【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）光合細(xì)菌PCR檢測(cè)技術(shù)的建立及其應(yīng)用研究微 生 物 學(xué)碩士論文

密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩士 學(xué)位論文 光合細(xì)菌 測(cè) 技術(shù)的建立及其應(yīng)用 研究 CR he of by 要 本論文以光合細(xì)菌中的沼澤紅假單胞菌和類球紅細(xì)菌為研究對(duì)象，根據(jù)其 16S 列和 列 設(shè)計(jì) 和篩選出適用 于 這兩種菌（種水平）鑒定的 異引物 ， 優(yōu)化了 應(yīng)體系和程序，建立的分子生物學(xué)方法 解決 了 微生物肥料光合細(xì)菌產(chǎn)品檢測(cè)過(guò) 程中 出現(xiàn)的 操作繁瑣、檢測(cè)周期長(zhǎng)等問(wèn)題 。 進(jìn)一步應(yīng)用熒光定量 術(shù)進(jìn)行光合細(xì)菌含量測(cè)定研究，初步建立了定量 檢測(cè)的方 法，對(duì)該技術(shù)在光合細(xì)菌菌數(shù)測(cè)定中應(yīng)用做了探索性的研究。 通過(guò)分析 光合細(xì)菌 相關(guān) 基因序列的可變區(qū)，設(shè)計(jì) 了 3 對(duì) 沼澤紅假單胞菌和 2 對(duì) 類球紅細(xì)菌特異引物 ， 根據(jù)其對(duì)各自模式菌株的 增結(jié)果， 篩選出了 這兩種菌的 異引物 。通過(guò) 對(duì) 應(yīng)體系中鎂離子濃度、退火溫度進(jìn)行優(yōu)化， 建立 了 沼澤紅假單胞菌 和 類球紅細(xì)菌 定 方法。 使用 法 對(duì) 7 個(gè)屬 18 個(gè)種共 24 株 微生物肥料中 常見(jiàn)光合細(xì)菌 、與光合細(xì)菌常復(fù)合使 用的菌種和雜菌 進(jìn)行檢測(cè) ， 結(jié)果 目的菌株均有 清晰 目的條帶出現(xiàn)， 非目的菌株 均 無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物 。 對(duì) 增產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序 驗(yàn)證其同源性 ，其序列與靶基因序列的同源性達(dá) 100%。 使用 法 檢測(cè)了 來(lái)自不同企業(yè)的 6 個(gè)光合細(xì)菌 菌劑 產(chǎn)品 ， 結(jié)果顯示 法檢測(cè)符合率為 100 ， 高于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法 。 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 ，所建立的光合細(xì)菌的沼澤紅假單胞菌和類球紅細(xì)菌特異 測(cè) 方法準(zhǔn)確、 可靠、 靈敏性 強(qiáng)， 與傳統(tǒng)方法相比 檢測(cè)步驟 簡(jiǎn)單 ，縮短了檢測(cè)時(shí)間。 通過(guò)比對(duì)紫色非硫菌科的光合細(xì)菌、微生物肥料常用菌種的 16S 列，設(shè)計(jì) 了 紫色非 硫菌科光合細(xì)菌 的 通用引物， 驗(yàn)結(jié)果表明該對(duì)引物在微生物肥料常用的菌種范圍 內(nèi)，對(duì)光合細(xì)菌具有較高的特異性。 使 用 所設(shè)計(jì)的 通用引物 ，采用熒光定量 技術(shù) ， 建立了熒光定量 測(cè) 光合細(xì)菌的方法。 使用該方法 對(duì) 系列稀釋 的 已知菌數(shù)樣品 的板 進(jìn)行熒光定量 增 ， 建立了熒光定量檢測(cè) 標(biāo)準(zhǔn)曲線 ， 標(biāo)準(zhǔn)曲線 回歸方程為： y 關(guān)系數(shù)為 檢測(cè)范圍在 04 07使 用熒光定量 法對(duì) 10 個(gè)光合 細(xì)菌 樣品的菌數(shù) 進(jìn)行了測(cè)定 ，所測(cè)菌數(shù)高于傳統(tǒng)測(cè)定方法最大或然數(shù)法 （ ） 所測(cè)數(shù)量， 但 兩 者的相關(guān)性為 P ， 表明 熒光定量 法能夠反映 出不同 光合細(xì)菌 產(chǎn)品 數(shù)量的 差異 。 