【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）農(nóng)桿菌介導(dǎo)豬瘟囊膜糖蛋白基因E2轉(zhuǎn)化馬鈴薯的研究生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)位論文

密級(jí) 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩士學(xué)位論文 農(nóng)桿菌介導(dǎo)豬瘟囊膜糖蛋白基因 化馬鈴薯的研究 of 2 s of 2 I 摘 要 豬瘟是對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害嚴(yán)重的一種 A 類傳染病，其致病源是豬瘟病毒（ 膜糖蛋白是 主要保護(hù)抗原蛋白，應(yīng)用真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá) 白免疫動(dòng)物，對(duì)強(qiáng)毒的攻擊有很好的保護(hù)作用。 實(shí)驗(yàn)將馬鈴薯莖塊特異表達(dá)啟動(dòng)子 動(dòng)子與豬瘟病毒囊膜糖蛋白基因 接起來(lái)，并克隆到植物核 轉(zhuǎn)化載體 ，構(gòu)建豬瘟病毒 因的馬鈴薯特異表達(dá)載體 載體含有：抗性基因（ , 莖塊特異表達(dá)啟動(dòng)子（ 及目的基因（豬瘟病毒囊膜糖蛋白基因 將帶有目的基因的載體質(zhì)粒 入農(nóng)桿菌，用其浸染馬鈴薯葉片，誘導(dǎo)再生后，獲得抗 生植株。 測(cè)， 交結(jié)果表明外源基因已經(jīng)整合到再生植株基因組中。 關(guān)鍵詞：豬瘟囊膜糖蛋白基因 動(dòng)子，轉(zhuǎn)化，馬鈴薯 is a to is is 2. by 2 2 by is to as 2 . 2 on on 2 of 2 錄 第一部分 文獻(xiàn)綜述 1 瘟病毒及其疫苗簡(jiǎn)介 1 用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)口服疫苗的研究概述 4 第二部分 論文的設(shè)計(jì)思 路及實(shí)驗(yàn)方案 15 義及研究現(xiàn)狀 15 16 術(shù)路線 17 第三部分 研究報(bào)告 18 瘟病毒 因表達(dá)載體的構(gòu)建及序列分析 18 料和方法 18 果與分析 22 論 26 鈴薯的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化馬鈴薯植株的獲得 27 料與方法 27 果與分析 35 論 38 結(jié)論 39 參考文獻(xiàn) 40中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一部分文獻(xiàn)綜述 1 第一部分 文獻(xiàn)綜述 瘟及其病毒與疫苗的簡(jiǎn)介 豬瘟是熱性全身性敗血性傳染病，以很強(qiáng)的傳染性和高致死率為特征。病程從急性到慢性多種多樣。該病給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重危害，國(guó)際獸疫局把它列為 A 類疫病。全世界每年由此造成的經(jīng)濟(jì)損失以億計(jì)數(shù)。 豬瘟在歐洲稱為古典豬瘟， 1885 年， 將病原認(rèn)為是霍亂沙門(mén)氏菌，所以又稱豬瘟霍亂，其名沿用至今。豬瘟病毒 (稱 屬黃病毒科 (病毒屬 (是世界上損害養(yǎng)豬業(yè)的重要病原之一，豬瘟病毒粒子呈球形，直徑為 40 60脂雙層囊膜，囊膜表面有囊膜糖蛋白突起。在蔗糖中的浮力密度為 降系數(shù) 50。不能凝集雞、豚鼠、豬、牛和人的紅細(xì)胞。其核衣殼由單獨(dú)衣殼蛋白組成，超薄切片中呈六角形，可能具有 20 面體對(duì)稱性（王寧等，1999）。 疫苗接種是控 制豬瘟病毒病發(fā)生的主要手段， 我國(guó)早在 60年代就研制成功了享譽(yù)世界的豬瘟兔化弱毒疫苗，在我國(guó)和其它以防治為主的國(guó)家的 而，近年來(lái) 遍出現(xiàn)免疫失敗的現(xiàn)象，因此，根除 隨著豬瘟流行病學(xué)、分子生物學(xué)及分子免疫學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展，豬瘟病毒基因工程疫苗研究的前景誘人。 瘟病毒的分子生物學(xué) 病毒的性質(zhì)和特征： 小的有包膜的 毒，核衣殼為非螺旋的二十面對(duì)稱結(jié)構(gòu)，直徑 4060因組為一單股正鏈線狀 有感染性，沉降系數(shù) 40 50s，分子量 4 106U，長(zhǎng)度 5非編碼區(qū)（ 5,一個(gè)開(kāi)放閱讀框（ 3非編碼區(qū)（ 3成。且 5端無(wú)帽子結(jié)構(gòu)， 3端無(wú) )尾巴（張靖飛， 2002）。 