




已閱讀5頁,還剩60頁未讀, 繼續(xù)免費(fèi)閱讀
版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡介
密級: 論文編號: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩士 學(xué)位論文 光合細(xì)菌 測 技術(shù)的建立及其應(yīng)用 研究 CR he of by 要 本論文以光合細(xì)菌中的沼澤紅假單胞菌和類球紅細(xì)菌為研究對象,根據(jù)其 16S 列和 列 設(shè)計(jì) 和篩選出適用 于 這兩種菌(種水平)鑒定的 異引物 , 優(yōu)化了 應(yīng)體系和程序,建立的分子生物學(xué)方法 解決 了 微生物肥料光合細(xì)菌產(chǎn)品檢測過 程中 出現(xiàn)的 操作繁瑣、檢測周期長等問題 。 進(jìn)一步應(yīng)用熒光定量 術(shù)進(jìn)行光合細(xì)菌含量測定研究,初步建立了定量 檢測的方 法,對該技術(shù)在光合細(xì)菌菌數(shù)測定中應(yīng)用做了探索性的研究。 通過分析 光合細(xì)菌 相關(guān) 基因序列的可變區(qū),設(shè)計(jì) 了 3 對 沼澤紅假單胞菌和 2 對 類球紅細(xì)菌特異引物 , 根據(jù)其對各自模式菌株的 增結(jié)果, 篩選出了 這兩種菌的 異引物 。通過 對 應(yīng)體系中鎂離子濃度、退火溫度進(jìn)行優(yōu)化, 建立 了 沼澤紅假單胞菌 和 類球紅細(xì)菌 定 方法。 使用 法 對 7 個屬 18 個種共 24 株 微生物肥料中 常見光合細(xì)菌 、與光合細(xì)菌常復(fù)合使 用的菌種和雜菌 進(jìn)行檢測 , 結(jié)果 目的菌株均有 清晰 目的條帶出現(xiàn), 非目的菌株 均 無擴(kuò)增產(chǎn)物 。 對 增產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序 驗(yàn)證其同源性 ,其序列與靶基因序列的同源性達(dá) 100%。 使用 法 檢測了 來自不同企業(yè)的 6 個光合細(xì)菌 菌劑 產(chǎn)品 , 結(jié)果顯示 法檢測符合率為 100 , 高于傳統(tǒng)的檢測方法 。 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 ,所建立的光合細(xì)菌的沼澤紅假單胞菌和類球紅細(xì)菌特異 測 方法準(zhǔn)確、 可靠、 靈敏性 強(qiáng), 與傳統(tǒng)方法相比 檢測步驟 簡單 ,縮短了檢測時間。 通過比對紫色非硫菌科的光合細(xì)菌、微生物肥料常用菌種的 16S 列,設(shè)計(jì) 了 紫色非 硫菌科光合細(xì)菌 的 通用引物, 驗(yàn)結(jié)果表明該對引物在微生物肥料常用的菌種范圍 內(nèi),對光合細(xì)菌具有較高的特異性。 使 用 所設(shè)計(jì)的 通用引物 ,采用熒光定量 技術(shù) , 建立了熒光定量 測 光合細(xì)菌的方法。 使用該方法 對 系列稀釋 的 已知菌數(shù)樣品 的板 進(jìn)行熒光定量 增 , 建立了熒光定量檢測 標(biāo)準(zhǔn)曲線 , 標(biāo)準(zhǔn)曲線 回歸方程為: y 關(guān)系數(shù)為 檢測范圍在 04 07使 用熒光定量 法對 10 個光合 細(xì)菌 樣品的菌數(shù) 進(jìn)行了測定 ,所測菌數(shù)高于傳統(tǒng)測定方法最大或然數(shù)法 ( ) 所測數(shù)量, 但 兩 者的相關(guān)性為 P , 表明 熒光定量 法能夠反映 出不同 光合細(xì)菌 產(chǎn)品 數(shù)量的 差異 。 通過測定建立校正 參數(shù) 后,該 方法 將 可用于光合細(xì)菌產(chǎn)品 菌含量的快速 準(zhǔn)確 測定 。 