【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）利用DREB轉(zhuǎn)錄因子改良小麥耐鹽性的研究作物遺傳育種碩士論文

密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 利用 錄因子改良小麥耐鹽性的研究 .) I .) 摘 要 鹽害是小麥生產(chǎn)的重要脅迫因素，我國(guó)一些地區(qū)土壤鹽堿化嚴(yán)重，所以 通過(guò)基因工程方法提高小麥的耐鹽性具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。 本研究利用分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)手段，構(gòu)建了包括來(lái)源于植物擬南芥的 種逆境誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子 ,誘導(dǎo)相關(guān)抗逆基因的表達(dá)）基因和 用于篩選轉(zhuǎn)化植株的 因（編碼除草劑抗性）的表達(dá)載體。 以綜合農(nóng)藝性狀較好的小麥品種 932 塊幼穗愈傷組織為受體，用高壓氦氣基因槍（ e）將 因 導(dǎo)入小麥，經(jīng)愈傷及分化篩選成功獲得了 205 株再生植株 。經(jīng)除草劑 性篩選，其 中有 89 株植株表現(xiàn)除草劑抗性。 89 株抗性植株再經(jīng) 增和交鑒定，其中 50 株植株的基因組中整合有外源基因 化頻率達(dá)到 取 31 株轉(zhuǎn)基因小麥的后代種子繼續(xù)種植，獲得的 植株 經(jīng)分子鑒定，結(jié)果顯示 20 個(gè)后代株系的基因組中整 合 有 因，證明 因可以在轉(zhuǎn)基因后代植株中相對(duì)穩(wěn)定遺傳。轉(zhuǎn)基因植株后代種子繼續(xù)種植，獲得的 植株經(jīng) 增和 交鑒定 ， 4 個(gè)株系中沒(méi)有檢測(cè)到 因 ， 而 4 個(gè)株系中 因沒(méi)有發(fā)生遺傳分離，其它各株系表現(xiàn)不同的分離比例， 進(jìn)一步證明了 因在后代中可以相對(duì)穩(wěn)定遺傳，并且以顯性形式遺傳給后代。轉(zhuǎn) 因的小麥植株經(jīng)初步耐鹽試驗(yàn)表明，其耐鹽性明顯高于對(duì)照植株。 在鹽 迫條件下，轉(zhuǎn) 因小麥植株葉片的細(xì)胞表面糖蛋白層較為致密，而對(duì)照植株葉片的細(xì)胞表面糖蛋白層出現(xiàn)細(xì)胞壁外緣脫落現(xiàn)象。 將 因 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入小麥 。以小麥幼苗的莖尖分生組織為轉(zhuǎn)化受體，與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后共獲得 247 棵轉(zhuǎn)化幼苗，經(jīng)除草劑初步篩 選，有 66 棵轉(zhuǎn)化幼苗存活 。經(jīng) 增鑒定 ，其中 30 棵幼苗證明整合有 因 ， 轉(zhuǎn)化率達(dá)到 本研究利用優(yōu)化的基因槍和農(nóng)桿菌介導(dǎo)兩種基因轉(zhuǎn)化體系，較好地克服了小麥轉(zhuǎn)化受體的基因型障礙，提高了小麥的基因轉(zhuǎn)化效率，獲得了耐鹽性增強(qiáng)的轉(zhuǎn) 因小麥。 關(guān)鍵詞： 小麥； 因；基因槍轉(zhuǎn)化；農(nóng)桿菌介導(dǎo)；耐鹽性 he is an of of of so it is to s by is a of a of to is to in 32 by of 6756 by 05 on to by 00mg/l on 9 CR 50 to be of of 1 it 0 be to 2 t in T1 it in T1 in in of 1 be of In at of in of or in 6756 of 47 6 by 00mg/l 30 of of to in in an 目 錄 摘 要 . I . 