通過(guò)測(cè)定建立校正 參數(shù) 后，該 方法 將 可用于光合細(xì)菌產(chǎn)品 菌含量的快速 準(zhǔn)確 測(cè)定 。 關(guān)鍵詞 ： 微生物肥料 檢測(cè)；光合細(xì)菌； 特異 時(shí)熒光定量 an to in CR by 6 CR to of to SB to in of of by of on to CR 4 8 0 4 in to be in to CR of of 00% by of CR 00%CR CR in of SB by 6SB in it SB by to SB CR NA CR of y of 07 04. SB by CR SB by of r= 定量描述微生物群落的組成 ， 在微生物生態(tài)學(xué)的許 多研究領(lǐng)域都是非常重要的。然而由于可培養(yǎng)技術(shù)的局限性 ， 定量描述微生物群落成為比較困難的事情。 術(shù)在內(nèi)的分子生物學(xué)技術(shù)為人們提供了有力的工具 ， 使對(duì)微生物群落的分布、豐度等有了進(jìn)一步的了解。 實(shí)時(shí)熒光定量 術(shù)作為一種核酸定量的手段 ， 以其高靈敏性、高特異性、高精確度、實(shí)時(shí)性、污染少等優(yōu)點(diǎn) ， 在微生物生態(tài)學(xué)中逐漸得到廣泛的應(yīng)用。 熒光定量 僅可以定性 ，也可以定量研究微生物群落結(jié)構(gòu)組成及數(shù)量變化 ， 深入探索微生物群落與環(huán)境因子之間的相互作用及其動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。 2001） 等利用特異性 16S 物擴(kuò)增兩種甲苯降解菌 ，觀測(cè)河流中這兩種甲苯降解菌的群落動(dòng)態(tài) ， 熒光定量 果顯示 ： X X. my 甲苯污染地區(qū)的豐度比非污染地區(qū)的高。 2003）中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 12 等在研究重金屬污染梯度高流變區(qū)微生物群落時(shí) ， 利用熒光定量 術(shù)量化 16S 因拷貝數(shù)和 -， -， 個(gè)系統(tǒng)進(jìn)化類群 ，發(fā)現(xiàn)了與 重金屬離子梯度 正相關(guān)的 類群 從而 為預(yù)測(cè)河流重金屬污染的長(zhǎng)期效應(yīng)提供了進(jìn)一步研究的基礎(chǔ) 。 面 的檢測(cè) 用之前 ， 定量是用傳統(tǒng)的 跡的方法，其定量的下限是 106種方法要求的 量較大，因而其在基因表達(dá)研究應(yīng)用上受到很大的限制。實(shí)時(shí)熒光定量 發(fā)明，解決了這個(gè)難題，其靈敏度可檢測(cè)到 400 個(gè)分子的 以其精確、快速、污染小，已廣泛應(yīng)用于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域。實(shí)時(shí)熒光定量 法已廣泛應(yīng)用于 不 同生物體間、同一生熒光物體小同部位間等基因轉(zhuǎn)錄水平研究。 基因檢測(cè) 的應(yīng)用 在轉(zhuǎn)基因植物中，需要考查陽(yáng)性植株中外源基 因 的拷貝數(shù)， 因 為拷貝數(shù)通常會(huì)影響基因的表達(dá)和后代性狀的表現(xiàn)。目前常用的檢測(cè)技術(shù)是 交，但此技術(shù)需要大量的材料，操作繁瑣，相當(dāng)耗時(shí)。