【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）專(zhuān)一性脫硫菌LY822的分離篩選及脫硫基因工程菌的構(gòu)建微生物學(xué)碩士論文

I 密級(jí) : 論文編號(hào) : 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩士學(xué)位論文 專(zhuān)一性脫硫 菌 分離篩選及脫硫 基因工程菌的構(gòu)建 I 要 專(zhuān)一性 微生物脫硫 技術(shù) 能選擇 地 性脫除加氫脫硫技術(shù)難以脫除的 芳香族 含硫化合物，是實(shí)現(xiàn)石油及其產(chǎn)品深度脫硫有效的技術(shù)之一 。 分離篩選優(yōu)良的菌株，構(gòu)建高效的脫硫工程菌是提高微生物脫硫能力的重要途徑 。本文 以此為研究目標(biāo)，開(kāi)展了專(zhuān)一性脫硫菌株的分離鑒定、脫硫基因克隆、啟動(dòng)子功能鑒定、表達(dá)載體和工程菌的構(gòu)建以及脫硫活性評(píng)估等方面的 研究。 采用以二苯并噻吩（ 唯一硫源的培養(yǎng)基，經(jīng)馴化培養(yǎng)，從我國(guó)山東勝利油田土樣中分離到一株專(zhuān)一性脫硫菌株 該菌培養(yǎng)五天后的代謝產(chǎn)物高效液相色譜（ 析的結(jié)果表明 ， 的 全轉(zhuǎn)化為 22證明該菌株是“ 4S 途徑”的專(zhuān)一性脫硫菌。菌株形態(tài)特征及 16列分析表明，該菌屬于紅球菌屬進(jìn)化分枝，與紅平紅球菌 源性最高，達(dá)到 故將該菌初步鑒定 為 以 的質(zhì)粒 模板， 應(yīng)擴(kuò)增了三個(gè)脫硫結(jié)構(gòu)基因片段 小分別為 用表達(dá)質(zhì)粒 別克隆了三個(gè)脫硫基因 ， 并在大腸桿菌 誘導(dǎo)表達(dá)，全細(xì)胞蛋白電泳分析發(fā)現(xiàn)有相應(yīng)的清晰融合蛋白條帶產(chǎn)生。 以帶有報(bào)告基因 質(zhì)粒 大腸桿菌 出發(fā)質(zhì)粒，構(gòu)建了三個(gè)帶有不同啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒 擊轉(zhuǎn)化紅平紅球菌 光共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果表明，當(dāng) 因受 硫鏈絲菌肽抗性基因 )啟動(dòng)子調(diào)控時(shí)， 因的表達(dá) 效率最高 ， 而且不再受硫酸鹽的抑制。 以紅平紅球菌 質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增了脫硫基因的全片段，連接于經(jīng) 切的 得到帶有脫硫基因的表達(dá)載體 分別電擊轉(zhuǎn) 化 和吖啶橙消除質(zhì)粒的 ， 脫硫活性測(cè)定結(jié)果表明 ， 動(dòng)子調(diào)控的工程菌株 脫硫能力提高最顯著，即使在有硫酸鹽存在的條件下，脫硫活性也不受抑制。這與用報(bào)告基因得到的研究結(jié)果一致。 在實(shí)際體系柴油（硫含量 497脫硫結(jié)果表明，帶有 粒的重組菌 應(yīng) 4小時(shí)的脫硫率達(dá)到 82%以上，高于原始菌株的 61%。 關(guān)鍵詞 : 生物脫硫，二苯并噻吩，脫硫基因， is to it is be or DS of of is of is an to of as to by 6to NA as 1.0 .2 kb of is . be to of By FP in or FP in by of so of it by in by of in of 97 h, 2% of in 1% of in 文縮略表 英文縮寫(xiě) 英文全稱(chēng) 中文名稱(chēng) 苯并噻吩 甲基亞砜 色熒光蛋白 鏈絲菌肽抗性基因 一性脫硫基因 類(lèi)固醇基因 克隆位點(diǎn) 糖體結(jié)合位點(diǎn) 效液相色譜 百萬(wàn)分之一 錄 第一章 文獻(xiàn)綜述 . 