一章 緒論 . 究目的和意義 . 內(nèi)外研究進(jìn)展 . 物抗逆基因工程研究進(jìn)展 . 麥轉(zhuǎn)化技術(shù)研究進(jìn)展 . 究?jī)?nèi)容和方法 . 第二章 小麥基因槍法轉(zhuǎn)化 因的研究 . 料與方法 . 料 . 法 . 果與分析 . 物載體的構(gòu)建 . 草劑抗性篩選 . 基因植株的分子檢測(cè) . 基因植株種子發(fā)芽的耐鹽性鑒定 . 胞表面糖蛋白層的觀察 . 結(jié) . 第三章 小麥農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化 因的研究 . 料與方法 . 料 . 法 . 果與分析 . 質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建 . 粒的酶切鑒定 . 粒載體的酶切鑒定 . 小麥的轉(zhuǎn)化、篩選與檢測(cè) . 結(jié) . 第四章 討論與結(jié)論 . 論 . 麥基因槍轉(zhuǎn)化體系與轉(zhuǎn)化效率 . 麥農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系與轉(zhuǎn)化效率 . 因與小麥的耐鹽性改良 . 一步研究的工作 . V 論 . 參考文獻(xiàn) . 致謝 . 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 第一章 緒論 究目的和意義 小麥?zhǔn)侨澜绶植挤秶顝V、栽培面積最大、總產(chǎn)量最高、總貿(mào)易額最多的糧食作物，在世界經(jīng)濟(jì)中占有舉足輕重的作用。我國(guó)小麥 最大播種面積在 4 億畝左右，約占全國(guó)糧食播種面積的26%，為僅次于水稻的第二大主要糧食作物。在小麥播種面積中，約有 2/3 為中低產(chǎn)田，這正是10 多年來(lái)全國(guó)小麥單產(chǎn)水平雖有 770 多公斤的高產(chǎn)紀(jì)錄，但平均畝產(chǎn)卻只有 260 公斤左右的主要原因之一。生產(chǎn)實(shí)踐證明鹽漬干旱是嚴(yán)重影響小麥生產(chǎn)的逆境因子，并已成為大幅度提高我國(guó)小麥單產(chǎn)及總產(chǎn)水平的主要瓶頸。我國(guó)有 15 億畝可耕地，鹽漬化耕地 1 億畝左右，另外還有約 5億畝的鹽堿荒地。近年來(lái)由于黃河年年斷流，水資源日益貧乏，鹽堿旱地有增無(wú)減。我國(guó)人多地少，糧食生產(chǎn)有待進(jìn)一步提高，而鹽堿 干旱地區(qū)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)水平低，發(fā)展?jié)摿Υ?，因此，努力提高該地區(qū)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)水平迫在眉睫。實(shí)踐證明，培育抗旱耐鹽的農(nóng)作物新品種是提高鹽堿旱地農(nóng)業(yè)生產(chǎn)水平最經(jīng)濟(jì)、最直接、最有效的途徑之一。所以，培育抗旱耐鹽的小麥新品種將具有廣泛的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益。 雜交育種仍是目前作物新品種培育的主要方法，但是傳統(tǒng)的育種方法已不能滿足當(dāng)前以及未來(lái)育種工作的需要。近 20 年來(lái)，隨著植物組織培養(yǎng)技術(shù)， 外重組技術(shù)，基因克隆技術(shù)及遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的發(fā)展，植物基因工程育種已成為作物育種的新途徑。 分子生物 學(xué) 的發(fā)展，使人們能夠在基因組成、表 達(dá)調(diào)控及信號(hào)傳導(dǎo)等分子水平認(rèn)識(shí)植物對(duì)逆境脅迫的耐（抗）性機(jī)理?