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量熒光 可以對(duì)基因的拷貝數(shù)作測(cè)算，即用一個(gè)己知拷貝數(shù)的內(nèi)源基因作為參照，同時(shí)對(duì)樣品做內(nèi)源基因和外源基因的實(shí)時(shí)熒光定量 過(guò)兩者達(dá)到熒光域值時(shí)的 便可得到外源基 因 的拷貝數(shù) ； 實(shí)時(shí)熒光定量 轉(zhuǎn)基 因 動(dòng)物的純合性鑒定上也有出色的表現(xiàn)；另外，利用定量 可以對(duì)轉(zhuǎn)基 因 后 外源基 因 表達(dá)情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)。 覃文（ 2003） 等用實(shí)時(shí)熒光 術(shù)定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米 分；曹際娟 （ 2003）等運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光 術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米 系進(jìn)行鑒定；潘良文 （ 2003） 等運(yùn)用該方法對(duì)轉(zhuǎn)基因抗草甘磷油菜內(nèi)源特異參照基因 外源 3 終止子進(jìn)行檢測(cè)。 本論文研究目的和意義 及研究?jī)?nèi)容 在微生物肥料行業(yè)中 ，光合細(xì)菌憑借其良好的使用效果，被越來(lái)越多的企業(yè)選為生產(chǎn)菌種。然而目前使用的 傳統(tǒng) 光合細(xì)菌檢測(cè)方法存在 著 一定的 缺點(diǎn)， 影響了光合細(xì)菌 菌劑 的質(zhì)量檢測(cè) 工作。 傳統(tǒng)的光合細(xì)菌鑒 定基于 形態(tài)特征 和 生理 生化方法 ， 但 光合細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，分離純化工作要花費(fèi)較長(zhǎng)時(shí)間， 僅 生理生化鑒定 就 需要 4 8 天的時(shí)間 ， 因此傳統(tǒng)方 法主要缺點(diǎn)是檢測(cè)周期長(zhǎng)，特異性不強(qiáng) 。 光合細(xì)菌菌量測(cè)定 的 標(biāo)準(zhǔn)方法是 ，而 要使 測(cè)定 結(jié)果真正達(dá)到最大幾率，實(shí)驗(yàn)必須滿足以下兩個(gè)條件：一是細(xì)菌不能互相凝集，不相互排斥，而是隨機(jī)分散在液體中；二是即使只接種一個(gè)細(xì)胞，也要能看見(jiàn)它的生長(zhǎng)。然而在實(shí)際的操作過(guò)程中很難達(dá)到這兩個(gè)要求，特別 是 后一個(gè)條件 對(duì)光 合 細(xì)菌 來(lái)說(shuō)很難 達(dá)到 ， 所以 本身無(wú)法克服的一個(gè)缺點(diǎn)就是 計(jì)數(shù)效率 一般都比較低。 另一個(gè)缺點(diǎn)是檢測(cè)周期長(zhǎng)，光合細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，特別是在高稀釋倍數(shù)的情況下，接種的試管變紅需要很長(zhǎng)時(shí)間，最長(zhǎng)可達(dá) 14天的培養(yǎng)周期。另外，培養(yǎng)基的選用、培養(yǎng)的溫度和光照以及樣品本身的雜菌都會(huì)對(duì)計(jì)數(shù)產(chǎn)生影響。 因此，迫切需要快速、準(zhǔn)確、靈敏的先進(jìn)光合細(xì)菌檢測(cè)技術(shù) 和 方法 ， 以 滿足 光合細(xì)菌的 質(zhì)量 檢測(cè) ， 提高 質(zhì)檢的準(zhǔn)確性和時(shí)效性 。 由于 法有著快速、準(zhǔn)確和靈敏的特點(diǎn)，已經(jīng)在醫(yī)學(xué)和衛(wèi)生檢測(cè)方面得到了廣泛的中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 13 應(yīng)用，對(duì)各種病毒和病源體如乙肝病毒、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等病源菌建立了 測(cè)方法，特別是近期美國(guó) 準(zhǔn)了禽流 感診斷方法 轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)）于用于人類患者檢測(cè)。