關(guān)鍵詞 : 微生物肥料 檢測;光合細(xì)菌; 特異 時熒光定量 an to in CR by 6 CR to of to SB to in of of by of on to CR 4 8 0 4 in to be in to CR of of 00% by of CR 00%CR CR in of SB by 6SB in it SB by to SB CR NA CR of y of 07 04. SB by CR SB by of r= 定量描述微生物群落的組成 , 在微生物生態(tài)學(xué)的許 多研究領(lǐng)域都是非常重要的。然而由于可培養(yǎng)技術(shù)的局限性 , 定量描述微生物群落成為比較困難的事情。 術(shù)在內(nèi)的分子生物學(xué)技術(shù)為人們提供了有力的工具 , 使對微生物群落的分布、豐度等有了進(jìn)一步的了解。 實(shí)時熒光定量 術(shù)作為一種核酸定量的手段 , 以其高靈敏性、高特異性、高精確度、實(shí)時性、污染少等優(yōu)點(diǎn) , 在微生物生態(tài)學(xué)中逐漸得到廣泛的應(yīng)用。 熒光定量 僅可以定性 ,也可以定量研究微生物群落結(jié)構(gòu)組成及數(shù)量變化 , 深入探索微生物群落與環(huán)境因子之間的相互作用及其動態(tài)變化過程。 2001) 等利用特異性 16S 物擴(kuò)增兩種甲苯降解菌 ,觀測河流中這兩種甲苯降解菌的群落動態(tài) , 熒光定量 果顯示 : X X. my 甲苯污染地區(qū)的豐度比非污染地區(qū)的高。 2003)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 12 等在研究重金屬污染梯度高流變區(qū)微生物群落時 , 利用熒光定量 術(shù)量化 16S 因拷貝數(shù)和 -, -, 個系統(tǒng)進(jìn)化類群 ,發(fā)現(xiàn)了與 重金屬離子梯度 正相關(guān)的 類群 從而 為預(yù)測河流重金屬污染的長期效應(yīng)提供了進(jìn)一步研究的基礎(chǔ) 。 面 的檢測 用之前 , 定量是用傳統(tǒng)的 跡的方法,其定量的下限是 106種方法要求的 量較大,因而其在基因表達(dá)研究應(yīng)用上受到很大的限制。實(shí)時熒光定量 發(fā)明,解決了這個難題,其靈敏度可檢測到 400 個分子的 以其精確、快速、污染小,已廣泛應(yīng)用于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域。實(shí)時熒光定量 法已廣泛應(yīng)用于 不 同生物體間、同一生熒光物體小同部位間等基因轉(zhuǎn)錄水平研究。 基因檢測 的應(yīng)用 在轉(zhuǎn)基因植物中,需要考查陽性植株中外源基 因 的拷貝數(shù), 因 為拷貝數(shù)通常會影響基因的表達(dá)和后代性狀的表現(xiàn)。目前常用的檢測技術(shù)是 交,但此技術(shù)需要大量的材料,操作繁瑣,相當(dāng)耗時。應(yīng)用實(shí)時定量熒光 可以對基因的拷貝數(shù)作測算,即用一個己知拷貝數(shù)的內(nèi)源基因作為參照,同時對樣品做內(nèi)源基因和外源基因的實(shí)時熒光定量 過兩者達(dá)到熒光域值時的 便可得到外源基 因 的拷貝數(shù) ; 實(shí)時熒光定量 轉(zhuǎn)基 因 動物的純合性鑒定上也有出色的表現(xiàn);另外,利用定量 可以對轉(zhuǎn)基 因 后 外源基 因 表達(dá)情況進(jìn)行監(jiān)測。 覃文( 2003) 等用實(shí)時熒光 術(shù)定量檢測轉(zhuǎn)基因玉米 分;曹際娟 ( 2003)等運(yùn)用實(shí)時熒光 術(shù)對轉(zhuǎn)基因玉米 系進(jìn)行鑒定;潘良文 ( 2003) 等運(yùn)用該方法對轉(zhuǎn)基因抗草甘磷油菜內(nèi)源特異參照基因 外源 3 終止子進(jìn)行檢測。 