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文檔簡介
- - 級: 機密 論文編號 : 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩士學(xué)位論文 用原位雜交技術(shù)對 胞和牛組織 中的 測和定位 NA n - NA n 要 本研究借助于新興的原位雜交技術(shù),對 宿主細胞,實驗動物以及本體動物體內(nèi)的增殖與分布情況進行 了檢測和定位研究。首先以 因組中的保守區(qū)域設(shè)計并合成了 4 條寡核苷酸探針和 1 對引物,并利用尾段標(biāo)記技術(shù)以地高辛 分子 標(biāo)記了探針。然后用 ,收集不同時間段的細胞培養(yǎng)物,用細胞涂片法和爬片法,以特異性的探針進行雜交,在顯微鏡下觀察 細胞內(nèi)的分布情況,結(jié)果顯示, 4h,細胞質(zhì)中有少量的藍染顆粒出現(xiàn),呈現(xiàn)較弱的陽性信號;在接種病毒后6h,細胞開始有明顯的陽性信號出現(xiàn),細胞質(zhì)中有藍染顆粒出現(xiàn),表明細胞質(zhì)是 主要增殖場所;細胞感染病毒 810h 后細胞內(nèi)有強烈陽性信號出現(xiàn),細胞質(zhì)中有大量的藍染顆粒,表明 復(fù)制處于旺盛期,為了便于結(jié)果的判斷與分析,我們設(shè)置了陰性對照,均沒有相應(yīng)的陽性信號出現(xiàn),表明本研究所建立的原位雜交技術(shù)具有較高的敏感性和特異性。同時,本 試 驗還采用原位 術(shù)對感染 細胞進行了原位擴增,結(jié)果表明,細胞內(nèi)存在 增片段與預(yù)期大小一致,原位 用一條探針的雜交可以達到與原位雜交中使用多相探針相同的結(jié)果。 為檢測 宿主體內(nèi)的增殖與感染部位 ,我們用 原位雜交技術(shù)對感染 乳鼠組織樣品和牛組織樣品進行了檢測 ,結(jié)果顯示,在接毒后 25h 和 26h 的乳鼠骨骼肌的肌纖維細胞中有較多的藍染顆粒出現(xiàn) ,表明 該組織中大量存在 ,提示肌纖維細胞可能也是 制和增殖的部位; 同時我們對攻毒牛組織進行了檢測和定位 ,在接毒后 728d 的牛舌上皮組織中成功檢測出了 且發(fā)現(xiàn)病毒主要分布在上皮基底層,在顆粒層和棘層也有少量的在接毒后 38 d 牛舌上皮沒有檢測到有病毒 核酸 存在。在接毒后 712d 牛的喉咽部有少量的細胞有陽性染 色,大部分細胞沒有陽性藍染顆粒;在接毒后 738d 牛的蹄叉、淋巴結(jié)、扁桃體等組織中均沒有檢測出 在。該研究結(jié)果不僅從分子水平上對 宿主體內(nèi)的分布情況進行了精確定位 ,而且 也表明本研究所建立的原位雜交檢測方法和原位 測方法具有高度的敏感性和特異性 ,這將為我們 以后 進一步研究 分子致病機理和持續(xù)性感- - 機制提供有力的檢測工具和理論依據(jù)。 關(guān)鍵詞 : 原位雜交 , 原位 胞 ,乳鼠,牛- - of (in In D NA a of In NA 07 , 4, 6, 8 0 In in in a in of of 0 No in of of NA by in CR in a in of In SH in AN in NA in by in In in of 5 6 on of SH in In SH NA of , 12, 17 8 No in 8 of of of In in a in of NA SH 2 no in No in NA of of SH In is a NA in So we SH to MD in in in V 目 錄 第一章 緒論 1 究的目的和意義 1 內(nèi)外研究進展 2 究內(nèi)容和方法 4 第二章 用原位雜交對 5 料 5 法 5 果 7 論 10 第三章 用原位 12 料 12 法 12 