【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）虎杖白藜蘆醇合酶基因的克隆與表達(dá)生物化學(xué)與分子生物學(xué)碩士論文

密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 虎杖白藜蘆醇合 酶基因的克隆與表達(dá) of of 摘 要 白藜蘆醇（ 3,45稱(chēng) 一種天然存在的多酚化合物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)花生、葡萄、虎杖等植物中含有 白藜蘆醇 。據(jù)報(bào)道， 白藜蘆醇 有著廣泛的生物學(xué)和藥理學(xué)特性，如抗癌、抗炎癥、心 血管保護(hù)等作用。 白藜蘆醇 在植物保護(hù)中也發(fā)揮著重要作用。 白藜蘆醇合酶 （ 芪類(lèi)（ 質(zhì)合成的關(guān)鍵酶 ,催化一分子 豆酰 三分子 二酰 成 白藜蘆醇 。 酸 代謝途徑，是控制植物次生代謝產(chǎn)物合成途徑中重要的分支點(diǎn)的酶之一。苯丙酰代謝途徑幾乎存在于所有植物中，而 存在于少數(shù)有 植物中，大多數(shù)重要的作物都缺乏該基因，因此將 因 轉(zhuǎn)入無(wú) 植物 ,可以為該植物提供增強(qiáng)抗真菌侵染的防御體系或增強(qiáng)植物抗逆境脅迫的能力，還能提高一些作物的品質(zhì)。 本研究利用 ，從藥用植物虎杖（ 克隆到了 全長(zhǎng) 們將它命名為 從虎杖基因組 克隆到了一個(gè)具有全長(zhǎng)編碼區(qū)的 因序列和一個(gè)比全長(zhǎng)編碼區(qū)少了 72 因（ 列以及一個(gè)含有兩個(gè)內(nèi)含子的 因序列。將來(lái)自花生 ( 因 (來(lái)自虎杖的 核表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)， 因與 能正常表達(dá)成蛋白，而因在誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，卻未能檢測(cè)到相應(yīng)蛋白。植物表達(dá)時(shí)，用上述三個(gè)基因替換掉了面的 因，從而構(gòu)建了三個(gè)植物表達(dá)載體 用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入煙草品種 經(jīng) 測(cè)表明，目標(biāo)基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入煙草 ，且在 水平得到了表達(dá) 。但通過(guò) 藜蘆醇 。 關(guān)鍵詞 ：虎杖 ， 白藜蘆醇合酶 ， 轉(zhuǎn)基因煙草 is a in It is it a of as It is to be a to of in to in of of of of is in is in S. S be to by S in In A RS . A S a a 72 bp as a NA 1 in in in be no be to In in by US in in no be 錄 第一章 綜 述 . 1 白藜蘆醇 . 1 生化特性及其在植物中的分布與存在形式 . 1 生物合成途徑 . 1 作為植物雌激素而起到預(yù)防癌癥的作用 . 2 調(diào)節(jié)癌癥第一、二階段的酶 . 3 保護(hù)心血管系統(tǒng) . 3 白藜蘆醇與炎癥 . 4 藜蘆醇合酶 . 5 白藜蘆醇合酶 的酶學(xué)性質(zhì) . 5 白藜蘆醇合酶 與查爾酮合 酶 . 5 白藜蘆醇合酶 基因的誘導(dǎo)表達(dá) . 6 白藜蘆醇合酶 基因的轉(zhuǎn)基因研究 . 6 第二章 材料與方法 . 8 材料 . 8 方法 . 9 基本的實(shí)驗(yàn)方法 . 9 提取 （ 結(jié)合酸酚、高鹽溶液與 . 9 一條鏈的合成 . 9 克隆全長(zhǎng)基因 . 10 司的 體亞克隆 . 11 百泰克公司質(zhì)粒提取試劑盒 . 11 百泰克公司 段的回收 . 12 粘末端 進(jìn)行基因克隆 . 12 導(dǎo)表達(dá) . 13 蛋白的提取 . 13 鎳柱純化目標(biāo)蛋白 . 13 蛋白濃縮及分子篩純化 . 14 泳 . 14 虎杖基因組 提取 . 14 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備： . 