本論文研究目的和意義 及研究內(nèi)容 在微生物肥料行業(yè)中 ,光合細(xì)菌憑借其良好的使用效果,被越來越多的企業(yè)選為生產(chǎn)菌種。然而目前使用的 傳統(tǒng) 光合細(xì)菌檢測方法存在 著 一定的 缺點(diǎn), 影響了光合細(xì)菌 菌劑 的質(zhì)量檢測 工作。 傳統(tǒng)的光合細(xì)菌鑒 定基于 形態(tài)特征 和 生理 生化方法 , 但 光合細(xì)菌生長緩慢,分離純化工作要花費(fèi)較長時間, 僅 生理生化鑒定 就 需要 4 8 天的時間 , 因此傳統(tǒng)方 法主要缺點(diǎn)是檢測周期長,特異性不強(qiáng) 。 光合細(xì)菌菌量測定 的 標(biāo)準(zhǔn)方法是 ,而 要使 測定 結(jié)果真正達(dá)到最大幾率,實(shí)驗(yàn)必須滿足以下兩個條件:一是細(xì)菌不能互相凝集,不相互排斥,而是隨機(jī)分散在液體中;二是即使只接種一個細(xì)胞,也要能看見它的生長。然而在實(shí)際的操作過程中很難達(dá)到這兩個要求,特別 是 后一個條件 對光 合 細(xì)菌 來說很難 達(dá)到 , 所以 本身無法克服的一個缺點(diǎn)就是 計(jì)數(shù)效率 一般都比較低。 另一個缺點(diǎn)是檢測周期長,光合細(xì)菌生長緩慢,特別是在高稀釋倍數(shù)的情況下,接種的試管變紅需要很長時間,最長可達(dá) 14天的培養(yǎng)周期。另外,培養(yǎng)基的選用、培養(yǎng)的溫度和光照以及樣品本身的雜菌都會對計(jì)數(shù)產(chǎn)生影響。 因此,迫切需要快速、準(zhǔn)確、靈敏的先進(jìn)光合細(xì)菌檢測技術(shù) 和 方法 , 以 滿足 光合細(xì)菌的 質(zhì)量 檢測 , 提高 質(zhì)檢的準(zhǔn)確性和時效性 。 由于 法有著快速、準(zhǔn)確和靈敏的特點(diǎn),已經(jīng)在醫(yī)學(xué)和衛(wèi)生檢測方面得到了廣泛的中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 13 應(yīng)用,對各種病毒和病源體如乙肝病毒、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等病源菌建立了 測方法,特別是近期美國 準(zhǔn)了禽流 感診斷方法 轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng))于用于人類患者檢測。這都表明了隨著技術(shù)的發(fā)展,分子生物學(xué)技術(shù)將在微生物檢測領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用。 本研究 擬從 分子生物學(xué) 角度 ,主要 利用 法, 以微生物肥料生產(chǎn)中常用的光合細(xì)菌沼澤紅假單胞和類球紅細(xì)菌為例, 建立 快速、準(zhǔn)確、靈敏的光合細(xì)菌 的鑒定和定量的 分子生物學(xué)方法 ,以 解決 目前光合細(xì)菌檢測中 存在的問題。 本研究從分子生物學(xué)角度,主要利用 法, 以微生物肥料生產(chǎn)中常用的光合細(xì)菌沼澤紅假單胞 菌 和類球紅細(xì)菌為 研究對象 , 建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的光合細(xì)菌的鑒定和定量的分 子生物學(xué)方法 ,以解決目前光合細(xì)菌檢測中存在的 技術(shù)困難與 問題。 具體的研究目標(biāo)是,建立 的新技術(shù) 方法使 光合細(xì)菌 的質(zhì)量 檢測過程簡便快速 、 客觀準(zhǔn)確 和標(biāo)準(zhǔn)化 ;提高 產(chǎn)品 中 光合細(xì)菌菌株的純化鑒定 的 準(zhǔn)確 性和時效性 。