因組編碼蛋白的結(jié)構(gòu)與功能： 因組含有一個(gè) 個(gè)編碼含 3898 個(gè)氨基酸，分子量約 438多聚前體蛋白，此前體蛋白進(jìn)一步在病毒和宿主細(xì)胞蛋白酶的作用下被加工成 衣殼的核心蛋白 C，3 種囊膜糖蛋白 此外，還包括 3 5 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白 編碼順序見(jiàn)圖 1， 被加工成 除 C， 們均由 結(jié)構(gòu)蛋白中，最具有免疫防制研究?jī)r(jià)值的是 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一部分文獻(xiàn)綜述 2 5373 11694898 |243 結(jié)構(gòu)區(qū) | 非結(jié)構(gòu)區(qū) 1 因組示意圖 子量約 23結(jié)構(gòu)上與木瓜樣胱氨酸蛋白酶類似。 聚蛋白的成熟過(guò)程中催化它自身同核衣殼 C 蛋白的分離 ， 而與 游蛋白質(zhì)的成熟可能有關(guān)。 C 蛋白 N 端為 C 端為 由 99 個(gè)氨基酸組成 ， 是 衣殼蛋白。 N 末端為 C 末端為 由 227 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，其糖基化程度很高，九個(gè)可能的糖基化位點(diǎn)均被糖基化，糖基化前后的分子量分別為 44 48誘導(dǎo)產(chǎn)生中和譜很窄的中和抗體。 有疏水的膜錨定結(jié)構(gòu) (其在由細(xì)胞以出芽或胞吐方式分泌的病毒顆粒囊膜上并不穩(wěn)定，在細(xì)胞培養(yǎng) 毒的上清液中含有少量的病毒粒子，但卻含有大量被分泌出的 僅是一種結(jié)構(gòu)蛋 白，而且也是一種功能性蛋白，它與 993)。 ）活性，與細(xì)胞外 和植物自我不適應(yīng)型 具有很高的同源性，可降解病毒和細(xì)胞的et 994)； 導(dǎo)致免疫抑制，引起動(dòng)物的淋巴和上皮細(xì)胞凋亡。 宿主嗜性也與 關(guān)，用 有效阻斷 易感動(dòng)物細(xì)胞的感染。這表明可能在 細(xì)胞的感染過(guò)程中起重要作用。 表現(xiàn)出神經(jīng)細(xì)胞毒性和抗凝集活性，由于 有 可分泌蛋 白。 染動(dòng)物后所產(chǎn)生的 白在其致病過(guò)程中起重要作用。 N 端為 690， C 端還未明確確定，但研究表明 C 端位于多聚前體蛋白的 1060氨基酸處，共編碼 370 個(gè)氨基酸殘基，含有 5 個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，分子量約為 53 552 參與病毒對(duì)細(xì)胞的感染過(guò)程，攜帶有能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)免疫的抗原決定簇（ et 993）。 因編碼的 白是豬瘟的主要保護(hù)性抗原，其空間構(gòu)型由三個(gè)疏水區(qū)和三個(gè) 近 C 端的疏水區(qū)為 856 位半胱氨酸（ 后的第 6個(gè)氨基酸至 C 端 間形成有彈性的 螺旋結(jié)構(gòu)，沒(méi)有抗原決定簇。從 N 端 693 位至 856位 間形成富含抗原決定簇的兩個(gè)抗原結(jié)構(gòu)域，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域由位于 737 和 792 位 間的一段 片層結(jié)構(gòu)隔開(kāi)。 693 和 737 位 成二硫鍵并組成一個(gè)序列非保守性抗原結(jié)構(gòu)域，具有中和性的 B、 C 抗原區(qū)位于該結(jié)構(gòu)域中，另一個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)傩蛄斜Ｊ匦裕?792 和 856 位 含中和抗原區(qū) A 和非中和抗原區(qū) D， A 和 D 區(qū)由其間的一個(gè)疏水區(qū)和818 位、 828 位 成的二硫鍵分開(kāi) (et 990)。在 A、 B、 C 三個(gè)中和區(qū)中，各有一段與中和性密切相關(guān)的高頻突變序列或位點(diǎn)。這些序列或位點(diǎn)的突變株將逃脫中和性單抗的中和作用，免疫血清對(duì)這類突變株的中和作用也會(huì)降低。在全部的 構(gòu)蛋白中， 起的8 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一部分文獻(xiàn)綜述 3 抗體中和效力最強(qiáng)，但由于 同的 隆所編碼的 所差別，且 抗原性也隨適應(yīng)性而發(fā)生突變，給 應(yīng)用帶來(lái)了一定的困難。近幾年關(guān)于 基因工程苗取得了一定的進(jìn)展。 白（ 分子量為 三個(gè)糖基化位點(diǎn)，修飾后分子量為 33 C 端有疏水氨基酸 殘基的伸展結(jié)構(gòu)，第一個(gè)從 二個(gè)從 作為跨膜結(jié)構(gòu)蛋白中分子量最小的一種，一般認(rèn)為 包埋于病毒的囊膜中，不能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。在 染細(xì)胞的提取物中， 與 異源二聚體的形式免疫共沉淀（ 1993）。由于 能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體， 所以目前關(guān)于 研究還比較少。 瘟疫苗的研究 基因工程亞單位疫苗 利用真核細(xì)胞高效表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)豬瘟病毒免疫原蛋白，并以此表達(dá)產(chǎn)物為抗原可制造疫苗。