，F(xiàn)已克隆到來(lái)自 微 生物 植物 等有機(jī)體的編碼生化代謝關(guān)鍵酶和逆境脅迫信號(hào)傳導(dǎo)的一些重要基因，采用重組轉(zhuǎn)基因技術(shù)向栽培植物導(dǎo)入這些外源目的基因，已發(fā)展成為改良植物耐（抗）脅迫性的新途徑。 與植物的抗蟲(chóng)、抗病等其它性狀比較，植物的耐鹽性、抗旱性等抗逆性狀要復(fù)雜得多。植物對(duì)干旱、高鹽及低溫耐性的強(qiáng)弱往往不取決于某一單個(gè)因子，其性狀受到許多因子的影響。利用單一基因，如脯氨酸合成酶基因或甜菜堿合成酶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化，雖能在一定程度上改善植物的耐鹽性或耐旱性，但 不能使植物的抗逆性得到較為理想的綜合改良。因此，從改良或增強(qiáng)一個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控著手，是使植物抗逆性得到綜合改良的有效的途徑和方法。 是這樣一種轉(zhuǎn)錄因子，它 可以調(diào)控多個(gè)與植物干旱、高鹽及低溫耐性有關(guān)的功能基因的表達(dá)。因此 ,利用轉(zhuǎn)錄因子 良小麥耐鹽性等抗逆性狀 ,預(yù)期能獲得較好的改良效果。 內(nèi)外研究進(jìn)展 物抗逆基因工程研究進(jìn)展 干旱、鹽堿、高溫、冷（凍）害和澇害等逆境條件是嚴(yán)重影 響栽培植物生長(zhǎng)發(fā)育的非生物脅迫因素。隨著人口增長(zhǎng)環(huán)境資源惡化，愈來(lái)愈多的研究集中在如何改良植物對(duì)逆境脅迫的耐（抗）性。由于植物的脅迫耐性大多屬于數(shù)量性狀，現(xiàn)有可利用的種質(zhì)資源匱乏，采用常規(guī)育種技術(shù)改中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 良植物的脅迫耐性，耗時(shí)費(fèi)力，困難大，至今尚未培育出真正的耐脅迫品種。 目前， 人們?cè)诨蚪M成、表達(dá)調(diào)控及信號(hào)傳導(dǎo)等分子水平 上 認(rèn)識(shí)植物對(duì)逆境脅迫的耐（抗）性機(jī)理 ， 克隆 了 來(lái)自 微生物等有機(jī)體的編碼生化代謝關(guān)鍵酶和逆境脅迫信號(hào)傳導(dǎo)的一些重要基因， 并利用 重組 轉(zhuǎn)基因技術(shù)向栽培植物導(dǎo)入 了 這些外源目的基因 （見(jiàn)表 。與傳 統(tǒng)育種方法相比，轉(zhuǎn)移外源目的基因 對(duì) 改良植物脅迫耐性更為直接迅速和有效。目前，應(yīng)用于植物脅迫耐性改良的外源目的基因 依據(jù)其產(chǎn)物的作用可分為兩大類 (劉強(qiáng)等， 2000)。 表 用于改良植物脅迫耐性的外源基因 he to of s to 因（來(lái)源） 表達(dá)產(chǎn)物 轉(zhuǎn)化植物 功 能 .) 甜菜堿醛脫氫酶 草莓 水稻 甜菜堿累積，抗鹽堿 . 膽堿脫氫酶 煙草 馬鈴薯 抗鹽堿、冷（凍）脅迫 膽堿單加氧酶 煙草 甜菜堿累積，抗鹽堿 抗凍蛋白 煙草 提高抗冷（凍）性 . 膽堿氧化酶 擬南芥 增強(qiáng)對(duì)低溫和鹽的耐性 . 9煙草 增強(qiáng)耐賽性 . 鐵 煙草 保護(hù)光系統(tǒng)和膜 肪酸去飽和酶 煙草 提高耐寒性 . 胚胎發(fā)生后期富集蛋白 水稻 維持受脅迫植物高的生長(zhǎng)率 . 錳 煙草 苜蓿 在細(xì)胞中減少活性氧的破壞 . 1煙草 擬南芥 水稻 積累甘露醇，提高耐鹽性 . 1 6水稻 積累甘露醇和 山梨醇 ，提高耐鹽性 b. 果聚糖轉(zhuǎn)移酶 煙草 果聚糖累積，干旱時(shí)保持高的生長(zhǎng)率 s. 海藻糖合成酶 煙草 在低濃度時(shí)提高干旱需性 . 吡咯啉 5煙草 脯氨酸累積，增強(qiáng)對(duì)低溫和鹽的耐性 . 谷胱甘肽 谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 煙草 增加被氧化的谷胱甘肽 , 加快幼苗生長(zhǎng) u,谷胱甘肽還原酶 /銅鋅超氧物岐化酶 煙草 抗氧化性 . 