【畢業(yè)學(xué)位論文】(Word原稿)腦腸肽Ghrelin對(duì)膿毒癥大鼠小腸上皮短肽載體-1調(diào)節(jié)作用研究_第1頁
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蘭州大學(xué)碩士 學(xué)位論文 腦腸肽 膿毒癥大鼠小腸上皮短肽載體 節(jié)作用研究 1 前 言 膿毒癥腸道功能障礙或衰竭,主要表現(xiàn)是胃腸動(dòng)力、營養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)吸收及腸上皮屏障功能障礙,營養(yǎng)底物尤其是蛋白質(zhì)、葡萄糖無法在腸道內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)吸收,出現(xiàn)腹痛腹脹、營養(yǎng)不良、腸粘膜萎縮、免疫功能紊亂、菌群失調(diào),最終導(dǎo)致腸道細(xì)菌、內(nèi)毒素易位及腸源性感染,在此基礎(chǔ)上引發(fā)或加重其他器官功能衰竭,故腸功能衰竭又被稱為多臟器功能衰竭的 “發(fā)動(dòng)機(jī) ”1足見腸道在膿毒癥及 迄今為止,對(duì)膿毒癥腸道功能障礙認(rèn)識(shí)與研究不足, 嚴(yán)重感染病人腸道功能障礙 尚無有效調(diào)控治療手段 , 胃腸道粘膜的抗損傷和促修復(fù)相關(guān)因素 尚在探索之中。 作為預(yù)防性保護(hù)胃腸功能手段包括早期腸內(nèi)營養(yǎng)、微生態(tài)制劑、丙氨酸 藥大黃、小劑量前列環(huán)素、胃腸道去污染等途徑,試圖達(dá)到維護(hù)腸黏膜正常的結(jié)構(gòu)與屏障功能 5、調(diào)節(jié)腸道菌群生態(tài)平衡 6、改善胃腸黏膜低灌流狀態(tài),清除氧自由基、預(yù)防腸缺血 7的目的,但臨床療效并不盡如人意。 營養(yǎng)物質(zhì)吸收功能是腸道基本功能,研究發(fā)現(xiàn) 腸道蛋白質(zhì)吸收的主要途徑是腸上皮細(xì)胞 短 肽載體 (1對(duì)蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物 短肽 (二肽、三肽 )的轉(zhuǎn)運(yùn) 8,且 在病理狀態(tài)下 9。 然而, 膿毒癥時(shí)機(jī)體處于嚴(yán)重應(yīng)激狀態(tài),腸道組織細(xì)胞缺血、缺氧,可能影響著腸道上皮細(xì)胞內(nèi) 氧與注氧后 基因水平下調(diào)了腸上皮細(xì)胞刷狀緣 10; 腔注射脂多糖( 降低大鼠空腸 并非 地塞米松能阻止 11。 受炎性介質(zhì)影響。應(yīng)用小鼠腹腔注射 腸上皮 增強(qiáng)了近端和遠(yuǎn)端結(jié)腸部分的 12;小鼠腹腔注射2100端結(jié)腸部也有微量表達(dá),但是對(duì)空腸和回腸 12。總之,小腸上皮 善 迄今為止 , 嚴(yán)重感染病人腸道蛋白質(zhì)營養(yǎng)底物攝取的詳細(xì)機(jī)制及可能調(diào)控因蘭州大學(xué)碩士 學(xué)位論文 腦腸肽 膿毒癥大鼠小腸上皮短肽載體 節(jié)作用研究 2 素尚不十分清楚 , 經(jīng)腸補(bǔ)充的蛋白質(zhì)底物與病人的實(shí)際吸收和利用率存在嚴(yán)重的不符。由于蛋白質(zhì)的吸收與代謝在膿毒癥的治療及恢復(fù)中占有重要地位,研究膿毒癥蛋白質(zhì)吸收途徑的調(diào)控對(duì)膿毒癥治療具有重大意義。 研究發(fā)現(xiàn)腸功能衰竭在很大程度上也是內(nèi)分泌功能尤其是胃腸激素、腦腸肽類激素的分泌的衰竭。新近研究 的腦腸肽 體液途徑調(diào)節(jié)胃腸功能,作為胃腸道粘膜的抗損傷和促修復(fù)的有效手段受到矚目。 999年從大鼠胃黏膜及下丘腦發(fā)現(xiàn)的一種新腦腸肽激素 , 是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一生長(zhǎng)激素釋放激素受體 (內(nèi)源性配體,由 28個(gè)氨基酸組成 13。