果 14 論 15第四章 用原位雜交對組織中的 測和 定位 16 料 16 法 16 果 17 論 21 第五章 結(jié)果與討論 22 論 22 論 22 文獻綜述 23 參考文獻 3 3 謝 3 7 附錄 3 8 作者簡歷 4 3 表 2使用的寡核苷酸探針 6 圖 2原位雜交和檢測系統(tǒng)示意圖 7 圖 2果 8 圖 2培養(yǎng)細胞原位雜交結(jié)果 8 圖 2細胞爬片原位雜交結(jié)果 9 圖 2細胞爬片原位雜交結(jié)果 10 圖 3培養(yǎng)細胞原位 原位雜交結(jié)果 14 圖 3細胞原位 泳結(jié)果 15 圖 4乳鼠組織原位雜交結(jié)果 18 圖 4乳鼠組織免疫組化結(jié)果 18 圖 4牛舌上皮組織原位雜交結(jié)果 19 表 4牛的所有組織的原位雜交結(jié)果 20 圖 4牛舌上皮組織 果 20 - - 略詞表 類成髓細胞性白血病病毒 性磷酸酶 43倉鼠腎細胞 基對 of 化簇 補 胞病變(效應(yīng)) d 碳酸二乙酯 高辛 氧核糖核苷酸 聯(lián)免疫吸附實驗 蹄疫 蹄疫病毒 h 時 型肝炎病毒 型肝炎病毒 類免疫缺陷病毒 純皰疹病毒 辣根過氧化物酶 純皰疹病毒 干擾素 n 位雜交 n 位聚合酶聯(lián)反應(yīng) 要組織相溶性復(fù)合物 鐘 使 基四氮唑藍 酸緩沖鹽液 糖核苷酸 抑制劑 轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應(yīng) 霉親和素 準(zhǔn)檸檬酸鹽 生嗜熱菌 T 細胞受體 解溫度 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒 論 - - 1 第一章 緒 論 究的目的和意義 口蹄疫( 由口蹄疫病毒( 起的牛、豬、羊等偶蹄動物的一種烈性傳染病。該病的發(fā)生與流行不僅嚴(yán)重影響了畜牧業(yè)生產(chǎn)及其產(chǎn)品的正常貿(mào)易并造成巨大的經(jīng)濟損失,而且影響了人民正常的生活秩序,甚至?xí)绊懸粋€國家 或地區(qū)的政治穩(wěn)定,故該病又有 政治經(jīng)濟病 之稱。 于小 毒科( 蹄疫病毒屬( 迄今為止,已發(fā)現(xiàn) 7 個血清型( A、 O、 C、 各血清型之間無交叉免疫現(xiàn)象,即使同一血清型不同毒株之間也僅有部分交叉保護。 然是一種烈性傳染病,但是由于其病原是一種 毒,其基因組以 準(zhǔn)種 形式存在,因而 有抗原漂移的特性,在免疫選擇性壓力的影響下, 可能逃避宿主的免疫監(jiān)控系統(tǒng)而在宿主體內(nèi)呈 持續(xù)性感染狀態(tài),從而給 防制與凈化帶來困難。 發(fā)展到現(xiàn)在已逾百年,從全球 疫情分布情況來看,大多數(shù)國家都有該病的發(fā)生與流行,只有少數(shù)國家幸免。尤其是最近幾年, 流行態(tài)勢更為嚴(yán)峻,幾乎每年世界各地都有 發(fā)與再暴發(fā)的報道。如 1999 年我國臺灣的流行幾乎波及整個亞洲, 2001 年英國暴發(fā)的 乎席卷整個歐洲,不僅給本國造成了重大的經(jīng)濟損失,而且也給本地區(qū)甚至世界的經(jīng)濟造成了不良影響。 2001 年 暴發(fā)使英國撲殺 400 多萬頭家畜,估計造成的經(jīng)濟損失高達 90 多億英鎊。使得本病的重 要性得到充分的證明,疫情不僅使得歐盟各國重新關(guān)注 且也受到世界各國的普遍重視。 我國幾乎每年都有 域性散發(fā)流行的報告,尤其是 1999 年以來在世界范圍內(nèi)形成一次大流行,其中我國大陸 1999 年全國 31 個省市區(qū)全面大暴發(fā),牛、羊、豬發(fā)病總數(shù)為 53 萬頭,流行血清型以 O 型為主。 