這都表明了隨著技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)將在微生物檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。 本研究 擬從 分子生物學(xué) 角度 ，主要 利用 法， 以微生物肥料生產(chǎn)中常用的光合細(xì)菌沼澤紅假單胞和類球紅細(xì)菌為例， 建立 快速、準(zhǔn)確、靈敏的光合細(xì)菌 的鑒定和定量的 分子生物學(xué)方法 ，以 解決 目前光合細(xì)菌檢測(cè)中 存在的問(wèn)題。 本研究從分子生物學(xué)角度，主要利用 法， 以微生物肥料生產(chǎn)中常用的光合細(xì)菌沼澤紅假單胞 菌 和類球紅細(xì)菌為 研究對(duì)象 ， 建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的光合細(xì)菌的鑒定和定量的分 子生物學(xué)方法 ，以解決目前光合細(xì)菌檢測(cè)中存在的 技術(shù)困難與 問(wèn)題。 具體的研究目標(biāo)是，建立 的新技術(shù) 方法使 光合細(xì)菌 的質(zhì)量 檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)便快速 、 客觀準(zhǔn)確 和標(biāo)準(zhǔn)化 ；提高 產(chǎn)品 中 光合細(xì)菌菌株的純化鑒定 的 準(zhǔn)確 性和時(shí)效性 。同時(shí)，本論文還對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量 定光合細(xì)菌菌數(shù)進(jìn)行探索性研究 ， 為該技術(shù)在微生物肥料檢測(cè)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 為此本論文主要對(duì)以下幾方面內(nèi)容進(jìn)行研究： （ 1） 設(shè)計(jì) 沼澤紅假單胞菌 和類球紅細(xì)菌種 特異引物， 優(yōu)化 應(yīng)條件， 建立 起 （ 2） 驗(yàn)證 沼澤紅假單胞菌 和類球紅細(xì)菌 定方法 的特異性和 擴(kuò)增產(chǎn)物的 準(zhǔn) 確性 ； （ 3） 定方法在產(chǎn)品檢測(cè)中的應(yīng)用； （ 4） 設(shè)計(jì) 光合細(xì)菌紫色非硫細(xì)菌的通用引物 ， 并驗(yàn)證該引物的通用性和特異性。并以該引物作為光合細(xì)菌特異引物， 建立熒光定量 定光合細(xì)菌菌數(shù)的方法 及其在產(chǎn)品測(cè)定中的應(yīng)用 。 術(shù)路線 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 實(shí)驗(yàn)材料和基本實(shí)驗(yàn)方法 14 第二章 實(shí)驗(yàn)材料 和 基本 實(shí)驗(yàn)方法 驗(yàn)材料 株 表 2試菌株 in 種類型 菌種名稱 菌株編號(hào) a 光合細(xì)菌 沼澤紅假單胞菌 球紅細(xì)菌 酸紅假單胞菌 膜紅細(xì)菌 R 比菌株 施氏假單胞 腸桿菌 草芽 孢 桿菌 淀粉芽孢桿菌 B. 衣芽孢桿菌 B. 短小芽孢桿菌 B. 大芽孢桿菌 ， 蘇云金芽孢桿菌 B. 046 膠 胨樣 芽 孢 桿菌 B. 519 T 側(cè)孢 短 芽 孢 桿菌 氮類芽孢桿菌 多粘類芽孢桿菌 P 短短芽孢桿菌 大豆根瘤菌 10 中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心 ； 中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心 ； 中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心 ； 湖南植保所 ； 其他為微生物肥料和食用菌菌種質(zhì)檢中心收集保藏 。 