同時,本論文還對實(shí)時熒光定量 定光合細(xì)菌菌數(shù)進(jìn)行探索性研究 , 為該技術(shù)在微生物肥料檢測中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 為此本論文主要對以下幾方面內(nèi)容進(jìn)行研究: ( 1) 設(shè)計(jì) 沼澤紅假單胞菌 和類球紅細(xì)菌種 特異引物, 優(yōu)化 應(yīng)條件, 建立 起 ( 2) 驗(yàn)證 沼澤紅假單胞菌 和類球紅細(xì)菌 定方法 的特異性和 擴(kuò)增產(chǎn)物的 準(zhǔn) 確性 ; ( 3) 定方法在產(chǎn)品檢測中的應(yīng)用; ( 4) 設(shè)計(jì) 光合細(xì)菌紫色非硫細(xì)菌的通用引物 , 并驗(yàn)證該引物的通用性和特異性。并以該引物作為光合細(xì)菌特異引物, 建立熒光定量 定光合細(xì)菌菌數(shù)的方法 及其在產(chǎn)品測定中的應(yīng)用 。 術(shù)路線 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 實(shí)驗(yàn)材料和基本實(shí)驗(yàn)方法 14 第二章 實(shí)驗(yàn)材料 和 基本 實(shí)驗(yàn)方法 驗(yàn)材料 株 表 2試菌株 in 種類型 菌種名稱 菌株編號 a 光合細(xì)菌 沼澤紅假單胞菌 球紅細(xì)菌 酸紅假單胞菌 膜紅細(xì)菌 R 比菌株 施氏假單胞 腸桿菌 草芽 孢 桿菌 淀粉芽孢桿菌 B. 衣芽孢桿菌 B. 短小芽孢桿菌 B. 大芽孢桿菌 , 蘇云金芽孢桿菌 B. 046 膠 胨樣 芽 孢 桿菌 B. 519 T 側(cè)孢 短 芽 孢 桿菌 氮類芽孢桿菌 多粘類芽孢桿菌 P 短短芽孢桿菌 大豆根瘤菌 10 中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心 ; 中國典型培養(yǎng)物保藏中心 ; 中國普通微生物菌種保藏管理中心 ; 湖南植保所 ; 其他為微生物肥料和食用菌菌種質(zhì)檢中心收集保藏 。 T 為模式菌株 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 實(shí)驗(yàn)材料和基本實(shí)驗(yàn)方法 15 要 實(shí)驗(yàn)儀器 : : 200; 熒光定量 : 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司 外可見分光光度計(jì) :北京普析通用有限責(zé)任公司 壓滅菌鍋 :三洋 3020 水浴鍋 : 北京德天佑科技發(fā)展有限公司 8A 凝膠成像系統(tǒng) : Q 離心機(jī) : 上海安亭科學(xué)儀器廠 16B 高速冷凍離心機(jī) : 純水器 : 上海同泰科技發(fā)展有限公司 10A 超凈工作臺 : 上海成順儀器儀表有限公司 900 養(yǎng)基 合細(xì)菌 培養(yǎng)用培養(yǎng)基 1.0 g, 0.5 g, 1.0 g, 0.1 g, 1.0 g, 醋酸鈉 1.0 g, 琥珀酸鈉 1.0 g, 酵母 膏 0.5 g, 3.0 g, 蛋白胨 0.5 g, 微量元素液 1.0 維生素液 1.0 蒸餾水 1 000 量元素液成份: 1.8 g, g, g, g, 0.7 g, 0.1 g, 0.5 g, 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 實(shí)驗(yàn)材料和基本實(shí)驗(yàn)方法 16 g, g, 蒸餾水 1 000 生素液成份: 生物素 0.1 g, 煙酸 g, 煙酸硫銨素 0.3 g, 對氨基苯甲酸 0.2 g, 泛酸鈣 0.1 g, 維生素 g, 鹽酸吡哆銨 0.1 g, 蒸餾水 1 000 培養(yǎng)基: 酵母膏 2.0 g 乙酸鈉 3.0 g 1.0 g 1.0 g 0.2 g 0.5 g 5.0 g 抗氧化劑 g 蒸餾水 1 000 mL 理生化培 養(yǎng)基 ( 1) 碳源利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基: ( 2.0 g 0.2 g 2O 0.5 g 1.0 g 0.5 g 蒸餾水 1 000 物終濃度糖醇類為 1,其他為 ,底物過濾滅菌。 ( 2) 檸檬酸鹽利用培養(yǎng)基 : 5 g 0.2 g 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 實(shí)驗(yàn)材料和基本實(shí)驗(yàn)方法 17 (2 1.0 g 1.0 g 檸檬酸鈉 2.0 g 溴百里酚藍(lán) 1%水溶液 10 脂 20 g 蒸餾水 1 000 mL 3) 酒石酸鹽利用 培養(yǎng)基: 蛋白胨 10 g 5 g 溴百里酚藍(lán) ( 12.5 石酸鉀 10 g 蒸餾水 1 000 mL 試劑 沖液 (1) 沖液 10 1 (2) 沖液 1010Cl( 1 (3) 1L) 至 (4) 上樣緩沖液 (6) 酚蘭, 20%蔗糖 (5) 電泳緩沖液 (5, 1 L) 酸 20 (6) 存液 (100 00應(yīng) 所需試劑 5U/L) 、 100不含 )、 25 自 取試劑 ( 1) 沖液: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 實(shí)驗(yàn)材料和基本實(shí)驗(yàn)方法 18 分別 稱取 硫氰酸胍( 和 式環(huán)已二胺四乙酸( 2- N, N, N, 稱 溶解于 20度為 40 沖液中 , 待試劑完全溶解后,用相同濃度的 液定容至 50成濃度 4 的 沖液 。 ( 2) 洗滌緩沖液: 按下列組成成分配制 500滌緩沖液:無水乙醇 60, 20, 00,用超純水定容至 500藏于玻璃瓶中。 ( 3) 硅藻土吸附緩沖液:稱取 5g 硅藻土( 司出品,商品名為 用 1 次,最后按 1: 1( w/v )加入 1沖液,配成硅藻土吸附液。 ( 4) 8g 2O 1 000mL 5) 2% 2 mL 100 隆測序試劑 自天根生物公司; 50mg/經(jīng)科生物公司; 載體 購自 寶生物工程(大連)有限公司 感受態(tài)細(xì)胞 大腸桿菌 自鼎國生物公司; 引物 : 5 3): ( 5 3): 引物 由上海生工合成 劑 劑盒購自寶生物工程 (大 連 )有限公司 ; 聯(lián)管 購自 司 。 本 實(shí)驗(yàn)方法 : 合細(xì)菌的培養(yǎng) 用培養(yǎng)基 光合細(xì)菌進(jìn)行活化,光合細(xì)菌的富集使用培養(yǎng)基 養(yǎng)條件中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 實(shí)驗(yàn)材料和基本實(shí)驗(yàn)方法 19 為:溫度 30 34 ,光照為 1000 2000 合細(xì)菌 總 取 A. 菌體收集: 取 液于 中, 9000r/心 4集菌體, 20保存。 B. 將收集到的菌體用 1沖液洗滌菌體 2 次。 C. 加入 500L 沖液,混合均勻 , 靜置 20 D. 將硅藻土吸附緩沖液充分搖勻,每管加入 20L30L 該吸附液, 振蕩均勻后室溫放置 15 E. 13000r/心 30s,棄上清,再加入 20沖液,混合均勻后室溫放置 10上法離心處理。 F. 洗滌緩沖液洗滌上述硅藻土沉淀 3 次,每次 300L。 G. 用 200L 70的酒精洗滌硅藻土沉淀 1 次, 13000r/心 2去酒精溶液,真空抽干。 H. 最后根據(jù)每管加入硅藻土的量,向每管加入 20L 30L 1沖液,在渦旋振蕩器上充分混合均勻, 65 保溫 30 I. 13000r/心 5心將上清液移至另一支已編號的 ,該溶液即為從菌株中提取的 品。 