2000 年 15 月, 除 天 津外全國各省市區(qū)均有流行,發(fā)病牛,羊總數(shù)相對較大幅度下降為 10 萬 余 頭。最近幾年我國部分地區(qū) 發(fā)流行可以說是星星點點,接連不斷, 防制形式依然嚴(yán)峻。 有 證據(jù)表明 持續(xù)感染 動物可能成為 急性 流行 的潛在傳染源( et 1986; et 1994)。國外研究結(jié)果發(fā)現(xiàn), 行后約有 50%的動物成為持續(xù)感染者,而且未接種疫苗的動物比接種疫苗的高( et 994)。蘭州獸醫(yī)研究所曾多次對我國部分地區(qū)的健康牛通過流行病學(xué)調(diào)查以了解我國牛、 羊 和豬等易感動物 續(xù)感染情況,結(jié)果表明未接種疫苗的健康牛的持續(xù)感染率為 56%( 30d) ,接種疫苗牛為 48%( 30d),隨著時間延長有所下降,但是 60d 兩組的持續(xù)感染率還是較高為 28%(常惠蕓等, 2003)。這給 制增加了難度,因此,解決 續(xù)感染問題刻不容緩。那么怎樣才能解決 持續(xù)感染問題不僅是世界研究的熱點課題,而且是一個難點問題。 隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展, 分子生物學(xué)研究也取得了一系列的研究成果,如 因組序列的測定及功能研究、 子遺傳發(fā)生樹的建立、病毒與宿主細胞間的相互作用,以及 反向遺傳學(xué)研究等領(lǐng)域都有重大突破。但是所有這些體外操中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒 論 - - 2 作并不能完全明確病毒與機體相互作用的精確機制以及病毒在宿主體內(nèi)的持續(xù)感染機理,而解決這些問題用傳統(tǒng)的實 驗方法或技術(shù)如病毒組織培養(yǎng)技術(shù)、 清學(xué)試驗,甚至新興的 世紀(jì) 60 年代末出現(xiàn)的原位雜交技術(shù) (In 是生命科學(xué)研究領(lǐng)域中的一次技術(shù)性革命,該技術(shù)使得人們對生命科學(xué)的研究不再僅僅局限于對機體器官、組織和細胞的研究,而是擴展到分子水平上來研究機體的生命現(xiàn)象和本質(zhì)之間的聯(lián)系(et 1969)。例如在細胞或組織的基因表達、染色體分析、病毒診斷和發(fā)育生物學(xué)等研究方面, 原位雜交技術(shù) 發(fā)揮了巨大作用,人們也因此 取得了豐碩的研究成果 (et 2002; et 1999; 李西啟等, 2001; et 1995; et 1990),為基因定位,病原體基因的檢測等提供了理論依據(jù)和技術(shù)支持。 就原位雜交在 究中的應(yīng)用而言,國外已經(jīng)對細胞和組織中的 行了檢測和定位,并取得了一系列的成就。而我國在 因在宿主細胞中的定位研究方面尚屬空白。為此,在國家 973項目基金的資助下,我們利用原位雜交技術(shù)對 因在細胞和組織中的分布進行了檢測和定位研究,以期從分子水平上來闡明 宿主體內(nèi)的持續(xù)感染的病理和機理,也為制訂有效的 制措施提供理論依據(jù),因而該項研究具有重要意義。 內(nèi)外研究進展 為了對 致病機理有更深入的了解和做出詳明的闡述。在 究的早期,許多研究者應(yīng)用病毒分離方法和熒光抗體技術(shù)等手段研究了病毒在宿主體內(nèi)的分布情況,盡管結(jié)果認(rèn)為喉咽部是 性感染和持續(xù)感染期的主要復(fù)制位點。但是,由于受到當(dāng)時現(xiàn)有研究手段和方法的限制,他們的研究結(jié)果不能確證病毒感染的靶細胞 類型( et 994; et 993; et 999)。 1969 年美國耶魯大學(xué) 率先用爪蟾核糖體基因探針與其卵母細胞雜交,確定該基因定位于卵母細胞的核仁中 (et 1969)。