15 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化： . 15 含目的基因的農(nóng)桿菌的鑒定 . 15 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo) 化煙草 . 15 提取煙草 . 15 9 用 理所提取的 . 16 白藜蘆醇的提取 . 16 色譜分析 . 16 第三章 結(jié)果與分析 . 17 虎杖 因全長(zhǎng) 克隆與測(cè)序分析 . 17 法克隆虎杖 因同源片斷 . 17 克 隆虎杖 因的 3末端 ： . 18 法克隆基因 5末端 . 19 全長(zhǎng)序列 . 19 與來(lái)自花生、葡萄、蓼科大黃屬的 因以及查爾酮 查爾酮合酶 基因進(jìn)行蛋白序列比對(duì) . 22 虎杖基因組 白藜蘆醇合酶基因同源序列的克隆與 分析 . 24 擴(kuò)增起始密碼子與終止密碼子之間的序列 . 24 從虎杖基因組 克隆到比全長(zhǎng)編碼區(qū)缺失了 72序列 . 25 從虎杖基因組 克隆到了含有全長(zhǎng)編碼區(qū)的序列 . 28 從虎杖基因組 克隆到含有兩個(gè)內(nèi)含子的序列 . 29 因的原核表達(dá) . 30 將 個(gè)基因克隆到 . 30 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)、純化與鑒定 . 33 白藜蘆醇合酶 基因的植物表達(dá) . 34 利用 T 載體 行亞克隆 . 34 植物表達(dá)載體的構(gòu)建 . 35 煙草的遺傳轉(zhuǎn)化 . 37 檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草植株 . 38 檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草植株 . 39 檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中白藜蘆醇的含量 . 40 討論 . 41 第四章 結(jié)論 . 42 基因克隆 . 42 原核表達(dá) . 42 植物表達(dá) . 42 參考文獻(xiàn) . 43 致謝 . 48 作者簡(jiǎn)歷 . 49 V 英文縮略表 縮略詞 中文全稱(chēng) 英文全稱(chēng) 落酸 芐青霉素 6b 羧芐青霉素 椰菜花葉病毒 35S 啟動(dòng)子 5S 六烷基三己基溴化銨 ,4,4 一二氯苯氧 乙酸 2,4碳酸二乙酯 硫蘇糖醇 B 溴化乙錠 二胺四乙酸二鈉 葡萄糖醛酸糖苷酶 丙基硫代 那 霉素 N 激動(dòng)素 E 巰基乙醇 乙酸 酸鈉 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 端快速擴(kuò)增 of 福平 轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 二烷基磺酸鈉 羥甲基氨基甲烷 B 菌培養(yǎng)基 43吲哚 - 5國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 綜述 1 第一章 綜 述 藜蘆醇 化特性及其在植物中的分布與存在形式 白藜蘆醇 （ 稱(chēng) 是一種植物次生代謝產(chǎn)物， 分子式為 對(duì)分子質(zhì)量為 228 25，為無(wú)色針狀結(jié)晶，難溶于水，易溶于乙醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、二甲亞砜等，有順、反兩種構(gòu)型，其中反式是穩(wěn)定結(jié)構(gòu) （見(jiàn)圖一） ，而且生物活性更加廣泛，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖一 (胡賧 等， 2005)。 它能保護(hù)植物免受病原微生物和草食動(dòng)物的侵害，是一種植保素 （ 994） 。 它是 1940年首次從毛葉藜蘆 (根部 獲得的（ 2005）。 白藜蘆醇 存在于葡萄 、花生、藜蘆、決明子和等天然植物中，到目前為止至少已在 21科、 31屬的 72種植物中發(fā)現(xiàn)了 白藜蘆醇 （ 1997） 。 在一些藥用植物中含量較高，尤其是蓼科植物虎杖 白藜蘆醇 的含量比花生和葡萄高很多 （ 曹庸 等， 2003） 。 