品貯藏于 。 合細(xì)菌基因組 電泳檢測 1%凝膠 , 色 30140V 穩(wěn)壓電泳 50通過 凝膠圖像分析儀下分析結(jié)果。 合細(xì)菌基因組 濃度和純度測定 提取的光合細(xì)菌 紫外分光光度計(jì)檢測其濃度。 量測定方法:將提取的 板進(jìn)行適度稀釋,用紫外分光光度計(jì)測定 260D 值 。 量 =釋倍數(shù) 50 g000 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第三章 光合細(xì)菌 定技術(shù)的 建立及其應(yīng)用研究 20 第三章 光合細(xì)菌 定技術(shù)的 建立及其應(yīng)用研究 本章利 用細(xì)菌遺傳物質(zhì)中高度保守的核酸序列 ( 16 ,對微生物肥料中常用 的 光合細(xì)菌 沼澤紅假單胞菌( 類球紅細(xì)菌( 進(jìn)行 特異引物設(shè)計(jì), 使用 已知 模式 菌株進(jìn)行 證 ,以 篩選特異性引物 ;并優(yōu)化鎂離子濃度和 確定 退火溫度 等環(huán)節(jié), 建立這兩種光合細(xì)菌的 定 方法 ,同時 對 其 擴(kuò)增產(chǎn)物克隆測序 ,檢驗(yàn)其 是否為目的產(chǎn)物 。 通過 對不同屬種光合細(xì)菌、光合細(xì)菌復(fù)合使用的菌株和雜菌進(jìn)行 增,驗(yàn)證 建立的 定方法的特異性。 并 使用 定 方法 檢測光合細(xì)菌產(chǎn)品, 考察 該 技術(shù)在產(chǎn)品檢測中應(yīng)用的 可行性 。 驗(yàn)方法 物設(shè)計(jì) 與 初篩 首先 在 據(jù)庫中檢索并下載 紅假單胞菌屬和紅細(xì)菌屬 各個菌種 的基因 序列 , 在此基礎(chǔ)上篩選出可以進(jìn)行種間比對和引物設(shè)計(jì)的靶基因 16 因序列,通過件對各個種的基因進(jìn)行差異水平分析 , 選 擇 有差異的片段設(shè)計(jì)種特異引物。 設(shè)計(jì)引物時 遵循 以下原則:( 1)引物長度為 18 24 個堿基;( 2) 在 55 65 ,引物 間的 , 量在 40% 60%;( 3)避免引物自身形成發(fā)卡結(jié)構(gòu); ( 4)優(yōu)先考慮變異發(fā)生在 3端、變異堿基 3 個 以 上 的 引 物 。 將 設(shè)計(jì)好的 引 物 在 互 聯(lián) 網(wǎng) 上( )進(jìn)行比對,每條引物在本種內(nèi)的同源性應(yīng)為 100,與其他種群的菌株同源性則應(yīng)很低。 使用 設(shè)計(jì)好的特異引物, 采用表 3的反應(yīng)條件,對 各自模式菌株基因組 行 根據(jù) 果篩選特異引物。 表 3應(yīng)條件 CR 增反應(yīng)體系 (20l): 環(huán)條件 10 2 L 10) L 引物 R( 10) L 引物 F( 10) L ( l) L 模板 1L 補(bǔ)足 20 L 初始變性 95 5 性 95 40s 退火 理論退火溫度 40 s 30 個循環(huán) 延伸 72 30 s 最后延伸 72 10 應(yīng)條件 的 建立 使用篩選出的兩個特異引物, 分別 以各自 模式菌株沼澤紅假單胞菌 因組 模板 ( 模板 取方法見 , 在不同退火溫度和鎂離子濃度的中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第三章 光合細(xì)菌 定技術(shù)的 建立及其應(yīng)用研究 21 條件下進(jìn)行 增,根據(jù) 應(yīng)結(jié)果確定 應(yīng)體系和反應(yīng)條件。 火溫度確定:設(shè)計(jì)梯 度 應(yīng)程序,退火溫度依次為 55 、 、 、 、65 , 根據(jù)結(jié)果選擇能夠出現(xiàn)目的條帶的最高 退火溫度 為方法的退火溫度 。 