【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）亞洲棉短纖維發(fā)育突變體蛋白質(zhì)差異分析作物種質(zhì)資源學(xué)碩士論文

密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 亞洲 棉 短 纖維發(fā)育突變體蛋白質(zhì)差異分析 of of of of - I - 摘 要 棉纖維分化、發(fā)育的過程是其產(chǎn)量和品質(zhì)的形成過程，對該過程 的 研究有助于我們通過遺傳工程途徑人為控制棉纖維 的 生長發(fā)育 ，以 提高棉纖維 的 產(chǎn)量和品質(zhì)， 因此 具有重要的 應(yīng)用及 理論意義。而 蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行者，包含了多個維度的生物學(xué)信息，蛋白質(zhì)本身的復(fù)雜性使基因組 學(xué)不能準(zhǔn)確的預(yù)測其結(jié)構(gòu)和動力學(xué)，需要對細胞生長過程中蛋白質(zhì)的定位、結(jié)構(gòu)和功能進行直接的分析研究。 本研究利用兩種常見的植物蛋白質(zhì)提取方法 三氯乙酸 對提取效果進行了比較分析。我們發(fā)現(xiàn) 使用三氯乙酸 易使蛋白酶失活，潛在的蛋白種類更加豐富，但粗蛋白難以溶解，雜質(zhì)含量較高，不易獲得高濃度的蛋白質(zhì)溶液，產(chǎn)率較低。而 利用飽和酚 法獲得的蛋白質(zhì)溶液含量和純度高，操作簡單，同時獲得的蛋白質(zhì)種類相對于 三氯乙酸 電點分布更廣，因此更適宜于含干擾物質(zhì)較多的棉花胚珠蛋白 質(zhì)的提取。 利用飽和酚法對四倍體棉種和二倍體棉種進行了全蛋白的提取，通過 對 粗蛋白產(chǎn)率的 比較分析，我們 發(fā)現(xiàn)在相同發(fā)育時期兩棉種 總 蛋白含量 十分 接近， 而且含量 變化曲線 也非常 相似。 利用膠電泳 獲得的 圖譜 可知 ，除一些高豐度的組成型蛋白外，圖譜差異還是比較明顯，反映出了不同的遺傳背景，可以作為區(qū)分棉種的特征之一；由于 辨率的限制，棉纖維突變體和野生型中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的差異蛋白，對于蛋白質(zhì)組的分析無法提供足夠的信息。 通過一系列田間表型及農(nóng)藝性狀的比較分析，我們確定亞洲棉 其突變體 者在表型上非常的接近。除在 植株 色素的表達方面有所不同外，最大的差別體現(xiàn)在短纖維的有無。隨后我們利用體式顯微鏡、掃描電鏡及石蠟切片技術(shù)對不同時期胚珠表皮細胞進行了細微觀察分析，最終確定亞洲棉 纖維起始的時間在開花后五天左右。 我們通過蛋白提取 、 二維電泳凝膠圖譜的制備、蛋白點群的構(gòu)建、凝膠圖譜的評估，對開花后 5 天 花胚珠蛋白質(zhì)組進行了比較分析，經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)和人工觀測的篩選，共找到差異點 59 個，其中野生型包含特有點 5 個、優(yōu)勢點 14 個，突變體包含特有點 14 個、優(yōu)勢點 26 個。這些蛋白點是經(jīng)過了科學(xué)嚴(yán)格的篩選，穩(wěn)定可靠 、 重復(fù)性好，能夠真實的反映出野生型和突變體的差異。同時我們猜測，短絨的起始主要與一些負調(diào)控機制有關(guān)。 本實驗結(jié)果為我們進一步利用差異表 達 蛋白克隆功能基因，揭示 植物 細胞分化起始的復(fù)雜機制提供了依據(jù)。 