白藜蘆醇 常被發(fā)現(xiàn)以糖苷（ 3,5,4 - D- 形式存在，見(jiàn)圖二（ 2005）。 隆到了一種能將 白藜蘆醇糖苷 轉(zhuǎn)變成白藜蘆醇的酶，命名為 D - 它水解 -（ 13 ） 2006） 。 圖一 反式白藜蘆醇 二 白藜蘆醇糖苷的順?lè)磧煞N構(gòu)型 生物合成 途徑 在植物中， 白藜蘆醇 是由一分子的香 豆酰 三分子丙二酰 白藜蘆醇合酶 (化形成的。 第一章 綜述 2 應(yīng) (et 992),它的催化步驟如圖三所示 (et 999)。 1994)已從葡萄中分離出 白藜蘆醇 生物合成途徑中的相關(guān)酶基因 ,白藜蘆醇 的生物合成途徑如圖四所示。 圖三 化的反應(yīng)步驟 S 圖四 白藜蘆醇 的生物合成途徑 of 44oA 作為植物雌激素而起到預(yù)防癌癥的作用 隨著年齡的增長(zhǎng)而引起的雌激素和雄性激素的減少會(huì)導(dǎo)致組織和器官功能的失調(diào) ，然而， 不平衡的荷爾蒙刺激可能使得細(xì)胞增殖超過(guò)分化和衰亡 ，因而增加了發(fā) 生癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。因此，激素依賴(lài)的腫瘤（乳房和前列腺，或其他的如肺）可以通過(guò)日常攝入恰當(dāng)量的選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)物來(lái)阻止其發(fā)生，這些復(fù)合物表現(xiàn)出了不同程度的對(duì)雌激素的競(jìng)爭(zhēng)與拮抗作用，雌激素受體的靶標(biāo)基因表達(dá)和其他相關(guān)細(xì)胞內(nèi)應(yīng)答依賴(lài)于細(xì)胞周期（ 2003） 。幾種多酚化合物在結(jié)構(gòu)上極像雌激素，例如植物雌激素類(lèi)黃酮 999） 。西方國(guó)家婦女乳腺癌發(fā)生率比亞洲國(guó)家高六倍，因?yàn)閬喼迖?guó)家婦女們常食用富含植物雌激素的豆 類(lèi)產(chǎn)品，表明，植物雌激素可作為一種癌癥的化學(xué)預(yù)防藥（ 2002） 。多酚化合物 白藜蘆醇 可以被看作是可以食用的植物雌激素，它對(duì)于雌激素受體表達(dá)或不表達(dá)的人類(lèi)腫瘤具有非常好的效果。 白藜蘆醇 的化學(xué)結(jié)構(gòu)像合成的雌激素 白藜蘆醇 屬于一型雌激素（ 003） 。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 綜述 3 節(jié)癌癥第一、二階段的酶 癌癥的起始是多個(gè)事件的結(jié)果。刺激因子（如激素、細(xì)胞因子）、壓力調(diào)節(jié)因子（ 炎癥氧自由基 ）的組合作用以及外源入侵物（病毒、輻射和異型生物質(zhì)復(fù)合物）都能影響細(xì)胞增殖的 控制從而導(dǎo)致組織的腫瘤化（ 2005）。 異型生物質(zhì)（致癌物和藥物）常常是很容易進(jìn)入細(xì)胞的脂溶性物質(zhì)。為了防止它們的毒害作用，細(xì)胞常通過(guò)所謂的生物轉(zhuǎn)化的處理過(guò)程使它們變得更親水、容易排泄。這個(gè)過(guò)程包括第一階段的酶的氧化作用和通過(guò)第二階段的酶連接上極性基團(tuán)，然而這種處理容易導(dǎo)致高反應(yīng)活性的氧自由基和其他容易與 而使前致癌物變成了致癌物（ 997）。 這個(gè)氧化階段包括了一些膜結(jié)合酶（例如細(xì)胞色素 ,它們利用氧分子引入氧原子。第二 個(gè)階段通過(guò)轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行，它們加入親水基團(tuán)或者改變分子的氧化還原狀態(tài)（如谷胱苷肽 轉(zhuǎn)移酶， 苯醌氧化還原酶）（ ， 2003， 2004）?；瘜W(xué)防治策略包括第一階段負(fù)責(zé)激活異質(zhì)型生物的酶的抑制和第二階段酶的誘導(dǎo)，它們能聯(lián)合已經(jīng)激活的復(fù)合物成為內(nèi)源配基（如谷胱苷肽）。 白藜蘆醇 是種外源的脂溶性的復(fù)合物，能跨過(guò)質(zhì)膜，進(jìn)行細(xì)胞代謝的，而且它可能與第一階段的酶相互作用。在體外白藜蘆醇抑制人重組的 450（ ,2003） 。進(jìn)一步的研 究表明，在鼠表皮中， 白藜蘆醇 也能誘導(dǎo)第二階段的酶（如 )H:苯醌氧化還原酶） (， 2004)。