1 言 . 1 油產(chǎn)品脫硫的意義 . 2 油燃料的脫硫方法 . 3 氫脫硫 . 3 氧化脫硫 . 3 吸咐脫硫 . 4 生物脫硫的研究進(jìn)展 . 4 一性脫硫菌株的篩選 . 6 一性脫硫機(jī)理的研究 . 7 一性脫硫相關(guān)基因的研究 . 8 脫硫表達(dá)載體的構(gòu)建 . 10 論文的研究目的及工作設(shè)想 . 10 V 第二章 專(zhuān)一性脫硫菌 分離和鑒定 . 12 料與方法 . 12 驗(yàn)材料 . 12 驗(yàn)方法和步驟 . 13 果與分析 . 18 硫菌的分離篩選 . 18 一性脫硫的檢測(cè) . 18 種的鑒定 . 18 硫基因的克隆和誘導(dǎo)表達(dá) . 19 結(jié) . 20 第三章 紅球菌表達(dá)載體的構(gòu)建 . 22 料與方法 . 22 株與質(zhì)粒 . 22 培養(yǎng)基 . 23 試劑 . 23 抗生素 : . 24 儀器設(shè)備 . 24 實(shí)驗(yàn)方法和步驟 . 24 果與分析 . 32 達(dá)載體的構(gòu)建 . 32 動(dòng)子功能的檢測(cè)和比較 . 38 小結(jié) . 41 第四章 脫硫基因工程菌的構(gòu)建及其脫硫性能檢測(cè) . 42 料與方法 . 42 驗(yàn)材料 . 42 研究方法 . 44 結(jié)果與分析 . 45 建質(zhì)粒 . 45 建重組菌 脫硫活性比較 . 49 油脫硫?qū)嶒?yàn) . 54 小結(jié) . 54 第五章 結(jié)論與展望 . 55 考文獻(xiàn) . 56 致 謝 . 66 作者簡(jiǎn)歷 . 67 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 1 第一章 文獻(xiàn)綜述 言 環(huán)境污染越來(lái)越成為影響人類(lèi)生存的重大問(wèn)題。石油等化石燃料中含有無(wú)機(jī)硫和有機(jī)硫的化合物在燃燒后產(chǎn)生的二氧化硫，會(huì)造成嚴(yán)重環(huán)境污染 ， 排入大氣會(huì)形成酸雨 ， 嚴(yán)重威脅環(huán)境與生態(tài)。為了保護(hù)環(huán)境 ， 很多國(guó)家對(duì)含 硫燃料的生產(chǎn)管理和含硫氣體的排放制定了嚴(yán)格的法規(guī)。因此 ，對(duì)石油產(chǎn)品深度脫硫的研究已成為目前國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。 脫硫技術(shù)分為燃燒前脫硫 燃燒中脫硫和燃燒后脫硫三種。燃燒前脫硫是目前普遍采用的一種方法 ， 也 比較 適合我國(guó)國(guó)情的需要。燃燒前脫硫有物理法 化學(xué)法和生物法等 ， 物理法無(wú)法脫除有機(jī)硫 ， 而化學(xué)法脫除雜環(huán)分子中硫的效果較差 ， 切需要的反應(yīng)條件苛刻 ， 耗能大。生物脫硫技術(shù)是采用微生物降解燃料中含有機(jī)硫和無(wú)機(jī)硫化合物的方法 ， 專(zhuān)一性比較強(qiáng) ， 而且反應(yīng)條件溫和 ，成本低廉。 專(zhuān)一性脫硫是指能夠選擇性地攻擊含硫化合物中的 CS 鍵而不攻擊 CC 鍵的脫硫途徑 ，其最大的優(yōu)點(diǎn)是脫硫過(guò)程不降低化石燃料的燃燒值 ， 因此專(zhuān)一性脫硫也被稱(chēng)為非破壞性脫硫。以二苯并噻吩為模型化合物 ， 專(zhuān)一性脫硫可能有兩種方式 ， 如圖 是 的硫被連續(xù)地被還原生成 其余的 CC 結(jié)構(gòu)不受破壞生成聯(lián)苯。這一途徑盡管能夠?qū)Ｒ恍悦摿?