關(guān)鍵詞： 棉纖維發(fā)育突變體 ， 表型 ， 蛋白質(zhì)組 ， 雙向 電泳 - he of of on us of by in is a of It is so we by of of of in is to be of of of by On us of I of in a a we as in We of by we of of of we as a to be of to of of we as of we of . by of 2of by we 9 in of 4 in of 4 of in 6 in be We to of to - of - 目 錄 第一章 引言 . 1 纖維分化起始的時間及空間順序 . 1 維分化起始的超顯微結(jié)構(gòu)分析 . 2 素對棉纖維分化的影響 . 3 纖維起始分化的分子生物學(xué)研究進展 . 4 維起始分化途徑 . 4 錄因子在棉纖維分化起始中的作用 . 6 與棉纖維起始分化的特異表達基因 . 7 花起始分化期高豐度轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 . 8 纖維分化起始研究展望 . 10 物蛋白質(zhì)組學(xué)的研究進展 . 10 白質(zhì)組學(xué)研究的歷史和背景 . 10 白質(zhì)組學(xué)在植物遺傳和育種研究中的應(yīng)用 . 11 研究的目的和意義 . 13 第二章 棉花胚珠蛋白三氯乙酸丙酮法與飽和酚提取法 的比較分析 . 14 料與方法 . 14 驗材料 . 14 白質(zhì)的提取 . 14 白的定量分析 . 14 果與分析 . 15 白產(chǎn)量、濃度及純度的比較 . 15 膠電泳分析 . 17 維電泳分析 . 17 結(jié)與討論 . 18 第三章 棉纖維發(fā)育突變體的蛋白質(zhì)含量變化測定及 膠電泳圖譜分析 . 20 料與方法 . 20 驗材料 . 20 蛋白的提取 . 21 花種子水溶性蛋白的提取 . 21 膠電泳 . 21 染 . 22 果與分析 . 23 纖維發(fā)育過程中蛋白質(zhì)含量的變化 . 23 膠電泳表達圖譜分析 . 24 結(jié)與討論 . 26 第四章 亞洲棉纖維突變體表型分析及短纖維起始時間 的確定 . 28 料與方法 . 28 試材料 . 28 - V - 驗方法 . 28 果與分析 . 30 間表型觀察 . 30 維品質(zhì)測定 . 31 珠形態(tài)學(xué)觀察 . 31 結(jié)與討論 . 34 第五章 棉纖維突變體胚珠全蛋白的提取及雙向電泳分 析 . 35 驗方法及步驟 . 35 花胚珠全蛋白的提?。柡头臃ǎ?. 35 向電泳 . 37 膠的固定、染色以及圖像采集 . 38 果 與分析 . 39 D 圖譜的制備 . 39 膠的匹配 . 41 白凝膠圖譜的評估 . 42 異蛋白的比對結(jié)果 . 48 結(jié)與討論 . 54 第六章 全文結(jié)論 . 56 參考文獻 . 59 附表一：差異蛋白點的 % . 64 致謝 . 66 作者簡介 . 67 - 英文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 開 花 后天數(shù) OD 吸收值 生型 突變體 氯乙酸 ,4硫蘇糖醇 丙烯酰胺凝膠電泳 二烷基硫酸鈉 A 烯酰胺 B N,叉丙烯酰胺 羥甲基氨基甲烷 ， N， N， N甲基乙二胺 2二維電泳 血清白蛋白 聚乙烯吡咯烷酮 代十六烷基三甲胺 氧核糖三磷酸 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 達序列標(biāo)簽 守結(jié)構(gòu)域 單重復(fù)序列 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 - 1 - 第一章 引言 棉花纖維是第一大天然纖維作物 , 世界上最重要的紡織原料之一，具有重要的經(jīng)濟價值。