桿狀病毒 胞系統(tǒng)可高水平表達(dá)外源蛋白，昆蟲(chóng)細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)的加工和運(yùn)轉(zhuǎn)過(guò)程與哺乳動(dòng)物類似，所表達(dá)的蛋白“ 仿真”程度較高。有人將豬瘟病毒 因 組入核型多角體病毒（ 并在 獲得純化的 白， 用 20 100抵抗 100誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體水平遠(yuǎn)高于由弱毒疫苗產(chǎn)生的水平（ 余興龍， 2000） 。 病毒活載體疫苗 以無(wú)致病力或低毒力的痘苗病毒（ 偽狂犬病病毒（ 載體，將豬瘟病毒 疫動(dòng)物后可 對(duì)兩種病毒產(chǎn)生良好的保護(hù)力。 等將編碼 到 有 基因）、 有 0 缺失大部分 因）。用 抗體，并可完全抵抗 種的豬，在 天有發(fā)燒癥狀，但隨后 2天則完全康復(fù)；而用 明 亞單位疫苗，而核心蛋白 用 達(dá)了 白，篩選獲得了 3 種重組病毒中 碼的 乏跨膜結(jié)構(gòu)域，用不含 因的 對(duì)照，免疫原性和保護(hù)力實(shí)驗(yàn)獲得了良好的結(jié)果，注射 性滴度較低，雖然抵抗了 致死性攻擊，但出現(xiàn)了病毒敗血癥和嚴(yán)重的疾??；而注射 清學(xué)檢驗(yàn)也為陰性。 對(duì)此類疫苗的安全性和實(shí)用價(jià)值目前還有爭(zhēng)議，因?yàn)槿祟愔两襁€不了解病毒的自然發(fā)生及 變異機(jī)制，也就無(wú)法控制這類“人造”病毒的未來(lái)走向，一旦將該病毒放入自然界中，將有可能衍變出對(duì)人、獸有危害的病毒變種。另一方面，偽狂犬病是較為普遍的一種疾病，豬瘟偽狂犬病重組疫苗對(duì)于已感染或已免疫的動(dòng)物不能產(chǎn)生保護(hù)力。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一部分文獻(xiàn)綜述 4 苗 苗是近年發(fā)現(xiàn)并形成的一種新的疫苗研究技術(shù)，已有許多用該技術(shù)將一些具有藥用價(jià)值的活性蛋白基因與載體重組，注射動(dòng)物后成功產(chǎn)生活性蛋白的例子（ 陳創(chuàng)夫， 2001） 。以配有原核復(fù)制元件和真核表達(dá)調(diào)控元件的質(zhì)粒為 載體，將免疫原基因插入該質(zhì)粒中，用裸 保證 該重組子在注射動(dòng)物后不會(huì)發(fā)生散播，即不具有傳染性的同時(shí)，該重組子在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率及在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平將影響該疫苗的免疫效 力 (P 2002)。由于該重組子可通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)方式大量制備，又具有相對(duì)較好的穩(wěn)定性，并且大容量的質(zhì)粒還可同時(shí)容納多種病毒的免疫原基因，因此，這項(xiàng)制疫苗技術(shù)具有很大的研究?jī)r(jià)值。 記疫苗 標(biāo)記疫苗是在分子水平上，將具有選擇性標(biāo)記的基因，克隆到致弱病毒全長(zhǎng) ，免疫動(dòng)物經(jīng)測(cè)定，可以區(qū)分抗體來(lái)自于自然感染還是標(biāo)記基因疫苗，從而斷定動(dòng)物的發(fā)病情況。 株 后構(gòu)建重組體進(jìn)行表達(dá)，將表達(dá)的 樣改造后并確知其抗原性質(zhì)的 產(chǎn)生的抗體就可以用簡(jiǎn)單的血清學(xué)方法與野毒感染產(chǎn)生的抗體加以區(qū)別。 用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)口服疫苗的研究概述 隨著轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)的日益成熟，植物體正成為具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的藥用蛋白，抗體和疫苗的生物反應(yīng)器。科學(xué)家將激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)的病原體基因分離出來(lái)，重組到植物體中，生產(chǎn)出能夠使人體獲得特異抗病能力的食用疫苗，并使其基因產(chǎn)物在植物的食用部位表達(dá)積累，人們通過(guò)吃轉(zhuǎn)基因水果或某種食品 就可以獲得抗原蛋白，從而產(chǎn)生抗體達(dá)到預(yù)防疾病的目的 （曲志才等 2002） 。 點(diǎn) 植物作為生產(chǎn)藥用蛋白的生物反應(yīng)器，為人類和動(dòng)物提供了一個(gè)更加安全和廉價(jià)的生產(chǎn)體系，與微生物發(fā)酵，動(dòng)物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等生產(chǎn)系統(tǒng)相比，它具有許多潛在的優(yōu)勢(shì)（任志強(qiáng)等 2003）：（ 1）成本低廉，不需要復(fù)雜的醫(yī)療設(shè)備；使用方便，可供人直接服用或飼喂動(dòng)物，易于推廣。