T 為模式菌株 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 實(shí)驗(yàn)材料和基本實(shí)驗(yàn)方法 15 要 實(shí)驗(yàn)儀器 ： ： 200； 熒光定量 ： 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司 外可見(jiàn)分光光度計(jì) ：北京普析通用有限責(zé)任公司 壓滅菌鍋 ：三洋 3020 水浴鍋 ： 北京德天佑科技發(fā)展有限公司 8A 凝膠成像系統(tǒng) ： Q 離心機(jī) ： 上海安亭科學(xué)儀器廠 16B 高速冷凍離心機(jī) ： 純水器 ： 上海同泰科技發(fā)展有限公司 10A 超凈工作臺(tái) ： 上海成順儀器儀表有限公司 900 養(yǎng)基 合細(xì)菌 培養(yǎng)用培養(yǎng)基 1.0 g， 0.5 g， 1.0 g， 0.1 g， 1.0 g， 醋酸鈉 1.0 g， 琥珀酸鈉 1.0 g， 酵母 膏 0.5 g， 3.0 g， 蛋白胨 0.5 g， 微量元素液 1.0 維生素液 1.0 蒸餾水 1 000 量元素液成份： 1.8 g， g， g， g， 0.7 g， 0.1 g， 0.5 g， 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 實(shí)驗(yàn)材料和基本實(shí)驗(yàn)方法 16 g， g， 蒸餾水 1 000 生素液成份： 生物素 0.1 g， 煙酸 g， 煙酸硫銨素 0.3 g， 對(duì)氨基苯甲酸 0.2 g， 泛酸鈣 0.1 g， 維生素 g， 鹽酸吡哆銨 0.1 g， 蒸餾水 1 000 培養(yǎng)基： 酵母膏 2.0 g 乙酸鈉 3.0 g 1.0 g 1.0 g 0.2 g 0.5 g 5.0 g 抗氧化劑 g 蒸餾水 1 000 mL 理生化培 養(yǎng)基 （ 1） 碳源利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基： ( 2.0 g 0.2 g 2O 0.5 g 1.0 g 0.5 g 蒸餾水 1 000 物終濃度糖醇類為 1，其他為 ，底物過(guò)濾滅菌。 （ 2） 檸檬酸鹽利用培養(yǎng)基 ： 5 g 0.2 g 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 實(shí)驗(yàn)材料和基本實(shí)驗(yàn)方法 17 (2 1.0 g 1.0 g 檸檬酸鈉 2.0 g 溴百里酚藍(lán) 1%水溶液 10 脂 20 g 蒸餾水 1 000 mL 3） 酒石酸鹽利用 培養(yǎng)基： 蛋白胨 10 g 5 g 溴百里酚藍(lán) （ 12.5 石酸鉀 10 g 蒸餾水 1 000 mL 試劑 沖液 (1) 沖液 10 1 (2) 沖液 1010Cl( 1 (3) 1L) 至 (4) 上樣緩沖液 (6) 酚蘭， 20%蔗糖 (5) 電泳緩沖液 (5， 1 L) 酸 20 (6) 存液 (100 00應(yīng) 所需試劑 5U/L） 、 100不含 ）、 25 自 取試劑 （ 1） 沖液： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 實(shí)驗(yàn)材料和基本實(shí)驗(yàn)方法 18 分別 稱取 硫氰酸胍（ 和 式環(huán)已二胺四乙酸（ 2- N， N， N， 稱 溶解于 20度為 40 沖液中 ， 待試劑完全溶解后，用相同濃度的 液定容至 50成濃度 4 的 沖液 。 （ 2） 洗滌緩沖液： 按下列組成成分配制 500滌緩沖液：無(wú)水乙醇 60， 20， 00，用超純水定容至 500藏于玻璃瓶中。 （ 3） 硅藻土吸附緩沖液：稱取 5g 硅藻土（ 司出品，商品名為 用 1 次，最后按 1： 1（ w/v ）加入 1沖液，配成硅藻土吸附液。 （ 4） 8g 2O 1 000mL 5) 2% 2 mL 100 隆測(cè)序試劑 自天根生物公司； 50mg/經(jīng)科生物公司； 載體 購(gòu)自 寶生物工程（大連）有限公司 感受態(tài)細(xì)胞 大腸桿菌 自鼎國(guó)生物公司； 引物 ： 5 3）： （ 5 3）： 引物 由上海生工合成 劑 劑盒購(gòu)自寶生物工程 (大 連 )有限公司 ； 聯(lián)管 購(gòu)自 司 。 