循環(huán)中的 , 1/3由腸粘膜 產(chǎn)生,且其受體( 泛分布于胃腸道組織中,在胃腸功能方面起著重要作用 14包括:促進(jìn)食欲、增進(jìn)飲食、增加體重 、促進(jìn)胃腸動(dòng)力 等。在小鼠失血性休克及胃黏膜損傷模型中, 改善胃黏膜損傷 20 8 輕了絨毛的縮短、降低 制饑餓誘導(dǎo)的小腸上皮細(xì)胞的凋亡 26。尤為重要的是, 出膿毒癥時(shí)胃腸功能障礙調(diào)控作用的潛能。 27在 2007年首度發(fā)現(xiàn) 素;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中顯示,膿毒癥晚期( 0h),血清中 膿毒癥早期其受體水平顯著提高 28。 善腸道黏膜通透性,減輕腸壁水腫,減少細(xì)菌移位 29,減少死亡率 30。同時(shí)在膿毒癥早期,外源性 改善膿毒癥血管過度收縮,改善組織灌注,延緩膿毒癥向休克進(jìn)展 31。在膿毒癥動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中外源性 2,33、減弱膿毒癥誘導(dǎo)的急性肺損傷 34、保護(hù)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的腎衰 35等作用。表明,持膿毒癥胃腸功能屏障、減少細(xì)菌移位以及改善后續(xù)的 示出對(duì)腸衰竭治療的潛能。研究表明, 善全身及局部炎性狀態(tài)。離體試驗(yàn)顯示 生、單核細(xì)胞粘附以及 體試驗(yàn)中, 制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞因子( 生 36。 37的實(shí)驗(yàn)也證實(shí) , 小鼠內(nèi)毒素血癥模型上,發(fā)現(xiàn)把 淋巴細(xì)胞共孵育,能大大降低致炎物質(zhì)誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子 為重要,在嚴(yán)重膿毒癥時(shí)外源性 1( 抑制 通路改善組織的灌注及功能 38。 39研究亦證實(shí)了明 炎機(jī)制顯示, 位論文 腦腸肽 膿毒癥大鼠小腸上皮短肽載體 節(jié)作用研究 3 質(zhì)的釋放減輕靶器官損害 40。 而 要受血糖及胰島素水平的調(diào)控,危重患者存在著胰島素抵抗會(huì)影響到胃腸道吸收功能。研究證實(shí) , 以改善胰島素抵抗,從而促進(jìn)胃腸道吸收功能 41。 但 注。 根據(jù)和 外環(huán)則含有多個(gè)氨基化位點(diǎn),提示激素可參與 42。 已 發(fā)現(xiàn)的可調(diào)節(jié) 狀腺素、糖皮質(zhì)激素、表皮生長(zhǎng)因子、胃泌素、 膽囊收縮素 及胰島素等 43。 下丘腦雙重分布激素,其 受體廣泛分布于胃腸道黏膜組織, 不但具有重要的能量代謝調(diào)節(jié)作用,而且具有促進(jìn)食欲、增加攝食及消化道細(xì)胞增殖、抑制炎性介質(zhì)釋放、維持 膿毒癥胃腸功能屏障、減少細(xì)菌移位以及改善后續(xù)的 前為止,通過腦腸肽改善膿毒癥腸功能、維護(hù)機(jī)體的氮的吸收的重要課題在國內(nèi)外尚無深入研究。 本課題認(rèn)為, 膿毒癥病理機(jī)制復(fù)雜, 到內(nèi)毒素、缺血、缺氧及炎性介質(zhì)等多因素影響,由于 促進(jìn)動(dòng)物攝食行為、增進(jìn)食欲 、增加體質(zhì)量及對(duì)胃腸道粘膜的抗損傷和促修復(fù)、 改善組織灌注 、抑制炎性反應(yīng)方面發(fā)揮作用,顯示出 調(diào)控膿毒癥狀況下對(duì)腸上皮 能與表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的潛能, 以此推測(cè), 能在改善膿毒癥時(shí)腸道 達(dá)及活性抑制發(fā)揮保護(hù)作用。 