【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）心血管疾病發(fā)病機(jī)制的深入研究

第一章 前 言 心血管疾病已成為威脅人類生命健康的一個(gè)主要問題，最新的研究數(shù)據(jù)預(yù)測，到 2030 年全球?qū)⒂?2360 萬人死于心血管相關(guān)疾病 1。由于動(dòng)脈粥樣硬化是導(dǎo)致心血管相關(guān)疾病的主要原因 2，因此對其發(fā)病機(jī)制的深入研究以尋找到可能的防治方法具有重要的意義。 大約在 1900 年，大多數(shù)內(nèi)科醫(yī)生認(rèn)為動(dòng)脈粥 樣硬化是年齡的產(chǎn)物。因此，幾乎沒有相應(yīng)的治療和干預(yù)措施 3。直到 1913 年， 用一個(gè)兔的動(dòng)脈粥樣硬化模型證實(shí)，血液高水平的膽固醇是導(dǎo)致此病發(fā)生的一個(gè)主要原因 4。此后進(jìn)行了大量關(guān)于膽固醇對動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展影響的實(shí)驗(yàn)，目前認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化是一個(gè)涉及脂質(zhì)和膽固醇過度沉積在大、中動(dòng)脈的炎癥代謝性疾病。 多種危險(xiǎn)因素，主要包括遺傳性因素和環(huán)境因素可以導(dǎo)致早期動(dòng)脈血管壁的形態(tài)學(xué)及功能性損傷，從而促使動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生 5。遺傳易感性通常表現(xiàn)為有動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾病的家族史，同時(shí)這些家族的 個(gè)體發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)增高 6。環(huán)境因素主要與個(gè)體的生活習(xí)慣相關(guān)，主要包括高脂飲食，吸煙及缺乏鍛煉。在這些危險(xiǎn)因素的作用下出現(xiàn)血管內(nèi)皮功能紊亂、血管炎癥，脂質(zhì)、膽固醇及細(xì)胞成分在血管壁內(nèi)膜下不斷聚積，最終導(dǎo)致粥樣硬化斑塊的形成。 動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的主要初始事件是由于各種危險(xiǎn)因素所導(dǎo)致的內(nèi)皮功能紊亂，包括血管損傷、膠原暴露、脂質(zhì)和膽固醇沉積于血管壁，或血流速度或壓力的改變而導(dǎo)致管壁應(yīng)力改變等 7。在這些因素中最主要的是 含的脂蛋白，如低密度脂蛋白（ 血管壁內(nèi)膜下的滯留和積累，當(dāng)血漿中 平過高時(shí)， 會(huì)滯留在血管分叉處或血管彎曲的部位 8。這些滯留的 發(fā)慢性炎癥反應(yīng)，使內(nèi)皮功能改變并誘導(dǎo)和釋放趨化因子，上調(diào)粘附分子 /受體表達(dá)，從而將血液中的單核細(xì)胞招募到激活部位，此后單核細(xì)胞便粘附并遷移至內(nèi)皮下 9。此外，滯留的 到炎性介質(zhì)刺激后轉(zhuǎn)化為修飾的脂蛋白，如氧化低密度脂蛋白（ 通過激活內(nèi)皮導(dǎo)致趨化因子的進(jìn)一步產(chǎn)生，招募越來越多的單核細(xì)胞到達(dá)激活部位 10。單核細(xì)胞一旦進(jìn)入內(nèi)皮下就分化為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞上的清道夫受體介導(dǎo)攝取沉積及修飾的脂蛋白，最終使巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟懝檀几患呐菽?xì)胞，大量的泡沫細(xì)胞便構(gòu)成了脂肪條紋，此為最早可見的動(dòng)脈粥樣硬化病變 11。