本 實(shí)驗(yàn)方法 ： 合細(xì)菌的培養(yǎng) 用培養(yǎng)基 光合細(xì)菌進(jìn)行活化，光合細(xì)菌的富集使用培養(yǎng)基 養(yǎng)條件中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 實(shí)驗(yàn)材料和基本實(shí)驗(yàn)方法 19 為：溫度 30 34 ，光照為 1000 2000 合細(xì)菌 總 取 A. 菌體收集： 取 液于 中， 9000r/心 4集菌體， 20保存。 B. 將收集到的菌體用 1沖液洗滌菌體 2 次。 C. 加入 500L 沖液，混合均勻 ， 靜置 20 D. 將硅藻土吸附緩沖液充分搖勻，每管加入 20L30L 該吸附液， 振蕩均勻后室溫放置 15 E. 13000r/心 30s，棄上清，再加入 20沖液，混合均勻后室溫放置 10上法離心處理。 F. 洗滌緩沖液洗滌上述硅藻土沉淀 3 次，每次 300L。 G. 用 200L 70的酒精洗滌硅藻土沉淀 1 次， 13000r/心 2去酒精溶液，真空抽干。 H. 最后根據(jù)每管加入硅藻土的量，向每管加入 20L 30L 1沖液，在渦旋振蕩器上充分混合均勻， 65 保溫 30 I. 13000r/心 5心將上清液移至另一支已編號(hào)的 ，該溶液即為從菌株中提取的 品。 品貯藏于 。 合細(xì)菌基因組 電泳檢測(cè) 1%凝膠 ， 色 30140V 穩(wěn)壓電泳 50通過(guò) 凝膠圖像分析儀下分析結(jié)果。 合細(xì)菌基因組 濃度和純度測(cè)定 提取的光合細(xì)菌 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度。 量測(cè)定方法：將提取的 板進(jìn)行適度稀釋，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定 260D 值 。 量 =釋倍數(shù) 50 g000 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第三章 光合細(xì)菌 定技術(shù)的 建立及其應(yīng)用研究 20 第三章 光合細(xì)菌 定技術(shù)的 建立及其應(yīng)用研究 本章利 用細(xì)菌遺傳物質(zhì)中高度保守的核酸序列 （ 16 ，對(duì)微生物肥料中常用 的 光合細(xì)菌 沼澤紅假單胞菌（ 類球紅細(xì)菌（ 進(jìn)行 特異引物設(shè)計(jì)， 使用 已知 模式 菌株進(jìn)行 證 ，以 篩選特異性引物 ；并優(yōu)化鎂離子濃度和 確定 退火溫度 等環(huán)節(jié)， 建立這兩種光合細(xì)菌的 定 方法 ，同時(shí) 對(duì) 其 擴(kuò)增產(chǎn)物克隆測(cè)序 ，檢驗(yàn)其 是否為目的產(chǎn)物 。 通過(guò) 對(duì)不同屬種光合細(xì)菌、光合細(xì)菌復(fù)合使用的菌株和雜菌進(jìn)行 增，驗(yàn)證 建立的 定方法的特異性。 并 使用 定 方法 檢測(cè)光合細(xì)菌產(chǎn)品， 考察 該 技術(shù)在產(chǎn)品檢測(cè)中應(yīng)用的 可行性 。 驗(yàn)方法 物設(shè)計(jì) 與 初篩 首先 在 據(jù)庫(kù)中檢索并下載 紅假單胞菌屬和紅細(xì)菌屬 各個(gè)菌種 的基因 序列 ， 在此基礎(chǔ)上篩選出可以進(jìn)行種間比對(duì)和引物設(shè)計(jì)的靶基因 16 因序列，通過(guò)件對(duì)各個(gè)種的基因進(jìn)行差異水平分析 ， 選 擇 有差異的片段設(shè)計(jì)種特異引物。 設(shè)計(jì)引物時(shí) 遵循 以下原則：（ 1）引物長(zhǎng)度為 18 24 個(gè)堿基；（ 2） 在 55 65 ，引物 間的 ， 量在 40% 60%；（ 3）避免引物自身形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)； （ 4）優(yōu)先考慮變異發(fā)生在 3端、變異堿基 3 個(gè) 以 上 的 引 物 。 