基于以上假說,本課題建立大鼠盲腸結(jié)扎穿刺模型( 將探討: ( 1)膿毒癥狀況下 小腸上皮 物學(xué)功能變化以及與 平變化 相關(guān)性 ;( 2) 給予外源性 腸上皮 達(dá)和功能影響。本課題希望通過研究 外源性 腸道短 肽吸收載體 調(diào)控作用,揭示 膿毒癥腸道吸收功能的影響,探索膿毒癥腸功能衰竭治療的新途徑。 蘭州大學(xué)碩士 學(xué)位論文 腦腸肽 膿毒癥大鼠小腸上皮短肽載體 節(jié)作用研究 4 第一部分:膿毒癥大鼠小腸上皮 短肽載體 物學(xué)功能變化及與 關(guān)性 言 小 腸上皮短肽載體 (1對(duì)蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物 短肽的轉(zhuǎn)運(yùn)是腸道吸收蛋白質(zhì)的主要途徑 44,在 膿毒癥復(fù)雜病理?xiàng)l件如 內(nèi)毒素、缺血、缺氧及炎性介質(zhì)等多因素影響下 ,小腸上皮 關(guān)研究甚少 。 新近發(fā)現(xiàn)的激素 已表明,膿毒癥時(shí)血清中 給予外源性 28。但膿毒癥時(shí)機(jī)體自身 平是否影響著 小 腸上皮 本研究擬采用盲腸結(jié)扎穿刺( 型,探討膿毒癥小腸上皮 及 與 為膿毒癥腸道功能障礙防治提供理論基礎(chǔ)。 料與方法 究對(duì)象 選取 性 重 275 上海交通大學(xué)附屬 第一人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物許可證號(hào): ) 2009 要實(shí)驗(yàn)儀器 旋渦振蕩器 (型號(hào): 海青浦瀘西儀器廠 超級(jí)凈化工作臺(tái) 型號(hào): 國 高壓蒸汽滅菌器 型號(hào): 海申安醫(yī)療器械廠 酶標(biāo)儀 型號(hào): 蘭雷勃酶標(biāo)儀 低溫冷凍離心機(jī) 型號(hào): 國 紫外殺毒車 型號(hào): 海躍 進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠 勻漿機(jī) 型號(hào): 國 倒置熒光顯微鏡 型號(hào): 本 液槍 型號(hào): 國 型號(hào): 國 蘭州大學(xué)碩士 學(xué)位論文 腦腸肽 膿毒癥大鼠小腸上皮短肽載體 節(jié)作用研究 5 冷藏冰箱 型號(hào): 來克斯 冰箱公司 流式細(xì)胞儀 型號(hào): L 美國 圖像分析系統(tǒng) 型號(hào): 本 型號(hào): 膠成像分析系統(tǒng) 膠成像分析系統(tǒng) 超低溫冰箱 型號(hào): 國 恒溫振蕩器 型號(hào): 海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司 石蠟切片機(jī) 型號(hào): 北 徠克公司 生物安全柜 型號(hào): 2 美國 攤騙機(jī) 型號(hào): 北 徠克公司 光學(xué)顯微鏡 型號(hào): 本 效液相色譜儀 型號(hào): 本島津 干式恒溫器 型號(hào): 州藍(lán)焰科技有限公司 電子天平 型號(hào): 海舜宇恒平科學(xué) 儀器 要 實(shí)驗(yàn) 試劑 國 兔抗大鼠 美國 兔抗大鼠 英國 國 美國 美國 氯仿 海試劑一廠 碧云天 生物科技有限公司 美國 國 異丙醇 州振亞化工廠 焦碳酸二乙酯( 上?;鶢栴D生物科技有限公司 上?;鶢栴D生物科技有限公司 海基爾頓生物科技有限公司 逆轉(zhuǎn)錄試劑 上?;鶢栴D生物科技有限公司 上?;鶢栴D生物科技有限公司 中性樹脂 上海基爾頓生物科技有限公司 無水乙醇 海振興化工一廠 蘭州大學(xué)碩士 學(xué)位論文 腦腸肽 膿毒癥大鼠小腸上皮短肽載體 節(jié)作用研究 6 甲醛 上海國藥集團(tuán) 美國 杰美基因生物公司 流式抗體 美國 美國 R&組織 美國 R& 美國 R&組織 美國 R& 美國 R&組織 美國 R&要實(shí)驗(yàn)用試劑的配置 (1) 8g 于雙蒸水中,定容至 1000裝,高壓滅菌后 4 保存。 (2) 制備分離膠 ( 30: w/v 丙烯酰胺:雙丙烯酰胺 30% 38ul 合 , 灌膠前加入 0% 36 5體積 膠濃度 10% 用注射器將配制好的溶液緩慢加入到裝配好的板中至凝膠高度為 6厘米左右,預(yù)留 板凝膠溶液上覆蓋 置 1小時(shí)左右至聚合完全。 (3) 制備基層膠 30:w/v 丙烯酰胺:雙丙烯酰胺 660 M 630 州大學(xué)碩士 學(xué)位論文 腦腸肽 膿毒癥大鼠小腸上皮短肽載體 節(jié)作用研究 7 20% 25 ul 3.6 合 , 灌膠前加入 0% 25 5體積 5用 紙吸去分離膠上層覆蓋的所有溶液 , 如上配制積層膠。用 10射器將積層膠加入板中至頂端,小心插入梳子,注意不要產(chǎn)生氣泡。凝膠聚合 1 小時(shí)左右。 (4) 1M 2.4 0% 3 油 (100%) 3 巰基乙醇 1.6 酚藍(lán) 體積 10 儲(chǔ)存于 4C) 準(zhǔn)備 1X 上樣緩沖液的樣品液:如 6 白樣品加入 3 X 上樣染液儲(chǔ)存液。每孔配制含 50蛋白樣的樣品液。上樣前煮沸 3 分鐘。 (5) 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移緩沖液 氨酸 醇 1L 加水至總體積為 5L (6) 甘露醇 10甲磺酰氟 2mM 于雙蒸水中,定容至 1000裝,高壓滅菌后 4 保存。 (7) 100 100 10mM 州大學(xué)碩士 學(xué)位論文 腦腸肽 膿毒癥大鼠小腸上皮短肽載體 節(jié)作用研究 8 溶于雙蒸水中,定容至 1000裝,高壓滅菌后 4 保存。 (8) 洗膜緩沖液 馬來酸 100 150 v/v) 于雙蒸水中,定容至 1000裝,高壓滅菌后 4 保存。 毒癥模型制備 參照 45的盲腸結(jié)扎穿孔( 法。 實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物禁食 12h, 自由飲水 , 腹腔內(nèi)注射 巴比妥鈉 40mg/醉成功后, 行 無菌操作 , 鋪無菌巾, 腹正中切口 2 逐層分離腹壁, 輕輕挑出盲腸, 于盲腸盲端 2/3處用 4號(hào)線結(jié)扎 , 避免結(jié)扎血管, 用 18輕 將盲腸貫通穿孔一次 , 穿孔為兩個(gè) , 輕輕擠出少許糞便 , 動(dòng)作輕柔, 避免損傷腸系膜血管,然后將盲腸還納腹腔 , 逐層縫合腹壁切 口 ,消毒切口 。 動(dòng)物處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。 驗(yàn)分組 及處理 60 只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為 對(duì)照組( n=10)和膿毒癥模型組( n=50),膿毒癥組又根據(jù)模型建立后 4h、 8h、 12h、 16h、 20h 隨機(jī)分為 5 個(gè)亞組 ,每組 10只 。 對(duì)照組 大鼠剖腹后僅分離盲腸,不結(jié)扎和穿孔 ;膿毒癥組大鼠剖腹后行 組術(shù)后均給予生理鹽水 30ml/下注射。 分別在建模 4h、 8h、 12h、 16h、 20機(jī)處理 10只 大鼠 , 留取靜脈血 4 以 取上段空腸,長(zhǎng)度約 15部分 測(cè)黏膜 部分 行小腸黏膜 病理,一部 分 于 4 下 制備 小腸黏膜刷狀緣囊泡( , 待測(cè)小腸 上皮 及 功能。 本檢測(cè) 腸黏膜病理 小腸黏膜病理采用 蘇木素一伊紅 (色 方法 ,光鏡下觀察 小 腸黏膜病理學(xué)變化。 具體步驟如下: a、取材與固定:將大鼠小腸 1組織塊 于 10福爾馬林中固定 24h 以上 ; b、組織沖洗:流水沖去固定液; c、組織脫水、透 明; d、組織包埋:常規(guī)石蠟包埋; e、組織修塊; f、切片:用石蠟切片機(jī)切片,厚約 3m;蘭州大學(xué)碩士 學(xué)位論文 腦腸肽 膿毒癥大鼠小腸上皮短肽載體 節(jié)作用研究 9 g、組織貼片: 45 水浴展片, 載玻片撈片 ,置于 65 恒溫干燥箱,待石蠟完全融化后,取出; h、 色; I、封片、光學(xué)顯微鏡觀察。 