血紅蛋白 煙草 抗低氧和缺氧 H+ 反向運(yùn)輸?shù)鞍谆?小麥 轉(zhuǎn)運(yùn) 蛋白 ，合蛋白 煙草 激活了一些具有抗鹽效應(yīng)的下游基因 轉(zhuǎn)錄因子 擬南芥 誘導(dǎo)抗旱、鹽、凍基因表達(dá) 轉(zhuǎn)錄因子 擬南芥 小麥 誘導(dǎo)抗旱、鹽、凍基因表達(dá) 轉(zhuǎn)錄因子 擬南芥 誘導(dǎo)抗旱、鹽、凍基因表達(dá) 類可利用基因 第類可利用基因包括編碼直接保護(hù)細(xì)胞免受水分脅迫傷害的功能蛋白（如 白、滲調(diào)蛋白和伴侶蛋白等）基因；編碼滲 透調(diào)節(jié)因子（如脯氨酸、甜菜堿和海藻糖）的合成酶基因；以及毒性降解酶（如谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、超氧化物歧化酶和過(guò)氧化物氫酶等）基因等，這些編碼產(chǎn)物可以使細(xì)胞在逆境中各種生理生化代謝活動(dòng)維持正常進(jìn)行 (俞嘉寧等 ,2002)。 透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成酶基因 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 干旱、低溫和鹽漬等環(huán)境脅迫都直接或間接地造成植物細(xì)胞水分虧缺 (1993), 即誘發(fā)滲透脅迫 (為保證細(xì)胞內(nèi)水分平衡，多數(shù)生物體都會(huì)在細(xì)胞內(nèi)合成和積累被稱為滲透保護(hù)劑或滲調(diào)劑的小分子化合物。 一般認(rèn)為這些滲透保護(hù)劑 (滲調(diào)物(合成、積累既可提高細(xì)胞的滲透勢(shì)，又能穩(wěn)定細(xì)胞膜或大分子化合物的結(jié)構(gòu)，以抵御逆境脅迫 (沈義國(guó)等， 2001)。這些物質(zhì)包括甘油、山犁醇、甘露醇等多元醇；蔗糖、海藻糖和果聚糖等低分子糖類；脯氨酸、甘氨酸、甜菜堿等氨基酸及其衍生物。 甜菜堿是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在水分虧缺或 迫下它積累在細(xì)胞原生質(zhì)里形成滲透勢(shì)，從而與液泡中的組分保持滲透平衡，維持植物在干旱或鹽漬條件下的正常生理活動(dòng)。 水稻、馬鈴薯、煙草等植物合成積累甘氨酸 甜菜堿這種滲透保護(hù)劑極少。將來(lái)源于大腸桿菌的膽堿脫氫酶基因即 入煙草 (. et 1996)和馬鈴薯，轉(zhuǎn)基因植株中甘氨酸甜菜堿含量提高到 5g 干重，其耐鹽堿和抗凍性明顯改善。來(lái)自土壤細(xì)菌的的膽堿氧化酶是催化生成甘氨酸甜菜堿的另一關(guān)鍵酶。將編碼該氧化酶的基因 入擬南芥，獲得了耐鹽堿和抗凍害的轉(zhuǎn)基因植株 (. A. et 1997)。肖崗等（ 1995）從耐鹽性很強(qiáng)的山菠菜中分離到甜菜堿醛脫氧酶（ 因，劉鳳華等 (1997)、郭巖等 (1997)和郭北海等 (2000)分別將該基因?qū)氩葺?、煙草、水稻和小麥中，獲得耐鹽轉(zhuǎn)基因植株。 膽堿單加氧酶 ( 甜菜堿經(jīng) 膽堿氧化 獲得的 第一步反應(yīng)酶 。 李秋莉 等（ 2003） 從鹽生植物遼寧堿蓬 ( 克隆 了 因并 轉(zhuǎn)化 到 煙草 中， 轉(zhuǎn)基因煙草的甜菜堿含量明顯高于對(duì)照 ，提高了 轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性 。 脯氨酸是另外一種有效的滲透調(diào)節(jié)和膜保護(hù)物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)許多酶有保護(hù)效應(yīng)，可保持膜結(jié)構(gòu)的完整性。來(lái)源 于烏頭葉菜豆的 因 是細(xì)胞中脯氨酸合成的主要酶。 (1995)把該基因?qū)霟煵葜?，在干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株脯氨酸含量比對(duì)照植株提高 1018 倍，脅迫耐性明顯提高。 甘露醇是一種多元醇，編碼甘露醇 1因?qū)氲綌M南芥后，甘露醇大量合成，可使轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的種子在高鹽濃度下發(fā)芽，且發(fā)芽率提高 (C.,1995)。在 露醇合成同樣增加，且在鹽脅迫下該轉(zhuǎn)基因植株的生物產(chǎn)量得到了提高(.,1993)。將枯草芽孢桿菌編碼果聚糖轉(zhuǎn)移酶的 因?qū)霟煵?，轉(zhuǎn)基因煙草中累積果聚糖含量達(dá) g 鮮重，且在干旱脅迫下植株鮮重和干重均比對(duì)照高 (995)。編碼海藻糖 母基因被導(dǎo)入到煙草后，海藻糖過(guò)量表達(dá)，并伴隨著轉(zhuǎn)基因植株持水力和脫水耐性的提高 (O,1995)。王慧中等 (2000)將 6價(jià)基因整合進(jìn)水稻基因組中，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出對(duì) 抗性。張新春等（ 2003年）也將 入水稻， 因在水稻中獲得表達(dá)，提高了 水稻的耐鹽性。 迫誘導(dǎo)蛋白的基因 植物適應(yīng)逆境脅迫的另一策略是即時(shí)大量合成許多脅迫誘導(dǎo)蛋白 (例如，高溫?zé)釗籼幚砜烧T導(dǎo)植物細(xì)胞合成熱激蛋白 (冷響應(yīng)蛋白 (低溫誘導(dǎo)蛋白 (冷激蛋白 (水分脅迫誘導(dǎo)的胚胎發(fā)生后期富集蛋白 (EA (許智宏 1998)。 白是胚胎發(fā)生后期種子中大量積累的一系列蛋白，具有很中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 高的親水性和熱穩(wěn)定性，能把足夠的水分子捕獲到細(xì)胞內(nèi)，從而保護(hù)細(xì)胞免受水分脅迫（ J. 1996）。它廣泛存在于高等植物中，受發(fā)育階段、脫落酸（ 脫水信號(hào)的調(diào)節(jié)，在脅迫條件下都可誘導(dǎo)表達(dá) (俞嘉寧等 ,2002)。來(lái)自大麥的 因是編碼 白的基因。把該基因?qū)氲剿竞螅宿D(zhuǎn)基因植株在脅迫下仍能保持很高的生長(zhǎng)速 率，提高了滲透脅迫的耐性（ ,1996）。在某些極地魚(yú)中發(fā)現(xiàn)了類型 1 抗凍蛋白 (防止組織細(xì)胞中冰晶的形成，并已通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)使 一些轉(zhuǎn)基因煙草中得到表達(dá) (D,1993)。 善膜塑性的基因 在植物的質(zhì)膜中脂肪酸的不飽和程度和冷敏感性是緊密相關(guān)的。膜脂中心位置順式雙鍵的存在，可把相變溫度降低到接近 0。有些酶可催化飽和脂肪酸中順式雙鍵的形成，將編碼這些酶的基因?qū)胫参矬w內(nèi)，植株可獲得抗冷性狀。如將擬南芥中的葉綠體 肪酸脫氫酶基因 中，所獲得的轉(zhuǎn)基因植株抗冷性增強(qiáng) (,1994)。藍(lán)藻類細(xì)菌的 9此酶的基因 入煙草后，轉(zhuǎn)基因煙草在 1下生長(zhǎng) 11d，未出現(xiàn)缺綠癥 (996)。 性氧清除酶類的基因 鹽堿、冷（凍）和干旱脅迫會(huì)伴隨有活性氧的產(chǎn)生。這些毒性分子破壞生物膜，尤其是破壞線粒體和葉綠體的膜系統(tǒng)，導(dǎo)致氧化脅迫。植物中一些清除氧自由基的酶類可以抗氧化脅迫，例如 氧化物酶、過(guò)氧化氫酶和谷胱 甘肽還原酶 (R)。 幾乎所有植物抗氧化脅迫防御體系的重要成份。 工酶根據(jù)它們的金屬輔助因子的不同可以分為 3類：鋅、錳和鐵。現(xiàn)已將來(lái)自一種煙草 入到苜蓿中，通過(guò)三年的大田試驗(yàn)觀察，轉(zhuǎn)基因植株的產(chǎn)量和存活率都明顯提高 (D,1996)。