這些數(shù)據(jù)都增強(qiáng)了 白藜蘆醇 可以用于癌癥的化學(xué)預(yù)防這一假說(shuō)。 護(hù)心血管系統(tǒng) 白藜蘆醇 對(duì)心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用源于它能夠引起血管舒張（通過(guò)調(diào)節(jié)一氧化氮合成酶）、抑制前列腺素的產(chǎn)生（通過(guò)調(diào)節(jié)環(huán)氧合酶）以及具有抑制血小板凝聚、抑制低密度脂蛋白氧化、抗炎癥、清除自由基等作用。 已知一氧化氮有血管舒張?zhí)匦裕芤种蒲“屦じ骄奂?，而且能抑制粘連分子的表達(dá)，而且它能抑制 細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移（ 1997； 1989； 1991； 996）。很明顯，一氧化氮和 白藜蘆醇 享有一樣的靶標(biāo)。一氧化氮合成酶世含有亞鐵血紅素的單氧化酶，有一個(gè)還原酶區(qū)域和一個(gè)氧化酶區(qū)域。內(nèi)皮、神經(jīng)元、線粒體的一氧化氮合成酶的組成型異構(gòu)體能提供低細(xì)胞內(nèi)濃度的半壽期短且自由基一氧化氮。一種一氧化氮合成酶的可誘導(dǎo)形式，在發(fā)生炎癥時(shí)可以在轉(zhuǎn)錄水平激活，提供高濃度的一氧化氮（ 2005）。 白藜蘆醇 可能通過(guò)削弱血管生成的進(jìn)程來(lái)支持抗癌活性。已知這種復(fù)合 物能抑制內(nèi)表皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、血管的形成從而阻斷氧自由基的形成以及相關(guān)的 2003）。以為摩爾范圍內(nèi)的 白藜蘆醇 進(jìn)行處理，能通過(guò)促進(jìn)一氧化氮的釋放來(lái)誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞的松弛，而這能被一氧化氮合成酶的抑制物所逆轉(zhuǎn)（ ， 2002）。 白藜蘆醇 首先被發(fā)現(xiàn)在根部能抑制環(huán)氧化酶（ 活性，環(huán)氧合酶催化前列腺素生物合成的首個(gè)步驟 (底物是花生四稀酸 )。已知前列腺素是細(xì)胞增殖和血管生長(zhǎng)的刺激物，免疫監(jiān)視的抑制因子（ ， 2004）。在體外， 白藜蘆 醇 非競(jìng)爭(zhēng)地抑制環(huán)氧合酶和氫過(guò)氧化物酶 ， 1997;， 2004）。 白藜蘆醇 的這種雙效性是唯一的，因?yàn)榈湫偷姆侵袊?guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 綜述 4 類(lèi)固醇抗炎癥藥物（ 影響 1971； 003)。除了組成型的 種可誘導(dǎo)形式的 炎 癥藥物 和有絲分裂刺激所誘導(dǎo)（ ， 2003）。 既然 ， 1995； ， 1997）。所以盯住 天然的抗氧化劑，如維生素和多酚化合物，在預(yù)防跟自由基相關(guān)的疾病中起著重要的作用。白藜蘆醇 的抗氧化能力可能跟它能阻止動(dòng)脈硬化有關(guān)，因?yàn)榈兔芏戎鞍椎难趸?動(dòng)脈 硬化發(fā)生中的一個(gè)重要事件。 在胡蘿卜素的乙醇溶液中， 白藜蘆醇 能非常有效地清除羥基（氫氧基）（ ， 2003）。 白藜蘆醇 對(duì)于巨噬細(xì)胞（受到脂多糖和佛波醇酯刺激）產(chǎn)生的超氧自由基（ 能明顯減少化生四稀酸的釋放（由脂多 糖或佛波醇酯誘導(dǎo)、或通過(guò)暴露于 2）（ ， 2000）。有人對(duì) 白藜蘆醇 的抗氧化能力進(jìn)行過(guò)評(píng)估，發(fā)現(xiàn)它能阻止微粒體中 誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化；也能阻止 誘導(dǎo)的低密度脂蛋白的氧化（ ， 1997） ;還能抑制鐵離子或紫外照射所催化的鼠肝臟微粒體中的脂質(zhì)過(guò)氧化( 4.8 , （ ， 2000） 。最近有人在酵母 白藜蘆醇 的抗氧化效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)跟維生素 C、維生素 E、丙基末食子酸鹽相比， 白藜蘆醇 有更高的清除 ， 1999；， 1998） 。 