（ 2）植物具有完整的真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，能準(zhǔn)確地進(jìn)行翻譯后加工。（ 3）無(wú)需象傳統(tǒng)方法（如發(fā)酵法）生產(chǎn)疫苗那樣進(jìn)行提取純化，可直接食用免疫。（ 4）比傳統(tǒng)的免疫途徑更有效，植物細(xì)胞中的疫苗抗原通過(guò)胃內(nèi)的酸性環(huán)境時(shí)可受到細(xì)胞壁的保護(hù)，直接到達(dá)腸內(nèi)黏膜誘導(dǎo)部位，刺激黏膜和全身免疫反應(yīng)。（ 5）安全性好，不需要注射器和針頭之類的設(shè)備。（ 6）大范圍給藥，可用于人，家畜和野生食草動(dòng)物等。（ 7）易于貯存和分發(fā)，不 需要冷藏設(shè)備。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一部分文獻(xiàn)綜述 5 服疫苗的免疫作用機(jī)制 動(dòng)物及人體的呼吸道、消化道及生殖道黏膜與病原體接觸后會(huì)引起機(jī)體的黏膜免疫反應(yīng)，在黏膜的微環(huán)境中產(chǎn)生分泌型 體和特異的免疫淋巴細(xì)胞，從而構(gòu)成機(jī)體防御病原體感染的第一道屏障?？诜呙缇褪且晕改c道黏膜為接種免疫部位，從而使 機(jī)體在胃腸道黏膜產(chǎn)生局部免疫應(yīng)答進(jìn)而獲得全身性的免疫保護(hù) (et 1999)。 現(xiàn)在研究表明，哺乳動(dòng)物腸道黏膜表皮細(xì)胞及腸相關(guān)淋巴樣組織（ 但構(gòu)成了抵御病原體感染的保護(hù)屏障，而且還是口服疫苗抗原吸收的有效通道 ( 998)。 道黏膜表層的集合淋巴小結(jié)（派伊兒結(jié)， s 小的孤立淋巴結(jié)組成， s 小結(jié)內(nèi)含豐富的淋巴細(xì)胞和高度內(nèi)陷的腸上皮細(xì)胞（ M 細(xì)胞）。病原體首先被 s 小結(jié)內(nèi)的M 細(xì)胞攝取、消化，然后轉(zhuǎn)交 給下層的抗原遞呈細(xì)胞 (包括巨噬細(xì)胞（ 樹(shù)突狀細(xì)胞（ 抗原遞呈細(xì)胞表面有識(shí)別特異抗原的結(jié)合受體（ 體等），如識(shí)別革蘭氏陰性菌脂多糖（ 體，識(shí)別細(xì)菌 元的 體 (et 2000)?？乖f呈細(xì)胞獲取抗原后，遷移至淋巴小結(jié)（ 行抗原的加工和遞呈，同時(shí)伴隨著多種免疫調(diào)控因子 (表達(dá)，包括白介素 1 和 12，腫瘤壞死因子 、主要組織相容性復(fù)合物 （ ）等。 淋巴組織中成熟的 胞在抗原遞呈細(xì)胞表面的抗原決定簇 - 復(fù)合物以及免疫調(diào)控因子的共同作用下發(fā)生活化，協(xié)助 B 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生中和抗體以及進(jìn)一步激活巨噬細(xì)胞殺滅病原微生物。一部分被激活的 B 淋巴細(xì)胞遷移到腸系膜的淋巴結(jié)內(nèi)發(fā)育為漿細(xì)胞 (接著遷移到黏膜層分泌聚合免疫球蛋白 聚合免疫球蛋白 越消化道黏膜表皮層伸入內(nèi)腔，裂解為分泌型 夠 抵御消化道內(nèi)蛋白酶的水解，并與特異的抗原表位結(jié)合從而中和侵入的病原體。 機(jī)體中最豐富的免疫球蛋白，在防止呼吸道和消化道感染方面具有重要的作用 (et 1999)（ 如圖 2所示）。 口服疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的抗體主要是 體液中的 會(huì)隨之產(chǎn)生。要參與機(jī)體的體液免疫保護(hù)，但其對(duì)防止病原體黏膜感染也是有效的，另外 是反芻類動(dòng)物黏膜分泌液中的主要免疫球蛋白。現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)黏膜表皮細(xì)胞能夠表達(dá) 和型 組織相容性復(fù)合物（ ），這樣可直接把 病原體抗原遞呈給 T 胞，進(jìn)而激活了機(jī)體的 B 淋巴細(xì)胞和細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞反應(yīng)（ (et 1998)。 因此機(jī)體的消化道黏膜組織可成為免疫佐劑和疫苗運(yùn)送系統(tǒng)的作用目標(biāo)。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一部分文獻(xiàn)綜述 6 圖 2 病源體誘導(dǎo)機(jī)體消化道黏膜免疫反應(yīng)示意圖 消化道內(nèi)的病原體被 s 小結(jié)內(nèi)的 M 細(xì)胞攝取，交給淋巴小結(jié) (的抗原遞呈細(xì)胞加工，然后激活 T 胞。 