， 但這一過(guò)程是一個(gè)連續(xù)還原的過(guò)程 ， 這一類(lèi)微生物大都是厭氧微生物 ， 脫硫速度慢 ， 脫硫產(chǎn)物是有害的體 ， 需要后處理過(guò)程 ， 工業(yè)應(yīng)用前景不大。第二種方法是連續(xù)地氧化 的硫 ， 使其以亞硫酸鹽的形式脫除 ， 而其余的結(jié)構(gòu)不受破壞。這一途徑 能最大限度的保持燃料的燃燒值 ， 脫硫過(guò)程無(wú)有毒物質(zhì)產(chǎn)生 ， 易于產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。 1989 年 二苯并噻吩為模型化合物分離得到了這樣的專(zhuān)一性脫硫微生物，從而使這一設(shè)想成為現(xiàn)實(shí)。此后，專(zhuān)一性脫硫微生物被不斷發(fā)現(xiàn)，脫硫酶與相關(guān)基因以及脫硫的機(jī)理也在不斷的研究中，采用基因工程手段改良菌株以及在S H 32 - O O 一性脫硫可能的兩種途徑 wo 國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 2 脫硫應(yīng)用方面的研究也取得了快速的發(fā)展。 油產(chǎn)品脫硫的意義 化石燃料的大量應(yīng)用帶來(lái)了一系列的問(wèn)題。燃燒后排放的氮氧化物和硫氧化物等氣體不僅污染空氣，影響居民的身體健康，還會(huì)形成酸雨 ， 都對(duì)環(huán)境產(chǎn)生嚴(yán)重的 危害。尤其是酸雨，到二十世紀(jì)的五十年代，酸雨就已是一個(gè)全球性的問(wèn)題。石油中的主要元素組成是碳和氫 ， 而煉制和燃燒中產(chǎn)生污染的主要是硫 氮等。硫在石油中以無(wú)機(jī)硫和有機(jī)硫的形式存在。石油中的硫絕大部分是以有機(jī)硫化合物形式存在的，包括各種硫醇，硫醚，二硫化物和噻吩及其衍生物 (見(jiàn)圖 一般來(lái)說(shuō) ， 有機(jī)含硫化合物中 ， 噻吩類(lèi)化合物是最豐富的。噻吩類(lèi)芳香含硫化合物是石油中的主要的一類(lèi)含硫化合物 ， 其熱穩(wěn)定性高 ， 化學(xué)性質(zhì)不活潑。二苯并噻吩 (取代二苯并噻吩是傳統(tǒng)的石油加工中最難處理的一類(lèi)有機(jī)含硫化合物 ， 在過(guò)去十幾年 來(lái)一直被作為有機(jī)含硫化合物的模型化合物進(jìn)行研究。許多沸點(diǎn)較低的小分子含硫有機(jī)物比較容易通過(guò)簡(jiǎn)單的化學(xué)方法除去。而在石油中含量較多的稠環(huán)噻吩類(lèi)化合物卻很難將其除去。除去二苯并噻吩 (一切脫硫技術(shù)的共同目標(biāo)。 對(duì)于石油產(chǎn)品而言，燃料油中的硫化物損害汽車(chē)發(fā)動(dòng)機(jī)，在燃燒時(shí)生成酸性的 染環(huán)境，同時(shí)還嚴(yán)重影響柴油機(jī)動(dòng)車(chē)的氮氧化物 (氣轉(zhuǎn)化和顆粒物 (濾 系統(tǒng)的效率。因此 ， 降低車(chē)用燃料油中硫含量對(duì)于提高機(jī)動(dòng)車(chē)尾氣排放質(zhì)量從而保護(hù)環(huán)境具有十分重要的意義。S S 油中的含硫化合物 1 in 國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 3 日益嚴(yán)峻的環(huán)境形勢(shì)對(duì)環(huán)保的要求變得越來(lái)越嚴(yán)格。因此 ， 對(duì)燃料燃燒前進(jìn)行深度脫硫已迫在眉睫。 另外，石油中的硫還會(huì)腐蝕輸送管線(xiàn)和貯存設(shè)備，使石油精煉的催化劑中毒，二硫化物穩(wěn)定性差，加熱易分解成 與水共存時(shí)呈酸性 ， 會(huì)嚴(yán)重腐蝕設(shè)備。如果油品中含有 會(huì)反應(yīng)生成鹽酸 ， 腐蝕更為嚴(yán)重。