棉纖維是由胚珠表皮細胞發(fā)育而成的 ， 經(jīng)歷 了 四個重疊的發(fā)育階段：起始分化期 、伸長或初生壁合成期、次生壁形成期和脫水成熟期 。一般來講，胚珠表皮細胞有兩次起始高峰，第一次在開花當(dāng)天，起始分化的表皮細胞形成了經(jīng)濟價值較高的長絨；第二次出現(xiàn)在開花后4 6天，形成了貼著種皮的短絨（圖 每 一根棉纖維由單一細胞形成 , 無細胞分裂且纖維素含量高 , 這使得棉花纖維成為研究植物細胞分化、伸長以及細胞壁合成的理想材料。 同時棉纖維分化、發(fā)育的過程也是其產(chǎn)量和品質(zhì)的形成過程。胚珠表皮細胞分化直接決定著單位種子上著生的纖維數(shù)目，進而影響衣指、衣分和產(chǎn)量；纖維細胞分化的時間則影響著纖維長度 、 整齊度和短 絨率。因此分離、鑒定具有纖維細胞專一性且受發(fā)育程序調(diào)控表達的基因，將有助于我們通過遺傳工程途徑人為控制棉纖維生長發(fā)育，并提高棉纖維產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要的理論意義。本文對近年來棉花纖維分化起始的研究進展進行了綜述與討論。 纖維分化起始的時間及空間順序 左：長絨的起始 ( 掃描電鏡照片 ) 右：短絨的起始（石蠟切片圖片） 圖 長絨與短絨的起始 of 維細胞開始分化的時間通常 難以確定，因為在細胞形態(tài)上發(fā)生變化之前，細胞內(nèi)部已經(jīng)發(fā)生一系列生理生化變化。 根據(jù)楊佑明等（ 1999）的觀察，開花前 5 天（ 胚珠表面出現(xiàn)光滑的、半圓球形突起的纖維原始細胞 ， 因而認為在 有纖維細胞發(fā)育達到起始期。為什么開花前已經(jīng)起始的纖維細胞不立即伸長， 這種現(xiàn)象定義為時間窗，即已分化的纖維原細胞進入了一種定時狀態(tài)，也就是具備了發(fā)育形成纖維的能力，但其進一步的發(fā)育需要適當(dāng)?shù)拇碳?， 在整株的條件下，這種刺激顯然與開花有關(guān)。 第一章 引言 - 2 - 和 出短絨將在 4 生，也有人認為短絨發(fā)生在 5 10間。 徐楚年等（ 1987）認為，纖維突起首先出現(xiàn)在珠柄的脊突處，而 3 至 4 天后才在珠孔端出現(xiàn)突起。因此，珠柄上部的脊突纖維最長、最密，而合點端和中部的纖維較短、較稀，愈近珠孔纖維愈短、愈稀，珠孔附近直到開花后數(shù)天還未見有纖維突起。這些結(jié)果表明胚珠上纖維細胞的起始在縱向上表現(xiàn)出一定的順序。至于起始的纖維細胞在胚珠的橫向上則呈隨機分布。 (1975)推測在珠孔區(qū)可能含有纖維分化和伸長的抑制物質(zhì)；另一種推測是在珠柄上產(chǎn)生一種激素，促進了纖維的伸長并且這種刺 激可以沿著表皮細胞的極線移向珠孔端。柏長青（ 1992）和張?zhí)煺妫?1992）則認為這種纖維發(fā)育順序可能是內(nèi)源激素分布不均或胚珠表面細胞對激素的敏感性不同造成的。楊佑明等則認為刺激纖維細胞突起的物質(zhì)不是胚珠內(nèi)部產(chǎn)生的，而是來自其他部位，起始的纖維細胞集中分布的部位可能接近刺激物質(zhì)向胚珠運輸?shù)耐ǖ阑蛐遁d位點。 維分化起始的超顯微結(jié)構(gòu)分析 1976）觀察了開花前 16 天到開花當(dāng)天胚珠的亞顯微結(jié)構(gòu) 。 開花前 24小時，表皮細胞產(chǎn)生大量小液泡，其中充滿電子密集的酚類物質(zhì)，主要為鄰苯二酚。開 花前16 小時，表皮的柱狀細胞分為明暗兩類不同的表皮細胞，暗細胞是由液泡向細胞質(zhì)中釋放前期所累積的電子致密酚類物質(zhì)所致，使其粘于各種細胞器膜的表面，從而造成整個細胞的黑暗。 為，暗類型的表皮細胞可能是正在分化的纖維原始細胞。