離子濃度確定:反應(yīng)體系中鎂離子體積分別為 根據(jù)結(jié)果選擇能夠出現(xiàn)目的條帶的最低鎂離子體積為方法的鎂離子濃度。 已 確定的退火溫度和鎂離子濃度的條件下 ,對 種內(nèi)各個 菌 株進(jìn)行 增,檢查在此反應(yīng)條件下種特異引 物在種內(nèi)的通用性。如果 有菌株 應(yīng)為陰性 ,對反應(yīng)條件進(jìn)行 調(diào)整 , 直到各個菌株都出現(xiàn)目的條帶為止 ,以此反應(yīng)條件作為種特異 反應(yīng)條件。 定方法 特異性 驗(yàn)證 以表 2供試菌株基因組 模板 ( 模板 取方法見 分別使用沼澤紅假單胞 菌 和類球紅細(xì)菌的特異引物 ,在已建立的 應(yīng)條件下 進(jìn)行 擴(kuò)增, 檢 驗(yàn) 引物 的種特異性 。 物序列測定 物的回收 ( 1)檢測合格后將所有的產(chǎn)物于大點(diǎn)樣孔點(diǎn)樣、電泳。 ( 2) 電泳后在長波紫外光下,迅速用干 凈的手術(shù)刀割下含所要回收的瓊脂塊,放入 ( 3)加入 100加 400L),混勻后置于 50水浴中 10 2 勻一次),使膠徹底融化。 ( 4)將融化的膠全部轉(zhuǎn)移到 中,柱子放入 溫放置28000r/心 1 ( 5) 取下 ,棄去離心管中的廢液,將柱子放回同一離心管中,加入 50010000r/心 30s。 ( 6)重復(fù)步驟( 5)一次。 ( 7) 取下 ,棄去離心管中的全部廢液,將柱子放回同一離心管中, 10000r/0s,以除去殘余的 ( 8)將柱子放入干凈的 心管中,在柱子中央加入 20100L 溫放置 2高洗脫液的溫度至 55有利于提高 洗脫效率。 ( 9) 10000r/心 1 集離心管中的液體即為回收的 段。 增回收產(chǎn)物與 T 載體的連接 按照上海生工的 T 載體 物克隆試劑盒說明來操作:在 增反應(yīng)管中,依次加入下列各成分, 16 連接過夜。 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第三章 光合細(xì)菌 定技術(shù)的 建立及其應(yīng)用研究 22 純化后的 物 L L L 組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和藍(lán)白斑篩選 ( 1)將感受態(tài)細(xì)胞從超低溫冰箱中拿出,置于冰上解凍,取 50L 加入 心管中,將連接液全 量( 入該離心管中,輕輕混勻,冰浴 30 ( 2) 熱擊 90s,立即置于冰上 2 ( 3)加入 450 l 體培養(yǎng)基,于 37 , 200蕩培養(yǎng) 60 ( 4)在一制備好的含氨芐青霉素 100g/L 的 板上加 40l 存液( 20mg/ 16L 50mg/涂布均勻, 37 放置 60 ( 5)?。?3)中的 100l 涂布于( 4)中平板, 37 培養(yǎng) 12成單菌落,再將平板4 放置數(shù)小時,使藍(lán)色充分顯現(xiàn)。 重組克隆在 板上呈現(xiàn)白色,而非重組克隆呈藍(lán)色。 性克隆的檢測 ( 1)挑選白色菌落若干,用無菌牙簽點(diǎn)種于新鮮 脂平板上( 2 點(diǎn) /菌落), 37 培養(yǎng) 12 2)用無菌牙簽取菌落于 20l 超純水中,沸水煮 15 3) 12000心 3-5 清作為 應(yīng)模板。 ( 4)在 中加入下列各成分 增反應(yīng)體系如下 (20l) : 10 2 L 10) L 引物 10) 1 L 引物 10) 1 L ( l) L 模板 2L 補(bǔ)足 20 L 環(huán)條件 初始變性 94 4 性 96 30 s 退火 50 15 s 26 個循環(huán) 延伸 60 4 最后延伸 72 10 5) 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第三章 光合細(xì)菌 定技術(shù)的 建立及其應(yīng)用研究 23 列測定及 比對 將轉(zhuǎn)化成功的備份菌落接種至 體培養(yǎng)基中, 37 培養(yǎng) 12培養(yǎng)液交由上海生物工程有限公司測序 。