源自擬南芥的 已成功在轉(zhuǎn)基因煙草中得到表達(dá)，當(dāng)被定位到葉綠體中時(shí)，它可保護(hù)質(zhì)膜和光系統(tǒng)免受超氧化物累積的破壞 (,1996)。轉(zhuǎn)移 可以增加植物抗氧化脅迫耐性。把這些來(lái)自于E. 水稻的基因?qū)霟煵葜?，得到的轉(zhuǎn)基因植株比野生型對(duì)照植株對(duì)氧化脅迫所受危害小(,1995)。 碼低氧 澇害常常引起氧脅迫，呼吸作用和葉綠素的合成等代謝受到影響。植物已進(jìn)化出應(yīng)付低氧脅迫的各種策略，如改變根的構(gòu)造，通過(guò)大的通氣組織加快內(nèi)部氧的運(yùn)輸，酶的誘導(dǎo)，以及產(chǎn)生氧結(jié)合蛋白質(zhì)等。血紅蛋白是在豆科植物固氮根瘤中發(fā)現(xiàn)的，它是一種氧結(jié)合蛋白。在轉(zhuǎn)血紅蛋白(因的煙草中發(fā)現(xiàn)，血紅蛋白有促進(jìn)氧擴(kuò)散的作 用 (.,1997)。 它基因 有些植物耐鹽性的差異取決于細(xì)胞中 排除能力。來(lái)自擬南芥的 H+反向運(yùn)輸?shù)鞍谆?(有增強(qiáng)植物耐鹽性的功能。楚秀生等 (2003)用 耐鹽篩選獲得了轉(zhuǎn)基因小麥植株。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 類可利用基因 第類基因包括編碼傳遞信號(hào)和調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子（如 因；編碼感應(yīng)和轉(zhuǎn)導(dǎo)脅迫信號(hào)的蛋白激酶以及在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用的蛋白酶等基因（ et 2002;et 1996）。 由于對(duì)植物細(xì)胞如何感應(yīng)干旱、高鹽及低溫引起的水分脅迫，如何將這些脅迫信號(hào)傳導(dǎo)到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)錄因子，以及下游的各種功能基因的表達(dá)調(diào)控等一系列的分子機(jī)理知道得甚少，因此，對(duì)第二類基因的表達(dá)特性及基因產(chǎn)物的調(diào)控作用的研究，成為近年來(lái)植物分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的一個(gè)前沿內(nèi)容。 與植物的抗蟲(chóng)、抗病等其它性狀比較，植物的抗逆性狀要復(fù)雜得多。植物對(duì)干旱、高鹽及低溫耐性的強(qiáng)弱往往不取決于某一單個(gè)因子，其性狀受到許多因子的影響。利用單一基因，如 脯氨酸合成酶基因或甜菜堿合成酶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化，雖能在一定程度上改善植物的耐鹽性或耐旱性，但不能使植物的抗逆性得到較為理想的綜合改良。因此，從改良或增強(qiáng)一個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子（第類基因的產(chǎn)物）的調(diào)控著手，將可能發(fā)展成為使植物抗逆性得到綜合改良的有效的途徑和方法。 目前 錄因子的研究極為活躍，并且在獲得抗逆的轉(zhuǎn)基因植物方面取得了一定進(jìn)展。下面就 錄因子目前的研究進(jìn)展作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。 1992 年 等利用示差篩選方法，從干旱處理的擬南芥中克隆了一批受干旱脅迫 誘導(dǎo)的基因，定名為 rd(to 因。其中對(duì) 因的啟動(dòng)子進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)一個(gè)與干旱、高鹽及低溫脅迫應(yīng)答有關(guān)的 9式作用元件 (序列為 ( et 并且證明 件對(duì) 脅迫條件下的表達(dá)起作用。