腸黏膜及血清 定 采用酶聯(lián)免疫吸附法( 定 小腸黏膜 組織 及血清 體操作流程如下: ( 1)標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋 ,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 ;( 2)加樣:分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn) 品準(zhǔn)確加樣 50測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液 40后再加待測(cè)樣品 10 3)溫育:用封板膜封板后置 37溫育 30 4)配液:將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 20 倍稀釋后備用;( 5)洗滌:小心揭開封板膜,棄去洗液,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置 30s 后棄去,如此重復(fù) 5 次,拍干;( 6)加酶:每孔加入酶標(biāo)試劑 50白孔除外;( 7)溫育:操作同( 3);( 8)洗滌:操作同( 5);( 9)顯色:每孔加入顯色劑加入顯色劑 輕振蕩混勻, 37避光顯色 10 10)終止:每孔加終 止液 50止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃色);( 11)測(cè)定:以空白孔調(diào)零,450長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度( )。 白印跡( 測(cè) 白表達(dá) ( 1) 制作大鼠小腸粘膜刷狀緣囊泡( 46:在 4 下進(jìn)行,冰鹽水清凈 大鼠腸管,縱向剖開腸管, 置于冰板上 ,固定腸管 , 刮取腸粘膜組織,稱取重量 2g 后,加緩沖液 1 (10露醇 , 甲磺酰氟 , 2 分鐘, 在 4 、 16000g 條件下 離心 2 分鐘 , 取上層清夜 加 入24沖液 1 振蕩混勻,取出后加氯化鈣(濃度 10拌并放置 15 分鐘(步驟 1)。將此渾懸液在 4 、 3000g 條件下離心 15 分鐘,取上層清夜加入 10,并再次充分振蕩混勻。將該混合液 在 4 、 27000g 條件下離心 15 分鐘,得到的沉淀加緩沖液 1(步驟 2), 重復(fù) 步驟 1 和步驟 2 兩 次。得到的最終沉淀用 18 號(hào)細(xì)針反復(fù)抽取加入緩沖液 2( 100mM 100 10, 緩沖液的 持在 用 。 ( 2)將提取的 50總蛋白 , 上樣于 10% 丙烯酰胺凝膠,電泳后轉(zhuǎn)膜至硝基纖維素膜。加入兔抗大鼠 克隆抗體 (封閉液 1: 1000 稀釋 ), 膜在 5 液中室溫孵育 1 小時(shí)以封閉膜上的非特異結(jié)合 , 室溫孵育2h,洗膜緩沖液( 100來酸, 150洗膜后 , 封閉過的膜加入一級(jí)抗體 4 過夜,抗原抗體結(jié)合。 膜 3 次,每次 5 分鐘 。 加 入 1: 5000)以結(jié)合一級(jí)抗體 , 室溫孵育膜 1 小時(shí) ,膜 3 次,每次 5 分鐘,每次 膜上加 電化學(xué)發(fā)光( 發(fā)光底物 , 在暗蘭州大學(xué)碩士 學(xué)位論文 腦腸肽 膿毒癥大鼠小腸上皮短肽載體 節(jié)作用研究 10 室內(nèi)壓片。同法顯示, 為加樣的內(nèi)參照,稀釋 1: 1500 鼠抗 克隆抗體作為一抗,稀釋 1: 1500 記的 為二抗。 所有蛋白提取過程均在 4 進(jìn)行防止蛋白分解。 化學(xué)發(fā)光試劑盒中兩種試劑等比例混合為反應(yīng)液 ,將膜置于反應(yīng)液中室溫孵育 5 分鐘 , 去除過量的溶液,將膜夾在兩塑料薄膜之間,以 X 光膠片曝光 , 片經(jīng) 密度儀掃描,根據(jù)測(cè)定蛋白條帶的面積和深淺計(jì)算光密度值 (件 ), 圖片掃描保存為電腦文件,并用分析軟件將圖片上每個(gè)特異條帶灰度值的數(shù)字化 。