測序結(jié)果 用在互聯(lián)網(wǎng)上( )進(jìn)行比對。 敏度檢測: 取起始濃度 為 1g/L 的基因組 滅好菌的 其逐步 按 1: 10; 1: 100; 1:1000; 1: 10000; 1: 100000; 1: 1000000 稀釋, 分別取 1應(yīng),來確定 應(yīng)的靈敏度。 法在光合細(xì)菌產(chǎn)品檢測中的應(yīng)用 選取 6 個光合細(xì)菌 菌劑產(chǎn)品 ,分別使用傳統(tǒng) 鑒定 方法和 法進(jìn)行檢測, 比較兩種方法的結(jié)果, 考察 該 技術(shù)在產(chǎn)品檢測中應(yīng)用的 可行性 。 統(tǒng) 鑒定 方法 1. 光合細(xì)菌的分離 純化 將樣品在 R 培養(yǎng)基瓊脂( 板上劃線,在厭氧條件下, 28 30 光照培養(yǎng) 47 天。挑出典型菌落,重新劃線培養(yǎng),直到 菌落一致 為止。 2. 光合細(xì)菌生理生化的鑒定 對已純化好的光合細(xì)菌做 以 下幾 項(xiàng) 生理生化實(shí)驗(yàn) : 檸檬酸鹽、硫代硫酸鈉、乙醇、甘露醇和酒石酸鹽利用實(shí)驗(yàn) (參照東秀珠常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊) 。 法 1. 樣品 取 按 法提取 。 2. 法的應(yīng)用 采用 的 反應(yīng)條件和反應(yīng)體系 進(jìn)行。 3. 產(chǎn)物測序 物直接測序,測序由上海生工完成。 果 與分析 物設(shè)計(jì) 與篩選 設(shè)計(jì)的引物及其序列見表 3用這 5 對引物分別對各自的模式菌株進(jìn)行 增,擴(kuò)增產(chǎn)物通過 1瓊脂糖凝膠電泳檢測,根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選出能夠特異擴(kuò)增的合適引物。 使 用表 3的 5 對引物分別對各自的模式菌株沼澤紅假單胞菌 類球紅假單胞菌 行 增,實(shí)驗(yàn)結(jié)果 見 圖 3圖 3見,
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 人人文庫網(wǎng)僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 會計(jì)崗位轉(zhuǎn)正工作總結(jié)
- 2025屆江西省南昌市蓮塘一中物理高二下期末考試模擬試題含解析
- 人力資源合同
- 社區(qū)快遞物流“最后一公里”問題的解決方案研究
- 幼兒園園本培訓(xùn)活動總結(jié)
- 惡性葡萄胎的護(hù)理查房
- 籃球比賽策劃方案
- 肝淋巴瘤的護(hù)理查房
- 遼寧省沈陽市鐵路實(shí)驗(yàn)中學(xué)2025年物理高一下期末考試模擬試題含解析
- 產(chǎn)褥期結(jié)核病健康宣教
- GB/T 33490-2025展覽展示工程服務(wù)基本要求
- 2024年國能榆林化工有限公司招聘真題
- 消防總隊(duì)面試題目及答案
- 《低鈉血癥中國專家共識(2023年版)》解讀課件
- 公司法期末考試卷及答案
- GB/T 45604-2025船舶與海洋技術(shù)大抓力平衡錨
- 國家中小學(xué)智慧教育平臺與人工智能融合應(yīng)用指南(試行)
- 混凝土攪拌站企業(yè)管理規(guī)范與要求
- 物業(yè)公司接管寫字樓項(xiàng)目工作時間倒推計(jì)劃表(T日為入駐日)
- 重點(diǎn)人口管理工作規(guī)定
- T-CALC 005-2024 急診患者人文關(guān)懷規(guī)范
評論
0/150
提交評論