將 設(shè)計(jì)好的 引 物 在 互 聯(lián) 網(wǎng) 上（ ）進(jìn)行比對(duì)，每條引物在本種內(nèi)的同源性應(yīng)為 100，與其他種群的菌株同源性則應(yīng)很低。 使用 設(shè)計(jì)好的特異引物， 采用表 3的反應(yīng)條件，對(duì) 各自模式菌株基因組 行 根據(jù) 果篩選特異引物。 表 3應(yīng)條件 CR 增反應(yīng)體系 (20l)： 環(huán)條件 10 2 L 10） L 引物 R（ 10） L 引物 F（ 10） L （ l） L 模板 1L 補(bǔ)足 20 L 初始變性 95 5 性 95 40s 退火 理論退火溫度 40 s 30 個(gè)循環(huán) 延伸 72 30 s 最后延伸 72 10 應(yīng)條件 的 建立 使用篩選出的兩個(gè)特異引物， 分別 以各自 模式菌株沼澤紅假單胞菌 因組 模板 （ 模板 取方法見(jiàn) ， 在不同退火溫度和鎂離子濃度的中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第三章 光合細(xì)菌 定技術(shù)的 建立及其應(yīng)用研究 21 條件下進(jìn)行 增，根據(jù) 應(yīng)結(jié)果確定 應(yīng)體系和反應(yīng)條件。 火溫度確定：設(shè)計(jì)梯 度 應(yīng)程序，退火溫度依次為 55 、 、 、 、65 ， 根據(jù)結(jié)果選擇能夠出現(xiàn)目的條帶的最高 退火溫度 為方法的退火溫度 。 離子濃度確定：反應(yīng)體系中鎂離子體積分別為 根據(jù)結(jié)果選擇能夠出現(xiàn)目的條帶的最低鎂離子體積為方法的鎂離子濃度。 已 確定的退火溫度和鎂離子濃度的條件下 ，對(duì) 種內(nèi)各個(gè) 菌 株進(jìn)行 增，檢查在此反應(yīng)條件下種特異引 物在種內(nèi)的通用性。如果 有菌株 應(yīng)為陰性 ，對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行 調(diào)整 ， 直到各個(gè)菌株都出現(xiàn)目的條帶為止 ，以此反應(yīng)條件作為種特異 反應(yīng)條件。 定方法 特異性 驗(yàn)證 以表 2供試菌株基因組 模板 （ 模板 取方法見(jiàn) 分別使用沼澤紅假單胞 菌 和類球紅細(xì)菌的特異引物 ，在已建立的 應(yīng)條件下 進(jìn)行 擴(kuò)增， 檢 驗(yàn) 引物 的種特異性 。 物序列測(cè)定 物的回收 （ 1）檢測(cè)合格后將所有的產(chǎn)物于大點(diǎn)樣孔點(diǎn)樣、電泳。 （ 2） 電泳后在長(zhǎng)波紫外光下，迅速用干 凈的手術(shù)刀割下含所要回收的瓊脂塊，放入 （ 3）加入 100加 400L），混勻后置于 50水浴中 10 2 勻一次），使膠徹底融化。 （ 4）將融化的膠全部轉(zhuǎn)移到 中，柱子放入 溫放置28000r/心 1 （ 5） 取下 ，棄去離心管中的廢液，將柱子放回同一離心管中，加入 50010000r/心 30s。 （ 6）重復(fù)步驟（ 5）一次。 （ 7） 取下 ，棄去離心管中的全部廢液，將柱子放回同一離心管中， 10000r/0s，以除去殘余的 （ 8）將柱子放入干凈的 心管中，在柱子中央加入 20100L 溫放置 2高洗脫液的溫度至 55有利于提高 洗脫效率。 （ 9） 10000r/心 1 集離心管中的液體即為回收的 段。 增回收產(chǎn)物與 T 載體的連接 按照上海生工的 T 載體 物克隆試劑盒說(shuō)明來(lái)操作：在 增反應(yīng)管中，依次加入下列各成分， 16 連接過(guò)夜。 