這類細胞的酚類物質(zhì)從液泡中外滲，與胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用，進而抑制了吲哚乙酸氧化酶的活性，使細胞內(nèi)的 含量提高到足以刺激纖維細胞的分化。但 1986）發(fā)表的另一篇試驗論文對 利用高密度電子的泄漏區(qū)分表皮發(fā)生起始的細胞與不起始的細胞是否具有一般性提出了質(zhì) 疑。 發(fā)表 )發(fā)現(xiàn)酚類物質(zhì)的泄漏僅僅偶爾出現(xiàn)，并且與表皮細胞的分化類型沒有相關(guān)性。 纖維分化過程發(fā)生了細胞核、細胞質(zhì)及細胞器內(nèi)一系列物質(zhì)的變化。核仁是細胞內(nèi)最顯著的部分，主要含有 蛋白質(zhì)以及許多酶類（如堿性磷酸化酶，核苷酸酶，6主要功能是合成核糖體 組裝核糖體大亞基以及控制 核進入細胞質(zhì)（如 ），這關(guān)系到纖維伸長時需要新合成的蛋白質(zhì)（杜雄明 等 ， 2000）。 胚珠在受精之前，表皮細胞的 分化起始 已經(jīng)決定，但經(jīng)正常受精后的 第三日，纖維伸長明顯加快，受精對于核仁物質(zhì)的增加和纖維發(fā)生是一種刺激，未受精的胚珠纖維發(fā)生推遲，細胞核仁變小。 分化前，少數(shù)表皮細胞內(nèi)有非常明顯的大核仁，非纖維細胞盡管核稍有增大，但核仁都較小（ ， 1984）。而且纖維原始細胞內(nèi)出現(xiàn)許多網(wǎng)狀或環(huán)狀的粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，液泡附近內(nèi)質(zhì)網(wǎng)還有高爾基體，它們的分泌泡均與液泡膜融合。高爾基體復(fù)合物的數(shù)量顯著的增加，可能是參與細胞壁多糖的合成以及液泡的形成。胞間連絲則分布在細胞側(cè)壁，基部胞壁加厚，胞間連絲消失 （楊子榮， 1991；徐楚年， 1995）?？傊?，纖維原始細胞分化、突起過程中，出現(xiàn)了細胞特化以及物質(zhì)合成和能量代謝旺盛的標(biāo)志。 短絨的分化和伸長時間隨棉種或品種的不同而變化，短絨細胞細胞壁相對較薄，液泡內(nèi)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 - 3 - 積累有色素物質(zhì)，變得較暗；而長纖維細胞具有厚的細胞壁，內(nèi)有一圈細胞質(zhì)和一個大的中央液泡，液泡內(nèi)不存在色素物質(zhì)，變得更加透明。干燥時長纖維變得扁平，中央液泡消失；而短絨纖維則保留著一個深顏色的中央核心。短絨成熟脫水后，由于其纖維基部壁厚，次生細胞壁與相鄰的無纖維細胞緊密結(jié)合插入表皮細胞層內(nèi)較深，牢固附著在種子上，軋花時不易被軋掉。短絨的細胞中核仁始終很小 ，而核仁的大小又是核糖體合成增強的標(biāo)志，具有小核仁和高度過早液泡化可能是產(chǎn)生短絨的原因之一。 1995） 采用速凍固定 電子顯微鏡對棉纖維進行微細結(jié)構(gòu)的研究，首次直接提供了棉纖維細胞擴散生長的細胞形態(tài)學(xué)和生化證據(jù)。 素對棉纖維分化的影響 溫度、激素、基因型等因素都直接影響棉纖維分化?；蛐团c纖維分化和發(fā)育有密切關(guān)系，纖維細胞突起時 間 在品種間有很大差異，鈴期越短則纖維分化越早?；?因 型不僅影響著棉纖維的分化和發(fā)育進展，而且還影響著棉纖維分化的數(shù)目。棉花原產(chǎn)于亞 熱帶溫度是制約棉纖維分化的主要因素，低溫會對纖維分化和發(fā)育產(chǎn)生不利影響。 一種化學(xué)復(fù)合物 995）。棉纖維的起始依賴于多聚腺嘌呤 1996）從開花當(dāng)天到 2以抑制纖維的起始。這里重點闡述激素對棉纖維分化的影響。 植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)明顯改變生殖發(fā)育起始時間，也影響細胞的分裂與伸長。