B 淋巴細(xì)胞在 T 胞和細(xì)胞因子作用下活化，發(fā)育為漿細(xì)胞 (接著遷移到黏膜層分泌聚合 越黏膜表皮層，裂解為分泌型 (圖片引用 002) of in s to in of is to is as (002) 服疫苗免疫與機(jī)體免疫系統(tǒng)的關(guān)系 機(jī)體的黏膜免疫是一個(gè)相互作用的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，疫苗口服后，先激活腸道黏膜免疫細(xì)胞，隨后在呼吸道、生殖道、乳汁、唾液中也會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性分泌免疫球蛋白 (例如口服免疫接種活性衣原體疫苗，在機(jī)體的生殖道、呼吸道及腸道中都發(fā)現(xiàn)了特異的 體，類似的結(jié)果還出現(xiàn)在小鼠口服免疫假單孢桿菌的實(shí)驗(yàn)中。這表明口服免疫某種疫苗后，若機(jī)體的黏膜表面再暴露接種該疫苗抗原可能會(huì)誘發(fā)更加強(qiáng)烈的免疫反應(yīng) (et 1994)。 最近研究人員對(duì)于黏膜和肌肉注射聯(lián)合免疫接 種進(jìn)行了研究。例如比較巴基斯坦和瑞典婦女肌肉注射霍亂疫苗后發(fā)現(xiàn)，原先消化道黏膜感染過(guò)霍亂的巴基斯坦婦女的乳汁和唾液中的特異 體滴度有顯著的提高，而沒(méi)有感染過(guò)霍亂的瑞典婦女在其黏膜分泌物中則沒(méi)有高水平中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一部分文獻(xiàn)綜述 7 的 體滴度。其它的研究也表明口服免疫會(huì)對(duì)之后的注射免疫效果有積極的影響 (et 2001)。從另一方面來(lái)看，消化道黏膜免疫系統(tǒng)對(duì)食物性抗原具有免疫耐受性，這種免疫耐受性能夠防止機(jī)體對(duì)腸道內(nèi)的共生菌及食物蛋白產(chǎn)生免疫反應(yīng) (et 1998)。抗原的免疫耐受與 抗原的劑量、免疫時(shí)間周期及抗原特異性都有密切的關(guān)系。如果機(jī)體在恰當(dāng)?shù)臅r(shí)間段內(nèi)，多次攝入口服疫苗，那么再注射接種該疫苗時(shí)，機(jī)體對(duì)該抗原的免疫反應(yīng)會(huì)比較遲鈍（免疫耐受）。因此機(jī)體攝入的口服疫苗是能夠強(qiáng)化系統(tǒng)免疫應(yīng)答還是誘導(dǎo)其產(chǎn)生免疫耐受，應(yīng)對(duì)其作進(jìn)一步的免疫評(píng)估。 物轉(zhuǎn)基因疫苗的產(chǎn)生步驟 利用植物生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因疫苗一般程序是 ： 1 克隆特異中和抗原的編碼基因； 2 構(gòu)建植物表達(dá)載體，把基因整合到植物表達(dá)載體上，或利用重組病毒作為載體； 3 利用各種轉(zhuǎn)基因方法，將抗原基因轉(zhuǎn)入植物體使植物帶有編碼抗原的基因； 4 進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)和分化及轉(zhuǎn)基因植物的再生，使抗原蛋白基因在植物中表達(dá)； 5 進(jìn)行表達(dá)水平的檢測(cè)和免疫原性的測(cè)定； 6 進(jìn)行食品安全性評(píng)價(jià)，檢測(cè)。 常用的兩種轉(zhuǎn)基因策略 ： 一種途徑是用重組病毒感染植株，使其在復(fù)制時(shí)將轉(zhuǎn)移基因表達(dá)于宿主植物，最常用的兩個(gè)宿主：病毒系統(tǒng)是煙草 煙草花葉病毒草（ 統(tǒng)和豇豆豇豆花葉病毒（ 統(tǒng)。 另一種途徑是將抗原基因構(gòu)建在植物表達(dá)載體上，利用農(nóng)桿菌或基因槍介導(dǎo)的方法，將抗原基因轉(zhuǎn)化到植物系細(xì)胞中并與基因組整合，獲得穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株（ 朱國(guó)萍等 2002）。 核轉(zhuǎn)化植物 植物病毒載體 外源基因的表達(dá)方式 穩(wěn)定表達(dá) 瞬時(shí)表達(dá) 外源基因的整合位置 穩(wěn)定整合入植物基因組 穩(wěn)定整合入病毒基因組 重組抗原的合成位置 在植物細(xì)胞核內(nèi)表達(dá) 隨著病毒的復(fù)制在植物細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá) 子代的遺傳情況 遺傳給子代 不遺傳給子代 宿主植物的范圍 限于單一的轉(zhuǎn)基因植物 可用于對(duì)病毒易感的所有植物 表達(dá)周期 1 1 擴(kuò)繁周期 1 年 1 生產(chǎn)成本 高 低 表 1. 兩種植物表達(dá)載體的比較 of 國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一部分文獻(xiàn)綜述 8 桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化機(jī)制 在近幾年來(lái)，農(nóng)桿菌一直是世界各國(guó)科學(xué)家研究的熱點(diǎn)，與植物基因轉(zhuǎn)化有關(guān)的農(nóng)桿菌有兩種類型：一種為根癌農(nóng)桿菌，它含有 粒，能誘導(dǎo)被浸染的植物形成腫瘤，即誘發(fā)產(chǎn)生冠癭瘤，另一種為發(fā)根農(nóng)桿菌，它含有 粒，能誘導(dǎo)被浸染的植物細(xì)胞產(chǎn)生毛發(fā)狀根，形成 莖癭瘤（王丹， 2002）。 粒上有一段轉(zhuǎn)移 農(nóng)桿菌浸染植物時(shí)，這段 以插入到植物基因組中，使其攜帶的基因在植物中得以表達(dá)。 