隨著病變的進(jìn)一步進(jìn)展，泡沫細(xì)胞內(nèi)過度積聚的脂質(zhì)，尤其是游離膽固醇導(dǎo)致細(xì)胞毒性，其可誘導(dǎo)特異性細(xì)胞因子釋放并引發(fā)泡沫細(xì)胞死亡。泡沫細(xì)胞的死亡導(dǎo)致了由脂質(zhì)、膽固醇結(jié)晶和細(xì)胞碎片構(gòu)成的壞死核心，同時(shí)釋放到細(xì)胞外的細(xì)胞內(nèi)容物持續(xù)的刺激維持著 一個(gè)慢性炎癥狀態(tài)，進(jìn)一步促使巨噬細(xì)胞遷移到內(nèi)膜區(qū)域，從而引發(fā)惡性循環(huán) 12。 鑒于泡沫細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起到的關(guān)鍵性作用，通過對巨噬源性泡沫細(xì)胞形成過程的干預(yù)來阻止粥樣斑塊的形成，對防治動(dòng)脈粥樣硬化具有重要意義。泡沫細(xì)胞形成過程中細(xì)胞內(nèi)正常膽固醇代謝機(jī)制失衡， 胞內(nèi)膽固醇代謝涉及到膽固醇的合成、流入及流出過程，巨噬細(xì)胞內(nèi)的 ?；o酶 A 膽固醇?；D(zhuǎn)移酶 1（ ， 及細(xì)胞膜上 合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 1（ of ， 參與細(xì)胞內(nèi)膽固醇的調(diào)節(jié)。 與細(xì)胞內(nèi)膽固醇存在形式的調(diào)節(jié)，使吞噬進(jìn)入細(xì)胞的游離膽固醇轉(zhuǎn)化為膽固醇酯；而 與細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的調(diào)節(jié)，可以將細(xì)胞內(nèi)過多的膽固醇移出細(xì)胞外。在正常生理狀態(tài)下，它們可以維持細(xì)胞內(nèi)膽固醇的代謝平衡，但當(dāng)細(xì)胞膽固醇大量聚集時(shí)，這種穩(wěn)態(tài)機(jī)制不堪重負(fù)，巨噬細(xì)胞內(nèi) 膽固醇的流入流出過程失衡，從而使巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇大量聚集，最終導(dǎo)致泡沫細(xì)胞的形成 10。膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)（ 程是對抗細(xì)胞內(nèi)膽固醇聚集的主要機(jī)制，此概念最初由 出 13，指將肝外組織和細(xì)胞的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至肝，由肝臟轉(zhuǎn)化為膽汁并從糞便排出的生理過程。 認(rèn)為 對抗動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)保護(hù)性機(jī)制 14，而起始步驟是巨噬細(xì)胞內(nèi)的膽固醇流出 15，因此 促進(jìn)巨噬細(xì)胞的膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過程，減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇的聚集，可能抑制泡沫細(xì)胞的形成。 研究發(fā)現(xiàn) 泡沫細(xì)胞膽固醇逆行轉(zhuǎn)運(yùn)均有影響 16, 17，通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的 表達(dá)，來促進(jìn)巨噬源性泡沫細(xì)胞的 程，可能抑制泡沫細(xì)胞的形成。 噻唑烷二酮類藥物（ 括曲格列酮，羅格列酮和吡格列酮，為過氧化物增殖物激活受體 (，人工合成配體 18。 一個(gè)亞型，屬于配體調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子，其在脂肪代謝和糖代謝中有著重要的作用 19。 受體形成異二聚體并綁定在特定的 而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄 20。