高溫條件下，活潑的元素硫極易與普通鋼材生成硫化亞鐵，硫醇也能直接與鐵作用生成硫醇鐵而腐蝕設(shè)備 ， 因此石油中的硫化 物也是煉油工業(yè)的大敵 ，原油的脫硫也十分必要。 油燃料的脫硫方法 長(zhǎng)期以來(lái) ， 煉油工業(yè)采用堿洗的辦法來(lái)脫除油品中的硫化物 ， 這一方法較為簡(jiǎn)單 ， 但存在諸多問(wèn)題 ， 如環(huán)境污染嚴(yán)重和脫硫效率低等。原油通過(guò)堿洗可以除去油品中的絕大部分硫化物 ， 但卻產(chǎn)生大量的含硫廢水。如果不經(jīng)過(guò)妥善處理 ， 對(duì)環(huán)境的危害會(huì)相當(dāng)嚴(yán)重。因此開(kāi)發(fā)新的脫硫的方法很重要 ， 除生物脫硫外 ， 脫硫方法還有加氫脫硫 氧化脫硫和吸咐脫硫。 氫脫硫 加氫脫硫是在氫氣存在下使油品中的含硫 含氮化合物以及金屬有機(jī)化合物發(fā)生氫解 ， 從而達(dá)到精制的目的。 該過(guò)程可以使后繼工藝的催化劑免于中毒 ， 減少發(fā)動(dòng)機(jī)燃料中含硫 含氮化合物分子燃燒時(shí)產(chǎn)生的 大氣污染 ， 改善油品的使用性能。加氫脫硫 (在高溫 (300 )高壓 有氫存在和金屬催化劑的條件下進(jìn)行的脫硫反應(yīng)。傳統(tǒng)的加氫脫硫法只能脫除無(wú)機(jī)硫和簡(jiǎn)單的有機(jī)硫化合物 ， 而對(duì)于稠環(huán)噻吩類(lèi)含硫化合物 ， 如二苯并噻吩(特別是烷基取代 生物，傳統(tǒng)的 術(shù)更難以脫除。近幾年來(lái) 術(shù)得到了很大的發(fā)展 ， 一方面通過(guò)改良催 化劑 (酸性催化 金屬硫化物協(xié)同或碳化鉬化 )，另一方面也研制了無(wú)催化劑加氫脫硫工藝 (過(guò)去不能處理的硫化物如 : 4， 6， 6在都能順利地脫硫。在各種脫硫方法中 ， 加氫脫硫是相對(duì)成熟和完善的一種方法并已經(jīng)在生產(chǎn)中投入使用 ， 而且加氫處理可以達(dá)到脫氮 脫氮 脫金屬等的目的。但是 ， 加氫法反應(yīng)條件苛刻 ， 溫度在 300以上，壓力在 裝置投資大 ， 操作費(fèi)用高 ， 導(dǎo)致油品成本大幅上升。正是由 于加氫脫硫成本過(guò)高 ， 導(dǎo)致 20世紀(jì) 80 年代以來(lái)柴油低硫化進(jìn)展緩慢。柴油加氫脫硫存在經(jīng)濟(jì)上的問(wèn)題 ， 另外脫硫副產(chǎn)物是對(duì)環(huán)境有害的 體 ， 面臨一個(gè)二次污染和再處理的過(guò)程。因此 ， 加氫脫硫不是一個(gè)最理想的脫硫方式。 氧化脫硫 由于碳硫鍵近似無(wú)極性 ， 有機(jī)硫化合物與相應(yīng)的有機(jī)碳?xì)浠衔镄再|(zhì)相似 ， 兩者在水或極性溶劑中的溶解性幾乎無(wú)差別。但是 ， 有機(jī)含氧化合物在水或極性溶劑中的溶解度要大于其相應(yīng)的有機(jī)碳?xì)浠衔?。因?， 通過(guò)氧化將一個(gè)或兩個(gè)氧原子連到噻吩類(lèi)化合物的硫原子上 ， 就能增加其極性使其更容易溶于極性 溶劑 ， 從而達(dá)到與烴類(lèi)分離的目的。從原子結(jié)構(gòu)上來(lái)看 ， 硫原子比氧中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 4 原子多一層軌道 ， 這使得硫化合物容易接受氧原子被氧化 ， 如噻吩類(lèi)化合物被氧化為砜或亞砜。這樣就可以用一種選擇性氧化劑將有機(jī)硫化合物氧化成砜類(lèi) ， 然后選擇適宜的溶劑 (如二甲亞砜(N， N二甲基甲酰胺 (糠醛 乙腈 環(huán)丁砜 硝基甲烷 N甲基吡咯烷酮 (乙二胺等 )， 將砜類(lèi)從柴油中萃取出來(lái)。根據(jù)氧化劑和反應(yīng)類(lèi)型的不同 ， 氧化脫硫法可分為 光化學(xué)氧化和催化氧化等方法。