激素對棉花胚珠和纖維有很大的影響，基因型決定纖維的表達，而具體的發(fā)育過程則是由激素、環(huán)境等因素共同 決定的。激素對纖維發(fā)育的影響主要從兩個方面進行研究，一是從棉鈴或胚珠中分離和鑒定內(nèi)源激素 ； 另一方面則是施用外源激素（外源激素處理完整植株或用于胚珠與器官的離體培養(yǎng)），觀察表型的變化。 現(xiàn)已證明，赤霉素（ 生長素（ 973,989）是纖維分化的重要因子 。 在沒有激素的情況下，受精胚珠培養(yǎng) 1后，也能產(chǎn)生纖維，但如果在培養(yǎng)基中加入 纖維量增加。人們對開花當(dāng)天或開花前 1未受精胚珠進行離體培養(yǎng)，在含 培養(yǎng)基中胚珠可以產(chǎn)生纖維，而開花前 1 天的未受精胚珠在含有 成抑制劑的培養(yǎng)基中，即使加入 不會產(chǎn)生纖維（ 1995）。因此 刺激纖維的分化，但它對纖維伸長的刺激不如生長素。生長素單獨使用很少能夠促進纖維分化，但卻有效的促進纖維伸長。 1973）認為 夠促成核仁物質(zhì)的合成并抑制核仁的液泡化，生長素 能促進核仁的增大，但在高濃度時則失去促進作用，而且 纖維的起始有加性作用。 脫落酸（ 抵消 作用，很可能是抑制了核仁物 質(zhì)合成。激動素對纖維的伸長沒有多大影響，但能克服 于 1976）提出一種解釋，認為 起的抑制作用是由于蘋果酸代謝受到干擾，他們還證明 棉花未受精胚珠蘋果酸合成酶的活性提高。顯然， 通過抵消 作用來抑制酶活性的增加。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 - 4 - 油菜素（ 認為是參與細胞伸長的重要激素，在體外利用 理棉花胚珠，能促進纖維的伸長，而用 種抑制 內(nèi)合成的化合物 )處理棉胚珠，則會抑制纖維的起始。 （ 2005）推斷 纖維起始和伸長 過程中都是必需的，不過這些激素調(diào)控棉纖維分化與伸長的內(nèi)在機制仍然是未知的。 乙烯（ 為一種重要的植物激素，在棉纖維初級細胞壁的合成以及快速伸長過程中所起的作用已經(jīng)被肯定，但對纖維起始發(fā)生 的 貢獻還沒有足夠的證據(jù)。 表 能參與激素合成及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的基因 he of R A3 O AA d BA TH 胞分裂素（ 棉花胚珠中是很豐富的，并且在開花后突變體中的含量非常高。（ 1997）利用 較了 棉纖維突變體胚珠中 +8K 的含量變化發(fā)現(xiàn) ,高濃度的 以降低 棉纖維發(fā)育的影響。而低濃度的 可以恢復(fù) 抑制作用。 同時在 ， 胚珠中的 量要顯著高于突變體中的含量。因此 能具有雙重的功能，它在開花前是纖維起始的一個信號 ,起始后則對纖維的發(fā)育負調(diào)節(jié)。目前還不能確定，為什么纖維分化突變體胚珠 中會積累但已經(jīng)知道細胞內(nèi)是通過降低 化酶介導(dǎo)的降解，提高 水平從而降低了 愈創(chuàng)內(nèi)酯衍生 I 類 (以 促進纖維的分化。 (1995)在亞洲棉胚珠培養(yǎng)中加入并觀察了它對一些酶活性的影響。結(jié)果表明，加入 開花前 1 日胚珠的 化酶活性降低，但在伸長階段 (花后 15 日 )增加，次生壁增厚階段也增加。然而，聯(lián)苯酚氧化酶活性在纖維分化和伸長階段則相反。這說明 通過調(diào)節(jié)聯(lián)苯酚和 化酶水平來促進纖維分化和伸長。 纖維起始分化 的 分子生物學(xué)研究 進展 維起始分化途徑 目前，對棉纖維細胞起始分化的分子機理知之甚少，纖維細胞的起始是在特定的信號刺中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 - 5 - 激下迅速發(fā)生的，