在臨床上噻唑烷二酮類藥物主要用于 2型糖尿病的治療，近來有關(guān) 動(dòng)物模型的數(shù)據(jù)顯示羅格列酮能夠抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成 21，但其機(jī)制尚未明確。一些研究顯示羅格列酮可能的抗動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制包括改善內(nèi)皮功能 22、促進(jìn)脂質(zhì)代謝 23, 24、抑制炎癥 25和增加斑塊的穩(wěn)定 26等?；趧?dòng)脈粥樣硬化發(fā)生機(jī)制的復(fù)雜性，我們在目前的研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討羅格列酮抗動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制。 本實(shí)驗(yàn)通過將 察羅格列酮 對巨噬源性泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量及 討其可能的細(xì)胞水平的機(jī)制，以尋找羅格列酮對抗動(dòng)脈粥樣硬化的潛在靶點(diǎn)。 第二章 材料與方法 1 實(shí)驗(yàn)主要試劑和設(shè)備 要試劑 小鼠單核巨噬細(xì)胞株 中科院上海細(xì)胞庫） ； 胎牛血清 （ 杭州四季青生物制品公司， 批號： ； 糖培養(yǎng)基（含葡萄糖 4.5 g/L） （ 美國 司，批號： ； 氧化低密度脂蛋白 （ 廣州奕源生物科技有限公司，批號： ； 羅格列酮 （ 美國 司，批號： ； 總膽固醇試劑盒 （ 北京普利萊生物科技有限公司，批號： ； 游離膽固醇試劑盒 （ 北京普利萊生物科技有限公司，批號： 兔抗人 體 （ 美國 司，批號： 兔抗人 體 （ 美國 司，批號： 體 （ 上海豐翔生物公司，批號： 辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體 （ 上海豐翔生物公司，批號： 劑 （ 美國 司，批號： 34077）； 細(xì)胞蛋白提取 解液 （ 美國 司，批號： 白濃度測定試劑盒 （ 美國 司，批號： 23277）； 要設(shè)備 超凈工作臺(tái) （ 蘇州凈化儀器廠 ）； 二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱 （ 美國 司 ）； 高速離心機(jī) （ 上海安亭 科學(xué)儀器廠 ）； 電熱恒溫培養(yǎng)箱 （ 成都紅星電烘箱廠 ）； 倒置顯微鏡 （ 日本 司 ）； 自動(dòng)酶標(biāo)儀 （ 美國寶特 司 ）； 電泳槽 （ 美國 司 ）； 轉(zhuǎn)膜儀 （ 美國 司 ）； 恒溫水浴箱 （ 北京西城區(qū)醫(yī)療機(jī)械廠 ）； 電子天平 （ 上海天平儀器廠 ）； 冰箱 （ 青島海爾股份有限公司 ）； 超聲波清洗機(jī) （ 寧波新芝生物科技有限公司 ）； 手提式不銹鋼蒸汽消毒器 （ 上海醫(yī)療器械廠 ）； 要實(shí)驗(yàn)材料 250 胞培養(yǎng)瓶， 6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板， 96 孔細(xì) 胞培養(yǎng)板， 10 管， 10 1.5 心管， 1.5 存管，加樣器及吸頭， 250 100 10 璃瓶，定性濾紙， 氏濾器，酒精燈等。 2 實(shí)驗(yàn)方法 胞培養(yǎng)及建立泡沫細(xì)胞模型 制培養(yǎng)基 1）將一瓶 糖型培養(yǎng)基（含葡萄糖 4.5 g/L）粉劑， 3.7 g 碳酸氫鈉溶解于雙蒸水中，待完全溶解后用雙蒸水定容至 1 L； 2） 4 下保存； 3）滅活胎牛血清，具體方法為將 保存的胎牛血清在室溫下完全溶解，置于 56 水浴箱內(nèi)輕輕晃動(dòng) 30 活； 4）配制完全培養(yǎng)基，成分為 89 濾后的 養(yǎng)基，加入 10 00 U/青霉素和鏈霉素。 