轉(zhuǎn)移是指 粒上的轉(zhuǎn)移 加工 ，切割，復(fù)制，越過(guò)細(xì)菌膜以及植物細(xì)胞并整合到植物基因組的全過(guò)程，植物基因轉(zhuǎn)化必須有 因即毒性區(qū)兩部分的參與。 邊界序列和 域是 轉(zhuǎn)移和整合進(jìn)植物所不可缺少的，有的農(nóng)桿菌如胭脂堿型農(nóng)桿菌系的 粒上為單一的有左或右各一個(gè)邊界序列，而在章魚(yú)堿型的 則有四個(gè)邊界序列，其中一個(gè) 24超驅(qū)動(dòng)序列起增強(qiáng)子的作用。 粒的 大小為 30 B， C， D， E，G， H 等 7 個(gè)操縱子一共有 24 個(gè)基因共同控制著 加工和轉(zhuǎn) 移，他們總稱為調(diào)控子。白被激活后與各 因 5， 端非轉(zhuǎn)錄區(qū)的“毒性盒”序列相結(jié)合，啟動(dòng)各毒性區(qū)的轉(zhuǎn)錄，組成 合物向植物轉(zhuǎn)移的膜通道，以類似于細(xì)菌轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的方式到達(dá)植物細(xì)胞內(nèi)，并向植物核運(yùn)動(dòng)。 由于 因在植物基因轉(zhuǎn)化中起細(xì)菌膜以及進(jìn)入植物細(xì)胞并跨入核內(nèi)起不可缺少的作用。因此，在建立載體時(shí)必須含有完整的 因。此外，該載體含有 邊界序列，而且這個(gè)質(zhì)粒還能在大腸桿菌和農(nóng)桿菌之間進(jìn)行穿梭。目前，在植物基因轉(zhuǎn)化中應(yīng)用最多的是 粒載體系統(tǒng)，其中雙元載體系統(tǒng)最常見(jiàn)，該 載體在一個(gè)農(nóng)桿菌株系中含有兩個(gè)彼此分離的質(zhì)粒，一個(gè)質(zhì)粒含有 外源基因重組的多功能克隆重組載體質(zhì)粒。該質(zhì)粒均能在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中進(jìn)行復(fù)制，并能以大腸桿菌中遷移到土壤農(nóng)桿菌中，另一個(gè)質(zhì)粒是含有 因的 目的基因在連接酶作用下與雙元載體連接后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，大量增殖后，分離，純化并遷移到根癌農(nóng)桿菌中，然后在含有抗生素的選擇培養(yǎng)基上與相應(yīng)的植物細(xì)胞（待轉(zhuǎn)化的植物宿主）共同培養(yǎng)，在癌農(nóng)桿菌（含帶有目的基因的雙元載體）介導(dǎo)下，目的基因整合到植物細(xì)胞核染色體中，并隨同植物的遺傳而獲得穩(wěn)定 的遺傳性狀。 物轉(zhuǎn)基因口服疫苗的發(fā)展現(xiàn)狀和展望 于 1992 年首次報(bào)道用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)疫苗（乙肝表面抗原）。此后有 于 1998 年利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)口服霍亂毒素 B 亞單位疫苗 :在 1998 年應(yīng)用轉(zhuǎn)基因表達(dá)傳染性胃腸炎冠狀病毒的免疫球蛋白的多肽； 在 1995 年也成功表達(dá)了口服用大腸桿菌耐熱腸毒素（ 在 1996 年在煙草和馬鈴薯中表達(dá)了 毒衣殼蛋白；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一部分文獻(xiàn)綜述 9 1995 年等在番茄中表達(dá)了狂犬病病毒糖蛋白； 于 1995 年表達(dá)的流感病毒血凝素和艾滋病病毒抗原； 于 1998 年表達(dá)了犬細(xì)小病毒抗原（ 表達(dá)了水貂腸炎病毒抗原（ 目前已報(bào)道可作為口服疫苗的僅有： 乙肝口服疫苗， 的狂犬病毒糖蛋白， 的 構(gòu)蛋白。 大腸桿菌口服疫苗 美國(guó)植物病理學(xué)家 從 1992 年開(kāi)始著手對(duì)大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素 B 亞基（ 植物中的表達(dá)進(jìn) 行研究，他們將編碼大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素B 亞基（ 結(jié)構(gòu)基因通過(guò)根癌農(nóng)桿菌的介導(dǎo)，完成了對(duì)煙草和馬鈴薯的轉(zhuǎn)化，用 原，同時(shí)用 記試驗(yàn)在煙草葉片的提取物中也檢測(cè)出了 原。每次用 5 克馬鈴薯塊莖或其提取液飼喂小鼠，每周 3 次，連續(xù)一個(gè)月后，其血清和糞便中分別檢測(cè)出了特異性的 疫攻毒試驗(yàn)表明，飼喂了該轉(zhuǎn)化植物的鼠可抵抗大腸桿菌的攻擊。同時(shí)，將 基基因在香蕉中進(jìn)行表達(dá)，可通過(guò)食用香蕉而獲得對(duì)大腸桿菌的保護(hù)作用 。同樣，美國(guó) 究所的細(xì)胞生物學(xué)家 在田間精心培育出能預(yù)防由與 構(gòu)和功能相似的霍亂毒素（ 起霍亂的苜蓿，他利用土壤農(nóng)桿菌把霍亂毒素的無(wú)毒性 鏈將其培育成秧苗，食用這種苜蓿后，其中的霍亂毒素 鏈將很快被位于咽喉，胃腸等部位分泌性粘液細(xì)胞所攝入，刺激特異性抗體的大量產(chǎn)生，這樣今后僅需攝食這種苜蓿就可獲得對(duì)致命性霍亂的免疫。 