藜蘆醇與炎癥 炎癥的發(fā)展是由前列腺素所介導(dǎo)的，對(duì)前列腺素的抑制作用可以部分解釋 白藜蘆醇 的化學(xué)預(yù)防和保護(hù)心血管效果。已經(jīng)有研究表明， 白藜蘆醇 能劑量依賴(lài)地抑制人外周血白細(xì)胞中 ， 2005）。活體實(shí)驗(yàn)中， 白藜蘆醇 能明顯降低已經(jīng)升高的 2004）。在體外 或活體模型中， 白藜蘆醇 也能降低環(huán)氧合酶 2的表達(dá)，環(huán)氧合酶 2能被炎癥所誘導(dǎo)，它催化前列腺素的產(chǎn)生（ ， 2005； 2004）。 白藜蘆醇 還被觀察到，能降低誘導(dǎo)型環(huán)氧合酶 2的活性（經(jīng)由信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制這種酶的表達(dá)）（ ， 1998；， 2004； 2004） 白藜蘆醇 也能抑制細(xì)胞因子的炎癥作用，如腫瘤壞死因子（ 白細(xì)胞介素 ， 1999； ， 2003）。核因子 是一種轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控基因參與炎癥與腫瘤發(fā)生（ ， 1997） 。抑制 核因子 是 白藜蘆醇 展現(xiàn)出抗腫瘤活性的可能機(jī)制。已經(jīng)在幾類(lèi)細(xì)胞株中觀察到， 白藜蘆醇 抑制了腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的核因子 的激活（ ， 2000； ， 2002） 。最近研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)抑制 核因子 的表達(dá)以及抑制由 核因子 調(diào)控的兩個(gè)酶（環(huán)氧合酶 2和基質(zhì)金屬蛋白酶）的表達(dá)， 白藜蘆醇 能減少誘發(fā)乳腺癌，各種腫瘤、廣大癌癥在雌性 潛伏（ ， 2002） 。 白藜蘆醇 抑制核因子 活化的確切機(jī)制仍然不清楚。 2000)的研究確定， 白藜蘆醇 能夠抑制腫瘤壞死因子 的活化，是通過(guò)防止磷酸化和， 2000）。通過(guò)阻斷核因子 活性， 白藜蘆醇 也表現(xiàn)出對(duì)核因子 活性的阻斷（ ， 2000） 。 第一章 綜述 5 以結(jié)合無(wú)活性的 。在激活時(shí)， B， 并降解它，從而容許 核因子 遷移到核。 白藜蘆醇 抑制上游的一個(gè)信號(hào)成分（ ， 2000） 。 藜蘆醇合酶 藜蘆醇合酶 的酶學(xué)性質(zhì) C 被稱(chēng)為 3,5,4 是芪合酶 (稱(chēng) 的一類(lèi)。 et 995),分子量為 90 000 等電點(diǎn)為 984;991)。芪合酶（ 芪類(lèi)物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶，這類(lèi)酶催化合成其它酶作用底物的骨干分子。蛋白質(zhì)交叉結(jié)合和定點(diǎn)突變分析證明 ,58個(gè)氨基酸殘基 ,接近于酶的活性位點(diǎn) 個(gè)亞單位均可進(jìn)行三步縮合反應(yīng) ,同時(shí)異源二聚物的亞單位缺失補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)證明 ,兩個(gè)亞單位在產(chǎn)物形成過(guò)程中是協(xié)同合作的 ,但還不能確定這種協(xié)同作用是發(fā)生在酶 et 995;991)。 984 ）。 992)利用定點(diǎn)突變技術(shù)研究了酶活性位點(diǎn)半胱氨酸 將 果酶對(duì)受試三種底物的活性均喪失 ,而藜蘆醇合酶 對(duì) 4的活性 ,動(dòng)力學(xué)分析證明其與對(duì)照相比 倍 ,從而使得該酶從 白藜蘆醇 形成型轉(zhuǎn)化為二氫赤松素形成型。2001)改變 白藜蘆醇合酶 的底物，研究了 白藜蘆醇合酶 合成其他新型聚酮化合物的能力 ,結(jié)果顯示很微小的化學(xué)修飾就可引導(dǎo) 白藜蘆醇合酶 催化反應(yīng)形成一系列不同的新產(chǎn)物。 藜蘆醇合酶 與查爾酮合 酶 白藜蘆醇合酶 和 查爾酮合酶 是植物體中 白藜蘆醇合酶 和 查爾酮合酶 的序列比較分析顯示兩種基因是相互關(guān)聯(lián)的但不是完全相同，兩者在 蛋白質(zhì)水平是高度同源的