胞培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)方法 27，使用含有 10%胎牛血清的 噬細(xì) 胞。將細(xì)胞置于 37 下，通以 95%空氣及 5% 合氣體的細(xì)胞培養(yǎng)箱中維持培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁達(dá) 70% 80%時(shí)進(jìn)行傳代。 胞傳代 當(dāng)細(xì)胞貼壁達(dá) 70% 80%時(shí)，為防止細(xì)胞因生長空間不足或因細(xì)胞生長密度過大而導(dǎo)致營養(yǎng)障礙，影響細(xì)胞生長，需要將細(xì)胞由原培養(yǎng)瓶分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶內(nèi)以維持細(xì)胞的生長。細(xì)胞傳代的具體步驟為： 1）棄去培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，使用 沖液洗滌培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞 3 遍，以去除殘留的培養(yǎng)基； 2）用加樣器取 酶 1 入培養(yǎng)瓶，并置于 37培養(yǎng)箱內(nèi)使其與細(xì)胞充分作用 5 3）達(dá)到消化時(shí)間后，在培養(yǎng)瓶內(nèi)加入含血清的完全培養(yǎng)基已終止胰酶的消化，并按順序依次吹打瓶底細(xì)胞使形成細(xì)胞懸液； 4）將細(xì)胞懸液移至 10 心管內(nèi)，高速離心， 1000 4 5）離心好后，棄去上清液，加入完全培養(yǎng)基并重新吹打制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度后接種至新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。 胞凍存 1）選擇生長良好的貼壁細(xì)胞并在凍存前一天給細(xì)胞換液； 2）棄去原來的培養(yǎng)液，用 滌細(xì)胞 3 遍后，加入 蛋白酶 1 照傳代的方法將細(xì)胞收集與離心管內(nèi)離心， 1000 4 3）離心后，去除上清液，加入配制好的凍存液，凍存液中完全培養(yǎng)基、胎牛血清、 比例為 7:2:1，將細(xì)胞吹打均勻后移入凍存管內(nèi)； 4）嚴(yán)密封口且做好標(biāo)記的凍存管依次在 冰箱放置 2 h， 冰箱放置2h，液氮口放置過夜后投入液氮中進(jìn)行長期保存。 胞復(fù)蘇 1） 從液氮罐中取出凍存管，用鑷子夾住瓶口，在預(yù)先調(diào)至 37 39 的水中輕輕晃動(dòng)使溶解，時(shí)間控制在 1 2 ； 2）配制好復(fù)蘇細(xì)胞的培養(yǎng)液，成分為 8 2 牛血清及終濃度為 100 U/ 青霉素和鏈霉素； 3）將復(fù)蘇的細(xì)胞加入配制的培養(yǎng)液中，記好復(fù)蘇時(shí)間，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)； 4）次日對復(fù)蘇細(xì)胞進(jìn)行更換培養(yǎng)液，以去除殘留 治其對細(xì)胞的副作用。 沫細(xì)胞模型的建立 參照文獻(xiàn)方法 28，取生 長良好的貼壁細(xì)胞，棄去細(xì)胞液，加入 全培養(yǎng)基和終濃度為 30 同孵育 48 h 使其轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞。細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯 /總膽固醇比值大于 50%界定為造模成功 29。 