毒衣殼蛋白煙草及馬鈴薯口服疫苗 美國(guó)生物學(xué)家 于 1996 年用轉(zhuǎn)基因煙草和馬鈴薯植物表達(dá) 毒衣殼蛋白，該 蛋白可從轉(zhuǎn)基因煙草抽提出以 38毒樣粒子形式存在。這種 毒樣粒子的重組體（ 源于桿狀病毒重組體，這種植物表達(dá)的 行口服免疫小鼠。如用飼法（強(qiáng)制喂食，由管灌入胃內(nèi)）飼養(yǎng)煙草葉抽體物，該鼠血清 體和分泌型 體，如用表達(dá)馬鈴薯莖塊直接喂養(yǎng)小鼠，可產(chǎn)生特異性的全身性抗體 此該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證明可通過(guò)口服同樣可產(chǎn)生全身性抗體反應(yīng)。 白苜蓿口服疫苗 1999 年在病毒學(xué)雜志發(fā)表了苜蓿轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)的 構(gòu)蛋白在鼠體內(nèi)的保護(hù)性抗體反應(yīng)的研究報(bào)告，該學(xué)者將 因克隆至雙元載體中，在根癌農(nóng)桿菌的介導(dǎo)下，轉(zhuǎn)化到苜蓿植物中，用葉抽提物經(jīng)腸道外途徑或用新鮮采集的轉(zhuǎn)基因植物葉飼喂老鼠均可產(chǎn)生的特異抗體均可與 氨基酸決定簇的人工合成多肽 構(gòu)蛋白以及整個(gè) 子起反應(yīng)。 表 2 列舉了近十年植物性來(lái)源疫苗的研究情況。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一部分文獻(xiàn)綜述 10 年份 免疫性抗原 轉(zhuǎn)化植物 表達(dá)水平 疫苗的免疫原性 及保護(hù)能力 參考文獻(xiàn) 1990 鏈球菌表面蛋白抗 原 煙草 ( 990) 1992 乙肝表面抗原 煙草 射后產(chǎn)生免疫 反應(yīng) (et 1992) 1995 狂犬病毒糖蛋白 番茄 (et 1995) 1995 大腸桿菌熱不穩(wěn)定 內(nèi)毒素 煙草 馬鈴薯 服后產(chǎn)生免疫 反應(yīng)和保護(hù) (et 1995) 1996 諾沃克 (毒衣殼蛋白 煙草 馬鈴薯 服后產(chǎn)生免疫應(yīng)答 (et 1996) 1997 乙肝病毒表面抗原 馬鈴薯 服后產(chǎn)生免疫反應(yīng) (et 1997) 1998 大腸桿菌熱不穩(wěn)定 內(nèi)毒素蛋白 馬鈴薯 服后產(chǎn)生免疫 反應(yīng)和保護(hù) (et 1998; et 1998) 1998 霍亂毒素 B 亞基 馬鈴薯 服后產(chǎn)生免疫反應(yīng)和保護(hù)作用 (et 1998 a) 1998 人胰島素與霍亂病毒 B 亞基融合蛋白 馬鈴薯 服后產(chǎn)生免疫 反應(yīng) (et b ) 1999 乙肝病毒表面抗原 生菜 羽扇豆 服后產(chǎn)生免疫 反應(yīng) (et 1999) 1999 人巨細(xì)胞病毒糖蛋 白 B 煙草 (et 1999) 1999 口蹄疫病毒 白 紫花苜蓿 口服和注射都產(chǎn)生免疫反應(yīng)和保護(hù) (et a) 2000 呼吸道合胞體病毒 F 蛋 白 蕃茄 10ug/g 果實(shí)鮮重 口服后產(chǎn)生免疫 反應(yīng) (et 2000) 2000 豬可傳染性腸胃炎病毒 S 蛋白 紫花苜蓿 射接種產(chǎn)生免疫反應(yīng) (et 2000) 注： 表可溶性總蛋白。 表組織鮮重 表 2. 植物性來(lái)源疫苗的種類 . in 國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一部分文獻(xiàn)綜述 11 以上轉(zhuǎn)基因植物疫苗經(jīng)口服后可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生全身性保護(hù)性抗體反應(yīng)。這種利用植物作為生產(chǎn)疫苗的生物反應(yīng)器， 于微生物發(fā)酵，動(dòng)物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等生產(chǎn)系統(tǒng)相比，具有許多潛在的優(yōu)勢(shì)。如微生物系統(tǒng)不能對(duì)真核生物蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確的翻譯后加工和蛋白糖基化；細(xì)菌在發(fā)酵過(guò)程中常產(chǎn)生一些不溶性聚合物，而將這些聚合物重新溶解并折疊成天然蛋白質(zhì)，需要高的成本；動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)所需要培養(yǎng)基相當(dāng)昂貴；轉(zhuǎn)基因動(dòng)物則受倫理關(guān)注。利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)口服疫苗可避免或至少減免部分純化過(guò)程，這樣就降低了生產(chǎn)成本，對(duì)負(fù)擔(dān)不起目前的一些昂貴的疫苗發(fā)展中國(guó)家，植物口服疫苗更加具有巨大的潛在市場(chǎng)的誘人前景。