氧化脫硫法以其脫硫率高 (可降至 1反應(yīng)條件溫和 (多 為常溫常壓 )設(shè)備投資和操作費(fèi)用低 (僅為同規(guī)模 0%以下 )工藝流程簡(jiǎn)單 (無(wú)須制氫裝置和 產(chǎn)品質(zhì)量高 安全環(huán)保 (低 等優(yōu)點(diǎn)成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。許多氧化脫硫技術(shù)還具有同時(shí)對(duì)柴油脫酸的功能。但是硫氧化物的后處理和氧化劑的選擇性等方面也還存在一系列的問(wèn)題。關(guān)鍵在于尋找一種高效 廉價(jià) 選擇性高的氧化劑體系 ， 并能尋求到氧化態(tài)硫化合物的出路。在高效催化劑作用下 ， 用空氣作氧化劑 ， 對(duì)柴油中的有機(jī)硫化合物進(jìn)行緩和的催化氧化，是一個(gè)很有前途的研究方向 。 吸咐脫硫 最早的 吸咐脫硫技術(shù)主要用于氣體脫硫。后來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)很多吸附劑也具有從汽油和柴油中脫除含硫 含氧和含氮等極性有機(jī)化合物的能力 ， 如分子篩 活性炭 氧化鋁及一些復(fù)合氧化物等。由于芳烴和硫化物極性很相近 ， 因而使用一般的吸附劑在脫硫的同時(shí)也吸附了大量的芳烴。為此 ，用于汽油和柴油脫硫的吸附劑通常需要進(jìn)行改性處理 ， 如用 換的 X 型沸石 用 換的石 經(jīng)處理的紅泥 用 理的白土 用 理的斜方冰積巖 絲光沸石等都對(duì)硫化物有較好的選擇性。近期國(guó)外較有代表性的汽油與柴油吸附脫硫技術(shù)有三種 ， 具有各自的特 點(diǎn)。 工藝過(guò)程簡(jiǎn)單 易操作 投資及操作費(fèi)用低 ， 但要求吸附劑具有較高的容硫量并且易再生 ， 以延長(zhǎng)吸附 再生的操作周期。 術(shù)是流化床吸附脫硫技術(shù) ， 工藝過(guò)程較復(fù)雜 ， 但脫硫率較高 ， 加工費(fèi)用較低。而 S術(shù)是臨氫狀態(tài)下的流化床吸附脫硫技術(shù)，工藝過(guò)程比 術(shù)復(fù)雜，但脫硫率最高，原料適用范圍廣，從所使用的吸附劑及工藝條件來(lái)看， S程應(yīng)具有一定的加氫反應(yīng)。然而吸咐脫硫在吸咐的選擇性和吸咐劑再處理方面還存在許多問(wèn)題需要解決。目前 ， 汽 柴油吸附脫硫技術(shù)在國(guó) 內(nèi)外剛剛起步 ， 隨著新型吸附劑的研制及吸附劑再生技術(shù)的不斷完善 ， 吸附脫硫技術(shù)將具有廣闊的應(yīng)用前景。 以上三種脫硫技術(shù)各有利弊 ， 但都不完善 ， 也不能滿(mǎn)足環(huán)保對(duì)燃料油的要求。相比物理法和化學(xué)法，生物脫硫既能脫除無(wú)機(jī)硫也能脫除有機(jī)硫，尤其是具有“ 4S”途徑的專(zhuān)一性脫硫微生物，選擇性攻擊雜環(huán)化合物上的 而不打斷苯環(huán)上的 ，完好地保留了燃料的熱值，反應(yīng)條件溫和，設(shè)備簡(jiǎn)單，耗能少，成本和操作費(fèi)用低，為石油產(chǎn)品深度脫硫技術(shù)的廣泛應(yīng)用提供了廣闊的前景。 生物脫硫的研究進(jìn)展 早在 1935 年 ， 就有報(bào)道用某種硫 還原菌脫硫粗油中的硫。早期是把原油在通氣條件下與水相中的細(xì)菌接觸 ， 使油中有機(jī)硫化合物轉(zhuǎn)化為水溶性無(wú)機(jī)硫化合物 ， 從而選擇性地進(jìn)行烴類(lèi)的脫硫。但是 ， 細(xì)菌反應(yīng)不易控制 ， 脫硫過(guò)程需消耗大量的油。后來(lái)的 30 年中由于相關(guān)技術(shù)的缺乏 ，研究?jī)?nèi)容被局限在篩選有效的脫硫微生物的工作上。 