國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第三章 光合細(xì)菌 定技術(shù)的 建立及其應(yīng)用研究 22 純化后的 物 L L L 組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和藍(lán)白斑篩選 （ 1）將感受態(tài)細(xì)胞從超低溫冰箱中拿出，置于冰上解凍，取 50L 加入 心管中，將連接液全 量（ 入該離心管中，輕輕混勻，冰浴 30 （ 2） 熱擊 90s，立即置于冰上 2 （ 3）加入 450 l 體培養(yǎng)基，于 37 ， 200蕩培養(yǎng) 60 （ 4）在一制備好的含氨芐青霉素 100g/L 的 板上加 40l 存液（ 20mg/ 16L 50mg/涂布均勻， 37 放置 60 （ 5）?。?3）中的 100l 涂布于（ 4）中平板， 37 培養(yǎng) 12成單菌落，再將平板4 放置數(shù)小時(shí)，使藍(lán)色充分顯現(xiàn)。 重組克隆在 板上呈現(xiàn)白色，而非重組克隆呈藍(lán)色。 性克隆的檢測(cè) （ 1）挑選白色菌落若干，用無(wú)菌牙簽點(diǎn)種于新鮮 脂平板上（ 2 點(diǎn) /菌落）， 37 培養(yǎng) 12 2）用無(wú)菌牙簽取菌落于 20l 超純水中，沸水煮 15 3） 12000心 3-5 清作為 應(yīng)模板。 （ 4）在 中加入下列各成分 增反應(yīng)體系如下 (20l) : 10 2 L 10） L 引物 10） 1 L 引物 10） 1 L （ l） L 模板 2L 補(bǔ)足 20 L 環(huán)條件 初始變性 94 4 性 96 30 s 退火 50 15 s 26 個(gè)循環(huán) 延伸 60 4 最后延伸 72 10 5） 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第三章 光合細(xì)菌 定技術(shù)的 建立及其應(yīng)用研究 23 列測(cè)定及 比對(duì) 將轉(zhuǎn)化成功的備份菌落接種至 體培養(yǎng)基中， 37 培養(yǎng) 12培養(yǎng)液交由上海生物工程有限公司測(cè)序 。測(cè)序結(jié)果 用在互聯(lián)網(wǎng)上（ ）進(jìn)行比對(duì)。 敏度檢測(cè)： 取起始濃度 為 1g/L 的基因組 滅好菌的 其逐步 按 1： 10； 1： 100； 1：1000； 1： 10000； 1： 100000； 1： 1000000 稀釋， 分別取 1應(yīng)，來(lái)確定 應(yīng)的靈敏度。 法在光合細(xì)菌產(chǎn)品檢測(cè)中的應(yīng)用 選取 6 個(gè)光合細(xì)菌 菌劑產(chǎn)品 ，分別使用傳統(tǒng) 鑒定 方法和 法進(jìn)行檢測(cè)， 比較兩種方法的結(jié)果， 考察 該 技術(shù)在產(chǎn)品檢測(cè)中應(yīng)用的 可行性 。 統(tǒng) 鑒定 方法 1. 光合細(xì)菌的分離 純化 將樣品在 R 培養(yǎng)基瓊脂（ 板上劃線，在厭氧條件下， 28 30 光照培養(yǎng) 47 天。挑出典型菌落，重新劃線培養(yǎng)，直到 菌落一致 為止。 2. 光合細(xì)菌生理生化的鑒定 對(duì)已純化好的光合細(xì)菌做 以 下幾 項(xiàng) 生理生化實(shí)驗(yàn) ： 檸檬酸鹽、硫代硫酸鈉、乙醇、甘露醇和酒石酸鹽利用實(shí)驗(yàn) （參照東秀珠常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)） 。 法 1. 樣品 取 按 法提取 。 2. 法的應(yīng)用 采用 的 反應(yīng)條件和反應(yīng)體系 進(jìn)行。 3. 產(chǎn)物測(cè)序 物直接測(cè)序，測(cè)序由上海生工完成。 果 與分析 物設(shè)計(jì) 與篩選 設(shè)計(jì)的引物及其序列見(jiàn)表 3用這 5 對(duì)引物分別對(duì)各自的模式菌株進(jìn)行 增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò) 1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選出能夠特異擴(kuò)增的合適引物。 使 用表 3的 5 對(duì)引物分別對(duì)各自的模式菌株沼澤紅假單胞菌 類球紅假單胞菌 行 增，實(shí)驗(yàn)結(jié)果 見(jiàn) 圖 3圖 3見(jiàn)，