并以同一樣品中 密度 /密度比值作為 相對(duì)含量。 時(shí)定量 檢測(cè) 達(dá) ( 1)組織總 抽提 : 將所試驗(yàn)的標(biāo)本按序排放在管架,室溫待解凍 ; 依次將各組組織轉(zhuǎn)移至 12 55核酶 試管中 , 依次每一管中加入 1動(dòng)勻漿器 (轉(zhuǎn)速 為 10000r/理 3045 秒 , 每標(biāo)本間處理后用酒精棉球擦拭 ,焦碳酸二乙酯 處理水清洗 。 各管中加入氯仿 200激烈振蕩 15 秒 ; 在 4 、12000r/件下 離心 10 分鐘 ; 小心吸出水層加入依次編號(hào)的 中 , 再加入二倍體積的異丙醇 (約 600 輕輕振蕩 混勻 , 置于 箱 冷凍 30 分鐘 ; 在 4 、10000r/件下 離心 10 分鐘 , 棄 去 上清 液 , 留 取 沉淀 ; 然后 用 6505%乙醇洗滌沉淀 , 在 4 , 8000r/件下 , 離 心 5 分鐘 , 棄 去 上清 液 , 留 取 沉淀 ;揭開 管蓋 , 干式恒溫器 設(shè)定溫度為 65 , 烘干 約 5鐘 ; 20碳酸二乙酯( 處理水 , 溶解 箱保存 標(biāo)本 , 待測(cè) 。 ( 2)逆轉(zhuǎn)錄 成 : 將經(jīng)過稀釋后的 本進(jìn)行 逆 轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在以下體系中進(jìn)行: 5逆轉(zhuǎn)錄 d T) 轉(zhuǎn)錄酶 體積 20反應(yīng)條件: 37 , 6095 , 5滅活 ( 3) 應(yīng): 將制備好的 行 增 , 擴(kuò)增體系如 下 : 5逆轉(zhuǎn)錄 州大學(xué)碩士 學(xué)位論文 腦腸肽 膿毒癥大鼠小腸上皮短肽載體 節(jié)作用研究 11 上游引物 F 游引物 R 體積 50擴(kuò)增條件 :( 1) 50 , 2( 2) 95 , 5( 3) 95 ,15s; 60 , 45s, 40 目的基因 ?;鶢栴D生物有限 公司設(shè)計(jì)合成。引物序列見表 1。 表 1 基因 序列 擴(kuò)增長(zhǎng)度 游引 物: 5 228游引物: 5 游引物: 5 181游引物: 5 采用 針法 ,對(duì)目的基因和管家基因分別定量檢測(cè),通過校準(zhǔn),分析各組樣品中 的基因的相對(duì)表達(dá)量。 取功能檢測(cè) 取各組 0l, 23 培養(yǎng)箱中孵育 15取出。移除孵育液,每孔加入含二肽 轉(zhuǎn)運(yùn)液 搖床 37 中孵育,在不同的時(shí)間點(diǎn)(每隔 10用 冷的終止液終止孵育。將孵育液立即倒入微孔過濾器( 20行負(fù)壓過濾,用 5預(yù)冷的終止液洗滌 1次。微孔過濾器提取物加入 300l 蒸餾 水,振蕩 5 分鐘后,行高效液相色譜,測(cè)定 底物 攝取濃度。 據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。所有連續(xù)變量通過正態(tài)性檢驗(yàn),呈正態(tài)分布資料以均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差( xs)表示。多組間單因素方差分析 (多組間兩兩比較,若方差齊用 驗(yàn),若方差不齊用 檢驗(yàn)。 P差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 蘭州大學(xué)碩士 學(xué)位論文 腦腸肽 膿毒癥大鼠小腸上皮短肽載體 節(jié)作用研究 12 果 腸黏膜病理改變 對(duì)照組小腸黏膜結(jié)構(gòu)無顯著變化,小腸微絨毛排列整齊;膿毒癥 組不同程度的出現(xiàn)腸絨毛結(jié)構(gòu)紊亂、短縮、脫落,黏膜水腫,炎性細(xì)胞浸潤(rùn),毛細(xì)血管出血和潰瘍形成。