、有灰褐色斑點 ,體被有白粉。前翅半透明 ,散布褐色斑紋，翅緣顏色較深；腹背灰黑色，腹面淺綠色，在生殖期間腹部橙黃色，足灰黃色，跗節(jié) 2 節(jié)，末節(jié)黑色（李麗萍 , 2009）。柑橘木 虱主要包括非洲柑橘木虱（ 亞洲柑橘木虱（ 其中，非洲木虱主要在非洲地區(qū)分布，亞洲柑橘木虱在亞洲和美洲等地區(qū)分布廣泛。 20 世紀初，我國的木虱主要在廣東、廣西、福建、臺灣等省分布。由于全球性氣候變暖，木虱逐漸北遷，目前已經在四川、江西、 湖南、貴州等地蔓延（杜丹超 , 鹿連明 , 張利平 , 胡秀榮 , 黃振東 , 陳國慶 , 2011）。 柑橘木虱的主要寄主是柑橘和蕓香科植物，它不但是一種重要的蟲病害，還是傳播柑橘黃龍病的唯一自然 媒介。成蟲、若蟲在柑橘嫩梢、幼葉、新芽上吸食為害，造成嫩梢幼芽干枯萎縮 ,新葉畸形卷曲（李麗萍， 2009）。木虱一旦取食黃龍病病株，就會終生攜帶黃龍病病原，帶毒木虱取食 24h 后就可以傳毒。黃龍病的傳播速度取決于柑橘木虱的數(shù)量，兩者成正比關系（袁輝 , 李安國 , 2007）。柑桔木虱是唯一一種非人為因素的傳病媒介，只要田間沒有木虱，既使有黃龍病病株存在，該病原也不會傳播（鄧明學 , 2006）。 柑橘黃龍病是柑橘最嚴重的病害。由于黃龍病菌到目前為止還不能人工培養(yǎng)，植株如果感染發(fā)病，就會直接造成果實產量下 降，品質變差，經濟生產價值大打折扣，至今還沒有徹底消除該病菌的方法（ 2004）。趙學源（ 2008）闡述了廣東楊村柑橘農場防治黃龍病大發(fā)生的經驗，把嚴格防治柑橘木虱作為治理黃龍病的一項關鍵性措施。 目前，防治柑橘木虱的方法主要包括農業(yè)防治、 化學防治和生物防治等。我國目前主要還是以應用化學防治方法來防治木虱，新梢期是木虱發(fā)生高峰期，在此期間化學防治效果是最明顯有效的。但化學農藥頻繁的使用，導致生態(tài)環(huán)境污染 、農藥殘留、次要害蟲猖 撅 ,柑桔木虱抗藥性增強。國外，生物防治是有效控制柑桔木虱的措施之一。福建農林大學碩士學位論文 13 生物防治主要通過天敵昆蟲的控制和病原微生物對木虱的控制實現(xiàn)木虱危害的防治，該防治方法既能有效的控制木虱，又減少生態(tài)環(huán)境污染，最終達到生物安全的要求。雖然提倡利用天敵，但還是要慎重，避免它帶來的負面影響（章玉蘋 , 李敦松 , 黃少華 , 張寶鑫 , 2009）。病原微生物防治木虱具有良好的發(fā)展前景，已有研究發(fā)現(xiàn)木虱病原真菌如擬靑霉屬的宛氏擬青霉（ 白僵菌屬的球孢白僵（ 、筍頂孢霉屬蚜筍頂孢霉（ 、鐮孢屬黃色鐮孢（ 匐柄霉屬匐柄霉（ 、枝孢屬尖孢枝孢菌（ 等都有使柑橘木虱致病的作用（陳祝安 , 曹光照 , 許益?zhèn)?, 黃基榮 , 葛嵐屏 , 1985)。因此，大力探索柑橘木虱生物防治是未來防治木虱的一重大課題，是實現(xiàn)木虱可持續(xù)防治的一種趨勢。 蟲內生菌研究現(xiàn)狀 蟲內共生菌及其與寄主相互關系 昆蟲體內存在大量的 微生物，二者共生早已是種普遍的現(xiàn)象。昆蟲食物往往缺乏一種甚至多種生存不可缺少的營養(yǎng)物質，這些營養(yǎng)素可能被其體內微生物補足，補足營養(yǎng)素主要是通過其生物合成活動（ 1985），這就使昆蟲在進化過程與微生物趨向于形成一種內共生的關系，特別是同翅目（主要有蚜蟲、木虱、粉虱、介殼蟲和蟬）和鞘翅昆蟲尤為明顯（ 1965）。內共生菌（ 由一個自由體演變而來的。內共生菌的結構與功能和線粒體、葉綠體相似，在宿主胞外單獨復制，有單獨的 白質合成系統(tǒng)，不受宿主 防衛(wèi)機制的干擾（ 1981）。 內共生菌分為初生內共生菌（ 次生內共生菌（ 它在昆蟲體內分布十分廣泛，幾乎所有的昆蟲體內都有內共生菌。 1887 年，蟑螂的內共生菌首先被發(fā)現(xiàn)，為丘氏蟑螂桿菌（ 象鼻蟲體內也存在這一類內共生菌（ 991）。已有研究表明，在新熱帶區(qū)， 16以上的昆蟲體內有 共生，它在共生細菌類群中分布可能是最廣的、豐度最大的內共生菌 ( 龔鵬 , 沈佐銳 , 李志紅 , 2002)。 