沫細(xì)胞油紅 O 染色鑒定 1）配制油紅 O 儲(chǔ)存液：取 0.5 g 油紅 O 粉劑溶于 100 丙醇中，在 4下避光保存； 2） 棄去模型細(xì)胞內(nèi)的培養(yǎng)基，用 細(xì)胞洗滌 3 遍； 3）加入 4%多聚甲醛，固定細(xì)胞 30 4）用去離子水稀釋油紅 O 儲(chǔ)存液，比例為 3 紅 O 儲(chǔ)存液中加入 2 釋后的油紅 O 染液用濾紙過濾以去除雜質(zhì)； 5）在細(xì)胞中加入油紅 O 染液，并在 37細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)放置 30 6）棄去細(xì)胞中的染液，用 75%酒精洗滌 1 遍細(xì)胞，顯微鏡下觀察染色結(jié)果。 驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為 5 組： 空白對照組，將巨噬細(xì)胞培養(yǎng)于含 10%胎牛血清的 于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)不做其他處理； ，用終濃度為 30 的 入完全培養(yǎng)基中，孵育巨噬細(xì)胞 48 h； 30 羅格列酮組，用終濃度為 5 的羅格列酮預(yù)孵巨噬細(xì)胞 2 h 后，加入終濃度為 30 的 8 h； 30 0 羅格列酮組，用 10 的羅格列酮預(yù)孵 2 h，其他操作同前； 30 0 羅格列酮組，用 20 的羅格列酮預(yù)孵 2 h，其他操作同前。 胞內(nèi)總膽固醇及游離膽固醇測定 按膽固醇檢測試劑盒說明書操作，具體步驟如下： 1）棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用 沖液洗滌細(xì)胞 3 遍； 2）洗滌后的細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液，加入比例為每 106 個(gè)細(xì)胞中加入 0.1 加樣器反復(fù)吹打，使細(xì)胞充分裂解； 3）將細(xì)胞裂解液移入 1.5 心管中，高速離心（ 2000 5 收集離心后上清液用于酶學(xué)測定； 4）配制游離膽固醇和總膽固醇工 作液，成分為 劑和 劑，配制比例為 2=4:1，混合后立即使用； 5）在 96 孔板的微孔中加入 10 L 樣品上清液和 190 L 工作液，置于 37細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi) 20 其充分反應(yīng)； 6） 酶標(biāo)儀測定各孔 ，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總膽固醇及游離膽固醇濃度。 測 蛋白表達(dá)水平 劑的配制 液 250 .0 g 用 200 餾水溶解，用濃鹽酸調(diào)節(jié) 所需點(diǎn)后，用蒸餾水定容至 250 各 濃硫酸需要量 17 16 15 10 0 g 100 丙醇溶解，分裝于離心管中， 存； 0.2 12 g 500 餾水溶解，高壓滅菌后室溫保存； 0.2 71.6 g 1000 餾水溶解，高壓滅 菌后室溫保存 10% 50水浴下 ， 10 g 蒸餾水溶解，并定容至 100 溫下保存； 10%過硫酸銨（ 0.1 g 過硫酸銨用 1.0 純水溶解， 4下可保存一周； 1.5 g 200 純水溶解，濃鹽酸調(diào) 純水定容至 250 壓滅菌后室溫保存； 0.5 g 200 純水溶解，濃鹽酸調(diào) 純水定容至 250 壓滅菌后室溫 保存； 10 沖液： 80 g 2 g 14.4 g 2.4 g 蒸餾水溶解，濃鹽酸調(diào)整 餾水定容至 1 L，高壓滅菌后室溫保存； 20% 0 蒸餾水定容至 100 4下保存。 用液 30%丙烯酰胺溶液： 29 g 丙烯酰胺加 1 g 甲叉雙丙稀酰胺，用去離子水定容至 100 光室溫保存； 10%過硫酸銨： 1 g 過硫酸胺加入 10 離子水， 存； 8 g 0.2 g g g 蒸餾時(shí)溶解，濃鹽酸調(diào)整 餾水定容至 1 L，高壓滅菌后室溫保存； 18.2 g 離子水溶解，加 離子水定容至 100 1M g 離子水溶解，加 離子水定容至 100 10蛋白電泳緩沖液： 30 g 144 g 甘 氨酸， 10 g 離子水定容至 1000 2 白上樣緩沖液： 5 .5 加入 4 0%14 0%甘油， 4 酚藍(lán)； 馬斯亮藍(lán) 液： 0.5 g 考馬斯亮藍(lán) 于 125 醇，加入 35 酸，去離子水定容至 500 避光室溫下保存； 蛋白轉(zhuǎn)移緩沖液： g g 甘氨酸， 100 0%甲醇，去離子水溶解并定容至 500 封閉液： 5 g 脫脂奶 粉，溶于 100 制成含 5%脫脂奶粉的 沖液； 沖液： 8.8 g 加入 10 餾水定容至 1000 沖液： 0% 加入 700 勻。 