除因外，在一些同樣受干旱、高鹽或低溫條件誘導(dǎo)的擬南芥基因如 因的啟動(dòng)子中，也發(fā)現(xiàn)存在 件或 心序列的元件 ( et et 另外還發(fā)現(xiàn)擬南芥只受低溫誘導(dǎo)的 因啟動(dòng)子中也有與 件極為相似的序列 稱為 件 ( S et 在甘藍(lán)型油菜中受低溫誘導(dǎo)的 件的核心序列 定名為 即低溫應(yīng)答元件。這些結(jié)果表明 式作用元件 (或 心序列 )普遍存在于干旱、高鹽或低溫脅迫應(yīng)答基因的啟動(dòng)子中（圖 并且對(duì)這些脅迫條件下的基因誘導(dǎo)表達(dá)起調(diào)控作用。 旱、高溫或低溫脅迫應(yīng)答基因啟動(dòng)子中的 式作用元件或含 心序列的順式作用元件 he RE or RE in of by 國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 利用 因啟動(dòng)子的順式作用元件和酵母單雜交方法，在低溫和干旱處理的擬南芥庫(kù)中已經(jīng)克隆到 5 個(gè)與 合的轉(zhuǎn)錄因子分別定名為 M et et 利用凝膠移位分析 (對(duì)蛋白質(zhì)與 結(jié)合進(jìn)行鑒定，證實(shí)了上述 錄因子與 式作用元件結(jié)合的特異性。從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，這 5 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子都具備反式作用因子的典型特征，既它們的 N 末端都有一段核定位信號(hào)， C 末端都有異端酸性活化區(qū)域，它們都含有一段保守的 合區(qū)域，由58 個(gè)氨基酸組成，被稱為 構(gòu)域（劉強(qiáng)等， 2000）。 （ 1997）利用酵母單雜交方法在擬南芥中克隆了 件結(jié)合蛋白的 名為 來(lái)證明它與 同一 基因。劉強(qiáng)課題組 秦峰 等（ 2003）又 從玉米 (.) 的 庫(kù)中分離到一個(gè)編碼與 件結(jié)合的蛋白的基因，命名為 現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn) 其構(gòu)域廣泛存在于擬南芥、西紅柿、煙草、水稻、玉米等植物中，并且可以調(diào)控許多抗逆相關(guān)基因得到表達(dá) (圖 這說(shuō)明利用 錄因子改良多種作物的抗逆性具有廣闊的應(yīng)用前景。 旱、高鹽、低溫 （ 信號(hào)傳遞 ） （ 轉(zhuǎn)錄調(diào)控 ） 增 強(qiáng) 植 株 脅 迫 耐 性 脅迫誘導(dǎo)的基因產(chǎn)物的積累 調(diào)節(jié)各種生理生化反應(yīng) 轉(zhuǎn)錄因子 （ 基因表達(dá) ） 細(xì) 胞 感 應(yīng) 缺 水 件 脅 迫 耐 性 相 關(guān) 基 因 脅 迫 耐 性 相 關(guān) 基 因 （ 環(huán)境脅迫 ） 圖 旱、高鹽或低溫脅迫分子應(yīng)答中， 錄因子 調(diào)控含有 件的抗逆相關(guān)基因的表達(dá)過(guò)程 he of RE by 引自劉強(qiáng)等， 2000） 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 為進(jìn) 一步研究 錄因子在脅迫條件下調(diào)控抗逆基因表達(dá)的作用， 999)等人把 錄因子導(dǎo)入擬南芥中，發(fā)現(xiàn) 錄因子超量表達(dá)，并且誘導(dǎo)其它抗逆相關(guān)基因的表達(dá)，提高了植株對(duì)干旱、高鹽和低溫的耐受能力。但是同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，利用 成型啟動(dòng)子 35S 啟動(dòng) 因，在正常生長(zhǎng)條件下，會(huì)造成植株生長(zhǎng)受抑制，