見圖 1。 圖 1 小腸粘膜病理結(jié)構(gòu)變化 ( 100) 注: A:對(duì)照組,結(jié)構(gòu)清晰,腸上皮絨毛結(jié)構(gòu)完整; B:膿毒癥 4h 組,腸上皮絨毛脫落,毛細(xì)血管充血; C:膿毒癥 8h 組,腸上皮絨毛脫落,黏膜水腫,毛細(xì)血管充血; D:膿毒癥12h 組,腸上皮絨毛脫落、短縮,毛細(xì)血管充血; E:膿毒癥 16h 組,腸上皮絨毛脫落,潰瘍形成; F:膿毒癥 20h 組,腸上皮絨毛脫落,毛細(xì)血管出血,潰瘍形成,大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。 清及腸 黏膜 平 膿毒癥組各時(shí)間點(diǎn)血清和腸黏膜 較對(duì)照組明顯升高( P均在膿毒癥 4h 時(shí)達(dá)到高峰,之后有緩慢下降趨勢(shì) ,見表 2。 表 2 膿毒癥時(shí)血清及腸組織 平變化 組別 動(dòng)物數(shù)(只) 血清 ) 腸 組織 ) 血清 ) 腸 組織 ) 對(duì)照組 10 毒癥 4h 組 10 毒癥 8h 組 10 毒癥 12h 組 10 毒癥 16h 組 10 毒癥 20h 組 10 州大學(xué)碩士 學(xué)位論文 腦腸肽 膿毒癥大鼠小腸上皮短肽載體 節(jié)作用研究 13 注:與對(duì)照組比較, 膿毒癥 4h 組比較, 膿毒癥 8h 比較, 膿毒癥 12h 比較, 膿毒癥 16h 比較, 清及腸黏膜 平變化 膿毒癥時(shí), 血清和腸黏膜 平均在建模 4h 時(shí)達(dá)高峰,后逐漸下降,膿毒癥組各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ,見 圖 2、 3。 圖 2 膿毒癥時(shí)血清 平變化 規(guī)律 注:與對(duì)照組比較, 圖 3 膿毒癥時(shí)小腸粘膜 平變化規(guī)律 注:與對(duì)照組比較, 白表達(dá)水平 蘭州大學(xué)碩士 學(xué)位論文 腦腸肽 膿毒癥大鼠小腸上皮短肽載體 節(jié)作用研究 14 膿毒癥 12h、 16h 和 20h 組小腸上皮 白表達(dá)較對(duì)照組明顯下降( P 膿毒癥各亞組內(nèi) 12h、 160 P ,見圖 4。 圖 4 膿毒癥大鼠 術(shù)后 小 腸上皮 白表達(dá) 變化 注: 4h:膿毒癥 4h 組, 8h:膿毒癥 8h 組, 12h:膿毒癥 12h 組, 16h:膿毒癥 16h 組,20h:膿毒癥 20h 組 ; 肽載體 與對(duì)照組比較, 膿毒癥 4h 組比較,膿毒癥 8h 比較, 與膿毒癥 12h 比較, 達(dá)水平 膿毒癥 8h、 12h、 16h 和 20h 組小腸上皮 達(dá) 水平 較對(duì)照組下降( P 膿毒癥各亞組 之間 小腸上皮 達(dá) 水平 具有統(tǒng)計(jì)學(xué) 差異( P ,見圖 5、 6、 7。 蘭州大學(xué)碩士 學(xué)位論文 腦腸肽 膿毒癥大鼠小腸上皮短肽載體 節(jié)作用研究 15 圖 5 增動(dòng)力學(xué)曲線 圖 6 增動(dòng)力學(xué)曲線 圖 7 膿毒癥大鼠術(shù)后小腸上皮 達(dá) 變化 注 : 4h:膿毒癥 4h 組, 8h:膿毒癥 8h 組, 12h:膿毒癥 12h 組, 16h:膿毒癥 16h 組,20h:膿毒癥 20h 組; 短 肽載體 甘油醛 與對(duì)照組比較,膿毒癥 4h 組 比較, 膿毒癥 8h 比較, 與膿毒癥 12h 比較,蘭州大學(xué)碩士 學(xué)位論文 腦腸肽 膿毒癥大鼠小腸上皮短肽載體 節(jié)作用研究 16 與膿毒癥 16h 比較, 取功能水 平 膿毒癥 12h、 16h 和 20h 組小腸上皮 取量較對(duì)照組明顯下降( P 膿毒癥各亞組內(nèi) 12h、 16h 和 20h 組小腸上皮 取量均較膿毒癥 4h 和 8h 組下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ,見圖 8。 