50 年代 布了第一份石油生物脫中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 5 硫的專(zhuān)利后 ， 陸續(xù)公布了許多專(zhuān)利 ， 使生物脫硫技術(shù)發(fā)展進(jìn)入了第一次高潮 ， 涉及的微生物種類(lèi)及其脫硫特性也不斷擴(kuò)展。 1968 年， 人在研究苯環(huán)化合物對(duì)農(nóng)作物生長(zhǎng)影響時(shí)發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬的以將 化成為幾種不同的水溶性產(chǎn)物，他們通過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這樣氧化的結(jié)果是 環(huán)中的 發(fā)生了斷裂 ， 使其最后變成了水溶性較強(qiáng)的分子 ， 但硫并沒(méi)有從分子中除去， 這就是所謂的 “徑 ”(如圖 示 )。 徑是以 的碳代謝為目的活動(dòng) ， 通過(guò)這一途徑 ， 硫并沒(méi)有真正從雜環(huán)化合物中脫除 ， 只是因?yàn)楫a(chǎn)物具有水溶性 ， 從而可以使硫化物離開(kāi)油相而進(jìn)入水相。這一途徑盡管可以脫硫 ， 但卻使雜環(huán)化合物分子本身被破壞 ， 石油的燃燒值降低 ， 因而應(yīng)用前景不大。 1974 年， 裝有油的 4 升發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)，五天內(nèi)脫去原油中 55%的硫，但也損失了 30%的原油。隨后 ， 司報(bào)道用假單胞菌將有機(jī)硫化合物降解為水溶性產(chǎn)物，并產(chǎn)生表面活性劑，有利于油水接觸，但其脫硫效率較低，僅為傳統(tǒng) 1/10。所以這些微生物不適合商業(yè)化應(yīng)用 ， 因?yàn)樗鼤?huì)破壞稠環(huán)芳香硫化物的碳骨架 ， 將其變成水溶性產(chǎn)物從燃料中脫除 ， 損失了燃料的燃燒值。 在 90 年代初，也發(fā)現(xiàn)了由 提供碳源又提供硫源的微 生物，它能將 次部分降解為 砜 ，最后生成苯甲酸酯和硫酸鹽這樣的微生物有 管有報(bào)道稱(chēng)該菌對(duì)添加 原油進(jìn)行脫硫時(shí)并不攻擊 管有報(bào)道稱(chēng)該菌對(duì)添加 原油進(jìn)行脫硫時(shí)并不攻擊烴類(lèi)化合物 ， 但必競(jìng)降低了石油的燃燒值 ， 因此不是一種理想的脫硫途徑。這樣從二十世紀(jì) 70 年代起， 術(shù)的研究進(jìn)入第二次高潮 ， 研究者從單純的菌種篩選中擺脫出來(lái) ， 開(kāi)始研究各個(gè)菌種脫硫的代謝機(jī)理 ， 這些機(jī)理的闡明不僅解 釋了這些菌種不能應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的原因 ， 也為專(zhuān)一性脫硫思想提供了重要的依據(jù)。實(shí)際上從上世紀(jì) 70 年代開(kāi)始的 “徑 ”研究直至現(xiàn)在也沒(méi)有停止 ， 因?yàn)楸M管它不適合于石油脫硫 ， 卻可以用于石油污染的生物治理。 們分離的假單胞菌 專(zhuān)一性地切斷 2基聯(lián)苯 。反應(yīng)中沒(méi)有 非常遺憾的是該菌性能不穩(wěn)定 ， 甚至于后來(lái)這一活性喪失 ， 不能再次重復(fù)以前 的性狀 ， 也不可能投入應(yīng)用。 1989年 , 美國(guó) 的研究 人員 展開(kāi)了深入的研究，提出了生物降解 稱(chēng) “4S”途徑， 實(shí)現(xiàn)了生物催化脫硫的重大突破。 在美國(guó)該菌種已被 被休斯頓的能源生物公司 (斷。 專(zhuān)門(mén)從事 1995年 3月投產(chǎn)了 試裝置， 1997年在得克薩斯州建成氣升式反應(yīng)器 。 