內共生菌與宿主之間是相互影響、相互依賴、互惠共生、協(xié)同進化的關系。節(jié)肢動物許多都是依賴其內共生菌提供必需物質來補足營養(yǎng)（ 譚周進 , 肖啟明 , 謝丙炎 , 楊宇紅 , 馮蘭香 , 2004）。褐飛虱內共生菌自身有高活性的尿酸酶，這種酶利用寄主的代謝物尿酸合成必需氨基酸促使昆蟲生長發(fā)育，褐飛虱腹部脂肪體細胞的內共生菌則能夠合成所需蛋白質以供胚胎和胚后發(fā)育，促進胚胎腹節(jié)分化（ 1996）。布赫納氏菌（ 宿主蚜蟲提供多種必需氨基酸，內共生菌也可能為蚜蟲提供植物細胞壁分解酶、必需的營養(yǎng)物質或共生素蛋白促使若蟲發(fā)育。去除共生菌蚜蟲不能合成體內蛋白（李獻輝 , 李保平 , 2006）。類酵母共生菌（ 在于稻飛虱脂肪體細胞，提供稻飛虱自身不能合成的營養(yǎng)物質（包括必需氨基酸、脂肪酸、固醇類等）；至今還沒有發(fā)現(xiàn)無菌個體稻飛虱，減少飛虱體內酵母菌數(shù)量，其生長發(fā)育會出現(xiàn)延遲，存活率、羽化率、產卵量下降等現(xiàn)象（王國超 , 傅強 , 張志濤 , 2005）。蟑螂的內福建農林大學碩士學位論文 14 共生菌能夠產生尿酸降解酶等來代謝蟑螂體內的氮素廢棄物。初生內共生菌對宿主昆蟲的生存和生育是必要的，次生內共生菌對宿主并不重要，煙粉虱初生內共生菌給宿主煙粉虱提供特定的營養(yǎng)物質，對煙粉虱的適應性、攜毒的可能性、生物型具有影響。內共生菌產生的 白保護病毒體內的運輸，因此其對昆蟲傳播植物病毒也是必要的（譚周進 , 肖啟明 , 謝丙炎 , 楊宇紅 , 馮蘭香 , 2005）。 研究 線蟲及節(jié)肢動物門體內廣泛存在，是一種共生細菌，最早由 庫蚊 巢中發(fā)現(xiàn)， 1936 年正式定名為 龔鵬 , 沈佐銳 , 李志紅 , 2002）。 1971 年， 現(xiàn) W. 蚊子中引起雜交不親和，也就是體內不含 雌蚊的卵接受含 雄蚊授精后，受精卵存活不了（ 1973）。此后隨著研究的展開， 漸被一些生物學家關注。 僅分布廣泛，對宿主還有非常不一般的影響。它能夠影響宿主的生殖行為，出現(xiàn)細胞質不親和（ 誘導雌性化（ 誘導孤雌生殖（ 現(xiàn)象，且能夠把這些現(xiàn)象垂直傳遞下去（ 施婉君 , 程家安 , 2002）。由于上述 宿主的生殖調控作用，有學者提出通過對 人為控制來改變宿主的生殖力，從而減少甚至消除害蟲。 昆蟲內共生菌的研究為植物病原的防治提供新的方法，內共生菌的減少或消除會導致病害的死亡或降低傳毒的能力和效率（譚周進 , 肖啟明 , 謝丙炎 , 楊宇紅 , 馮蘭香 , 2005） 虱內生菌研究現(xiàn)狀 同翅目類昆蟲主要包括蟬、飛虱、蚜蟲、介殼蟲、木虱等，是一個具有高度進化的微生物內共生菌系統(tǒng)的昆蟲群體，很多情況下，這些昆蟲擁有一個較大的器官，一個含菌 細胞（ 由內共生菌的獨特的含菌細胞組成 , 在細胞中潛伏著微生物群體（ 1965）。因為同翅目昆蟲終生依靠吸取營養(yǎng)不均衡的植物汁液為食，所以它們需要內共生微生物的幫助來彌補其營養(yǎng)不足的缺陷。事實上，已有研究證明同翅目內共生微生物參與宿主代謝過程，如必需營養(yǎng)物質的合成和廢棄物氮的循環(huán)利用（ 1995; 1989; 1996; 1998）。 在木虱腹部有一個大的、黃色的含菌體，該含菌體是由一個復雜的三種細胞組成的，包裹著許多單核的含菌細胞、合成組織和一個由許多扁平細胞組成包 圍。這個含菌體胞質內富含一種獨特的微生物，稱為 初級內共生菌，合胞體的胞漿充滿了另一種類型的細菌稱為 級內共生菌（ 1937; 1965; 1969; 1987; 1998; 1998）。另外，已報道木虱的含菌胞共生體和合胞體共生體屬于 變形菌綱（ （ 1998; 1998）。 