驗(yàn)步驟 白提取及蛋白含量測定 1）棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入 4預(yù)冷的 沖液，洗滌 3 遍，以去除殘存培養(yǎng)基； 2）洗滌好的細(xì)胞中加入 胞裂解液同時(shí)加入苯甲基磺酰氟（ 比例為 1胞裂解液中加入 10 L 待細(xì)胞裂解完全后，用刮刀將細(xì)胞刮下，將含有細(xì)胞碎片的裂解液均移至 1.5 心管內(nèi)； 3） 4下超速離心， 12000 5 4）收集蛋白樣品上清液， 測定蛋白濃度。 膠 制膠方法：固定好電泳玻璃板，根據(jù)樣品蛋白選擇 10%（ 8%（ 分離膠，加入分離膠后再在膠上加一層水，待膠凝固后吸出上層水，再在分離膠以上空間內(nèi)加入濃縮膠，加完后立即在濃縮膠中插入梳子，待濃縮膠凝固后小心拔除梳子。 不同濃度膠的配方 ： 10%分離膠（ 10 取 3.3 0%丙烯酰胺，加入 2.5 0.1 0%0.1 0%過硫酸銨， 4 餾水， 勻； 8%分離膠（ 10 取 2.7 0%丙烯酰胺，加入 2.5 0.1 0%0.1 0%過硫酸銨， 4.6 餾水， 勻； 5%濃縮膠（ 5 取 0%丙烯酰胺，加入 0%0%過硫酸銨， 3.4 餾水， 勻； 注：加入 立即混勻灌膠。 泳 1）將收集的蛋白樣品加入 2 白上樣緩沖液， 100加熱 5 蛋白變性； 2）待膠凝固后將玻璃板固定于電泳槽中，加入電泳緩沖液，再加入處理的變性蛋白樣品，接通電源，先穩(wěn)壓 80V 30 調(diào)電壓至 1100 膜 1） 提前將電泳好的凝膠，濾紙，海綿墊浸泡于電轉(zhuǎn)緩沖液中； 2） 取一塊 ，依次作如下處理： 100%甲醛中浸泡 10 秒，去離子水中浸泡 3 轉(zhuǎn)緩沖液中浸泡 3 3）在裝有電轉(zhuǎn)緩沖液的轉(zhuǎn)膜槽中放入電轉(zhuǎn)三明治，順序依次為：轉(zhuǎn)膜槽正極，海綿，濾紙， ，凝膠，濾紙，海綿，轉(zhuǎn)膜槽負(fù)極，注意趕出氣泡。放好后加蓋，接通電源進(jìn)行轉(zhuǎn)膜， 整電流至 200 膜 150 整電流至 25 膜 17 h； 4）將轉(zhuǎn)膜后的 置于含 5%脫脂 奶粉的 沖液中封閉 2 h。 體孵育 1）轉(zhuǎn)移膜加入 10 抗， 4下孵育過夜， 沖液洗滌 3 遍； 2）加入 15 抗，室溫下孵育 2 3 h， 沖液洗滌 3 遍。 學(xué)發(fā)光，顯影及圖像分析 1）配制 ， 1 液（ A 液）和 1 液（ B 液）混合后即可使用； 2）避光下用 澆膜，沖洗膜大約 10 次左右； 3）將膜放入夾片中， X 線曝光拍照； 4) 像分析軟件分析結(jié)果，用樣品蛋白的面積灰度值分別與 灰度值比較，比值為樣品蛋白的相對表達(dá)水平。 計(jì)學(xué)處理 采用 件系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（ x s）表示，兩組之間比較采用 t 檢驗(yàn)，大于兩組比較采用單因素方差分析。當(dāng) P S in . J 2000, 275(29): 2243541 , , G, et a a . 2005, 54(3): 81142 , , , et in J. J 2007, 321(2): 43143 , , L, et in . 2004, 24(2): 25744 J, . in . 2010, 7(2): 7745 , , , et of of in . 2009, 203(2): 48346 J, G, T, et of in . J 2006, 116(1): 5947 , , , et .