但是，依目前的研究成果來(lái)看，應(yīng)用植物表達(dá)的口服疫苗其產(chǎn)量低 下，難以獲得高水平的表達(dá)，當(dāng)然在今后的研究中可通過(guò)：（ 1）適當(dāng)?shù)膯?dòng)子，增強(qiáng)子和前導(dǎo)序列的選擇（ 2）密碼子的優(yōu)化（ 3） 穩(wěn)定序列的去除（ 4）選用其它植物種（ 5）整合非依賴性表達(dá)（ 6）通過(guò)修飾外源蛋白基因?qū)⑵涠ò杏诩?xì)胞的不同空間（ 7）以及通過(guò)協(xié)同表達(dá)二硫鍵異構(gòu)酶或伴侶蛋白促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊，通過(guò)以上這些方法可嘗試提高蛋白產(chǎn)量。 轉(zhuǎn)基因口服疫苗植物遺傳性狀的評(píng)估 轉(zhuǎn)基因口服疫苗植物是否已獲得了穩(wěn)定的含外源蛋白基因的遺傳性狀，可通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)化植物中是否含有可表達(dá)的外源基因和該外源基因所表達(dá)的相應(yīng)產(chǎn)物來(lái)評(píng)估 。這些技術(shù)是分子生物和免疫學(xué)中最常用的技術(shù)。這些方法可在建立轉(zhuǎn)化中的外源基因是否存在和拷貝數(shù)的多少可應(yīng)用 交方法：在外源基因選擇相應(yīng)的植物宿主表達(dá)外源蛋白中，煙草植物因可產(chǎn)生大量外源蛋白而首先被采用，但由于煙草中含毒性堿純化后才能食用，故一般采用口感較好的香蕉和西紅柿來(lái)表達(dá)人用口服疫苗，而用一些如苜蓿，谷類植物，大豆等來(lái)表達(dá)動(dòng)物用口服疫苗。 在的問(wèn)題及未來(lái)研究的展望 目前看來(lái)，轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)水平通常低于可溶性總蛋白含量的 1%，這樣便削弱了植物載體生產(chǎn)醫(yī)用蛋白的市場(chǎng)應(yīng)用前 景。因此如何提高轉(zhuǎn)基因植物中目的蛋白的含量是今后研究的主要問(wèn)題。我們可以通過(guò)優(yōu)化基因的密碼子模式、選擇表達(dá)產(chǎn)物的細(xì)胞定位以及在植物特異組織中積累從而提高目的蛋白的表達(dá)量。 外源基因的優(yōu)化 植物利用密碼子的偏愛(ài)模式不同于動(dòng)物，因此選用植物優(yōu)先使用的密碼子可以增加外源基因的翻譯效率。例如 et (1998) 構(gòu)建了適合植物表達(dá)的合成基因，從而提高了大腸桿菌內(nèi)毒素 B 亞基在植物中的表達(dá)水平，利用合成基因會(huì)使該抗原在葉片和植物組織中的含量提高 3。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一部分文獻(xiàn)綜述 12 蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位 我們研究植物細(xì)胞內(nèi)蛋白 的定位機(jī)制也會(huì)有助于提高重組蛋白在植物中的表達(dá)水平。人們已經(jīng)觀察到當(dāng)重組抗體被分揀到細(xì)胞分泌途徑而不是定位在胞質(zhì)時(shí)，其表達(dá)量會(huì)顯著提高，若把蛋白定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)還會(huì)得到更高的表達(dá)量 ( 998)。如王新國(guó)等研究人員在轉(zhuǎn)基因煙草中，將霍亂毒素 B 亞基（ 因的 3 端引入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)引導(dǎo)序列 肽序列，從而大大提高了重組蛋白的含量 。 蛋白在植物種子和特異組織中的累積 早期表達(dá)重組蛋白的植物載體通常是常規(guī)的轉(zhuǎn)化植物，如煙草、馬鈴薯等。這些茄科植物雖然容易進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化，但是 其蛋白的含量比較低，并且還含有毒的次生性代謝物，所以作為重組蛋白的生產(chǎn)載體并不理想，而比較理想的植物載體應(yīng)含有豐富的可溶性蛋白，并且能夠長(zhǎng)期保存。農(nóng)作物的種子便具有上述的特點(diǎn)，特別是種子胚部分富含可溶性蛋白，并且種子蛋白比較容易分離純化，這樣便能夠濃縮重組抗原蛋白，可使其劑量化。例如在玉米中表達(dá)的大腸桿菌熱不穩(wěn)定內(nèi)毒素 B 亞基可食用疫苗，經(jīng)加工處理后利用玉米胚部分可制成 1 口服疫苗，并且提高了疫苗的口感和耐儲(chǔ)存能力 (et 2001)。馬鈴薯的塊莖也被用作儲(chǔ)存重組蛋白的場(chǎng) 所，例如 et (1996)將馬鈴薯塊莖特異啟動(dòng)子（ 動(dòng)子）驅(qū)動(dòng)諾沃克病毒衣殼蛋白（ 因的表達(dá)，結(jié)果在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯微塊莖中， 最高含量為可溶性蛋白量的 明顯高于外源基因在煙草葉片中的表達(dá)水平。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文