1999年 1月， 001年第三季度投產(chǎn)。除加工該煉油廠(chǎng)的 795m3/裝置將可生產(chǎn)約 kt/到目前為止 ， 生物脫硫工業(yè)化生產(chǎn)尚處于起步階段。以下從專(zhuān)一性脫硫菌種篩選 脫硫機(jī)理研究 脫硫基因研究和應(yīng)用研究幾方面來(lái)綜述專(zhuān)一性脫硫技術(shù)的研究現(xiàn)狀。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 6 一性脫硫菌株的篩選 脫硫微生物的菌種分離是生物脫硫的基礎(chǔ)。自發(fā)現(xiàn)硫菌屬氧化鐵桿菌 夠氧化黃鐵礦以來(lái)，研究人員一直在尋找其他一些用于脫硫的微生物。 1974 年 據(jù) 18守序列設(shè)計(jì)引物，運(yùn)用 技術(shù)研究了被含有 石油污染的土壤的真菌變化情況，結(jié)果表明 土壤中的真菌是有持續(xù)的選擇性作用的。在專(zhuān)一性脫 硫菌 脫硫基因被克隆與測(cè)序之后，用 研究石油污染土壤中有三個(gè)優(yōu)勢(shì)菌群 ， 分別是放線(xiàn)菌 土壤細(xì)菌和未能鑒別的菌群。在生物脫硫研究中，常把二苯并噻吩 (為雜環(huán)有機(jī)硫化物的模型化合物，但用苯并噻吩也篩選到了類(lèi)似的專(zhuān)一性脫硫菌。高效的篩選技術(shù) ， 為獲得所期望的專(zhuān)一性脫硫菌奠定了基礎(chǔ)。已報(bào)道了幾十株的脫硫菌 ， 這些微生物有細(xì)菌類(lèi) ， 也有真菌類(lèi) ， 多數(shù)是革蘭氏陽(yáng)性菌 ， 只有少數(shù)是革蘭氏陰性 O O O O O i b e n z o t h i o p h e n e c i s - - 1 , 2 - d i h y d r o x y d i b e n z o t h i o p h e n ec i s - 4 - 2 - ( 3 - h y d r o x y ) t h i o n a p h t h e ny l 2 - o x o - 3 - b u t e n o i c a c i h y d r o x y - 2 - f o r m y l b e n z o t h i o p h e n et r a n s - 4 - 2 - ( 3 - h y d r o x y ) t h i o n a p h t h e n y l 2 - o x o - 3 - b u t e n o i c a c i 硫代謝的“ 徑” “國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 7 菌。為數(shù)最多的還是諾卡氏菌屬的 紅球菌。由于菌種及相關(guān)工藝的專(zhuān)利保護(hù) ， 各國(guó)研究機(jī)構(gòu)最初都致力于分離得到有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的合適菌種。繼 后，到目前為止，已經(jīng)有幾十株具有特異性脫硫途徑的細(xì)菌報(bào)道，其中多屬紅平紅球菌，如 1。與紅球菌分類(lèi)位置較近的一些菌，如 213E(0816)，有一些分類(lèi)位置較遠(yuǎn)的菌如 。以上這些菌種均是革蘭氏陽(yáng)性菌 ， 能專(zhuān)一性脫硫的革蘭氏陰性菌是 內(nèi)近年來(lái)也分離到一些脫硫微生物，如中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所分離的 本實(shí)驗(yàn)室分離的 。這些菌大都是室 溫菌 ， 適宜的生長(zhǎng)溫度在 2830。近年來(lái)人們認(rèn)識(shí)到嗜熱菌將給工業(yè)應(yīng)用帶來(lái)方便。由于溫度升高 ， 酶促反應(yīng)的速度也相應(yīng)地得到提高 ， 雜菌污