圖 8 膿毒癥大鼠術(shù)后小腸上皮 取功能 變化 注: 4h:膿毒癥 4h 組, 8h:膿毒癥 8h 組, 12h:膿毒癥 12h 組, 16h:膿毒癥 16h 組,20h:膿毒癥 20h 組; 氨酸 與對(duì)照組比較, 膿毒癥 4h 組比較, 膿毒癥 8h 比較, 白表達(dá)相關(guān)性 膿毒癥時(shí),血清和腸黏膜 平均與腸上皮 白表達(dá) 量( A 值)具有顯著相關(guān)性( r=r=P 呈正相關(guān) ,見圖 9、 10。 蘭州大學(xué)碩士 學(xué)位論文 腦腸肽 膿毒癥大鼠小腸上皮短肽載體 節(jié)作用研究 17 圖 9 血清 平與 白表達(dá)相關(guān)性 圖 10 小腸黏 膜 平與 白表達(dá)相關(guān)性 論 膿毒癥時(shí)可出現(xiàn)急性腸功能障礙,其特征是腸道吸收功能喪失, 營養(yǎng)底物尤其是蛋白質(zhì)、葡萄糖無法在腸道內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)吸收, 機(jī)體不能滿足蛋白質(zhì) 能量、液體、電解質(zhì)和微量營養(yǎng)物質(zhì)的平衡,出現(xiàn) 營養(yǎng)不良、免疫功能紊亂,在此基礎(chǔ)上引發(fā)或加重其他器官功能衰竭 1,47。業(yè)已表明,小 腸上皮 肽 ( 二肽、三肽 ) 的轉(zhuǎn)運(yùn) 是 腸道蛋白質(zhì)吸收的主要途徑 , 其表達(dá)數(shù)量及功能活性的高低直接影響著機(jī)體營養(yǎng)狀況及疾病預(yù)后 48。 因此,研究膿毒癥下 腸上皮蘭州大學(xué)碩士 學(xué)位論文 腦腸肽 膿毒癥大鼠小腸上皮短肽載體 節(jié)作用研究 18 將為臨床感染病人的營養(yǎng)支持模式及腸功能障礙改善提供理論依據(jù)。 盲腸結(jié)扎穿刺模型( 目前國際上 公認(rèn)的膿毒癥動(dòng)物治療模型,能模擬腹腔膿腫發(fā)展到彌漫性腹膜炎 ,隨著時(shí)間推移,貫續(xù) 出現(xiàn) 膿毒性休克和多器官功能障礙的臨床過程 49,50。在此過程中, 機(jī)體處于嚴(yán)重應(yīng)激狀態(tài),腸道組織細(xì)胞缺血、缺氧 和過度炎性刺激 , 可能 影響著腸道上皮 12研究表明, 應(yīng)用小鼠腹腔注射 腸上皮 11研究 表明 ,腹腔注射脂多糖( 降低大鼠空腸 但此種變化并非 塞米松可通過抑制 今為止,對(duì)膿毒癥復(fù)雜多因素病理生理?xiàng)l件下小腸上皮短肽載體的表達(dá)及功能的改變的認(rèn)識(shí)仍不十分清楚。本研究運(yùn)用大鼠 毒癥 8上皮 P 同時(shí) 2P 在此后膿毒癥進(jìn)程中( 2檢測(cè)到的 揭示膿毒癥狀況下,大鼠小腸組織 進(jìn)一步研究顯示, 膿毒癥 12h、 16h、 20功能較對(duì)照組明顯下降,且較膿毒癥 4異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P。本研究證實(shí)了膿毒癥復(fù)雜病理?xiàng)l件下小腸上皮營養(yǎng)載體 在基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平均受到抑制,下調(diào)了腸上皮 致使機(jī)體對(duì)蛋白底物轉(zhuǎn)運(yùn)吸收受到抑制 。 分析其可能機(jī)理: 膿毒癥時(shí) 小腸黏膜組織水腫,腸絨毛結(jié)構(gòu)紊亂、短縮,腸黏膜組織屏障受到損傷,會(huì)直接破壞腸上皮 使其分布減少 ; 既往研究表明,膿毒癥時(shí)由于大量炎性介質(zhì)如 引起小腸蛋白吸收障礙 51。本研究示, 4后維持較高水平,支持炎性因子可引起小腸上皮 與 11研究結(jié)果具有一致性。而12另一研究表明, 小鼠腹腔注射 2100空腸和回腸 可能與大鼠和小鼠之間腸上皮 腦腸肽 是生長(zhǎng)

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