除了含菌共生體，很多同翅類還含多種類型的兼性共生微生物，如蚜蟲體內的立克福建農林大學碩士學位論文 15 次氏體（ 1997），灰飛虱體內的沃爾巴克氏體屬（ 1995），介殼蟲體內螺原體（ 2000）等 , 使其共生微生物更加的復雜。目前的研究只發(fā)現(xiàn)了柑桔木虱體內存在合胞共生體（ 含菌體（ 桔黃龍病菌（ 沃爾巴克氏體（ 5 種內共生菌微生物（ ; 2008） 。 共生體，尤其 于控制柑橘木虱是一個可行的辦法，因為已有研究證明夠感染木虱（ 2000）。 它可以用來通過傳播來影響宿主定向能力或通過干擾宿主健康、影響植物病原體調節(jié)寄主免疫系統(tǒng)和抗菌產品。 已經報道的 沃爾巴克氏體（ 自然種群蚊子中降低寄主昆蟲健康和減少病原體的傳播的成功證明了使用這一方法具有可行性（ C 2013）。 橘內生細菌研究現(xiàn)狀 早期對于植物內生細菌的研究主要是對健康植物體內微生物存在與否進行論證。自1876 年 取無菌葡萄果汁后才開始了植物內生細菌的研究（劉云霞）。 1992 年，首次提出了植物理內生細菌的概念，認為植物內生菌是指能夠定殖在植物細胞間隙或細胞內，并與寄主植物建立和諧聯(lián)合關系的一類微生物（胡桂萍）。研究發(fā)現(xiàn)植物內生菌廣泛存在，地球 300000 種植物中都有內生菌的存在（ 2004）。隨著不同植物的根、莖、葉、花、果實等器官中 大量的內生細菌被更多的研究者分離出來 ,人們才對內生細菌的研究逐漸地重視起來（冉國華 , 張志元 , 2004）。 研究發(fā)現(xiàn)有些植物內生細菌使植物獲益，如固氮（ 1998），促進植物生長（ 1997）或誘導植物抗病性（ 1996）等。 目前對柑橘內生細菌也已開展了很多的研究。羅永蘭等從 3 種柑橘的不同器官中分離到 75 份內生細菌，分別為氣芽孢桿菌屬（ 、氣單胞菌屬（ 、芽孢桿菌屬（ 、黃單胞桿菌屬（ 、假單胞桿菌屬（ 、土壤桿菌屬（ 、乳桿菌屬（ 。且出現(xiàn)的頻次不同（ 羅永蘭 , 張志元 , 喻珺 , 2006）。 分離柑橘內生細菌，其中一株 2004）。袁紅旭等篩選出 4 株對柑橘炭疽病具有拮抗作用的內生細菌，其中1 株菌能夠促進幼苗生長（ 袁紅旭 , 陳勇明 , 何財能 , 羅冬萍 , 許丹陽 , 2005） 。張翼等從柑橘枝條中分離到 26 株對油菜菌核病菌（ 有拮抗作用的內生細菌，其中 株的拮抗活性最強。經鑒定 株為枯草芽孢桿菌（ 張翼 , 白晨 , 冉國華 , 張志元 , 陳耀輝 , 吳剛 , 2009）。內生細菌對于寄主的重要性 已被認識到 , 保護植物防治害蟲，包括昆蟲、線蟲、植物病原菌、細菌等；還可在寄主內引起生理上的修飾，比如使它們更耐氫氣壓力；一些內生細菌還能產生多種生物技術價值如抗生素和抗癌抗生素（ 2000）。研究柑橘內生細菌及其與寄主的相互關系為柑橘生產、生物防治等的應用奠定基礎。 3 研究方法與技術 福建農林大學碩士學位論文 16 交試驗優(yōu)化木虱內生細菌培養(yǎng)基 正交試驗設計方法于 20世紀 60年代初由日本傳到我國。 8 0年代初，田口玄一 3次優(yōu)化設計該法后在中國得到廣 泛的運用。 正交試驗設計法是一種用正交表安排多因素多水平試驗的方法， 統(tǒng)計學家通過一系列的表格實現(xiàn)正交設計，這些表叫正交表。具有完成試驗要求 所需的實驗次數(shù)少、數(shù)據點的分布很均勻、可用相應的極差分析方法、方差分析方法、回歸分析方法等對試驗結果進行分析，得出有價值的結論的特點?？茖W合理地進行正交試驗設計，既可獲得質量高、可靠性高的試驗數(shù)據和試驗產品，在試驗數(shù)據分析中，還更有利于我們掌握試驗對象相互間內在的聯(lián)系、最佳摻量以及最佳工藝。正交試驗試驗次數(shù)少，能夠獲得滿意的結果，多快好省、事半功倍，既節(jié)省了人力、 物力、財 力，又可獲得比較良好的技術經濟效益。正交最優(yōu)化設計是處理多因素、多水平問題的好方法，對于該類問題，它無疑是最佳選擇。 6 S 因序列分析的應用 16S 原核生物的一種核糖體 細菌分類學研究最有用、最常用的分子鐘，且種類少，含量大，在所有生物中都存在，進化