與此同時, 利用同位素標(biāo)記核酸探針進行了細胞或組織的基因定位,從而創(chuàng)造了原位雜交細胞或組織化學(xué)技術(shù)。起初原位雜交都是對組織細胞中內(nèi)源性基因的檢測和定位。 1970 首先將原位雜交技術(shù)用于組織中感染性外源基因定位,他們用 3H 標(biāo)記的 兔乳頭狀瘤病毒 針與兔乳頭狀瘤組織的冰凍切片進行雜交,首次用原位雜交 對 細胞中病毒 基因進行了定位 ,這使原位雜交技術(shù)的應(yīng)用范圍進一步的擴大。但當(dāng)時原位雜交使用的是放射性探針,由于放射性探針的缺點使其應(yīng)用受限。 20 世紀(jì)80 年代初生物素和地高辛 分子 等非放射性標(biāo)記 物 的出現(xiàn)和使用促進了原位雜交的 進一步 發(fā)展,使其的應(yīng)用領(lǐng)域更為廣泛。特別是 70 年代末到 80 年代初,分子克隆、質(zhì)粒和噬菌體 構(gòu)建成功,核酸自動合成儀的誕生,大大豐富了核酸探針的來源,新的核酸分子雜交類型和方法不斷涌現(xiàn)使得原位雜交 的應(yīng)用 得到了前所未有 的發(fā)展, 從感染性外源基因的檢測和定位 (et 2002; et 1999; 李西啟等, 2001; et 1995; )、內(nèi)源基因的檢測、細胞因子的檢測和定位、染色體定位、基因工程到基因表達的研究等方面 都得到了廣泛的應(yīng)用 (et 1988; et 1992)。 與此同時,獸醫(yī)病理學(xué)家也開展了用原位雜交對 理的研究,首先將這一技術(shù)應(yīng)用于 是 ,他們用生物素標(biāo)記的 針對 人工感染的培養(yǎng)的豬腎細胞中的 行了檢測和定位 (et 989)。結(jié)果指出,在感染細胞內(nèi)有明顯的強陽性染色中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒 論 - - 3 顆粒,在檢測水平上 針比 針更敏感。此后,許多刊物陸續(xù)刊登了用原位雜交對細胞和組織中 位的許多研究報告。 1991 年 用生物素標(biāo)記的 針,采用原位雜交技術(shù)對人工攻毒后 豚鼠體內(nèi)的分布情況進行了實時動態(tài)觀察。發(fā)現(xiàn)攻毒后 4h,在其他 3 個未接毒的爪墊,肺泡巨噬細胞和脾臟的動脈血管壁內(nèi)發(fā)現(xiàn)有強陽性染色,而舌上皮較弱,發(fā)展到 24h 時最強; 隨時間的延長,肺部的陽性染色向肺泡膈擴散, 10h 后脾臟的動脈血管壁內(nèi)的強陽性染色消失。這說明上皮組織和內(nèi)臟組織是 期感染組織和器官 (et 991)。同時,他們認(rèn)為原位雜交在組織中病毒的檢測上優(yōu)于病毒分離技術(shù)。次年他們又用同樣的方法研究牛感染 病毒在自然宿主體內(nèi)隨時間的分布狀況,結(jié)果同前一樣上皮組織和肺泡巨噬細胞是 et 992)。在對 然宿主的研究中 (1999)用地高辛 分子 標(biāo)記 D區(qū) 針對感 染了 517果指出,病毒存在于軟鄂、扁桃體和咽部 ,但是其沒有鑒定出細胞類型 (et 999), 而且由于長探針引起高背景影響細胞定位。為了克服這一問題, 2000 年 采用多相寡核苷酸并對檢測信號用酪胺放大,結(jié)果不僅提高了寡核苷酸探針的敏感性,而且克服了高背景現(xiàn)象。次年他們又用同一方法對人工感染牛組織中的 行定位,從感染 82d 牛的喉咽部上皮組織中檢測出 多分布在上皮的基底層細胞的胞漿中 (et 2001)。 隨著原位雜交技術(shù)的發(fā)展,該技術(shù)也用于確定免疫球蛋白和各種細胞因子的合成部位以及其它各種免疫分子 ( 1988; et 989; et 1987),如補體,主要組織相容性復(fù)合體( T 細胞受體( 分化簇( 原等。 2000 年 用 染性克隆株和無前導(dǎo)鏈編碼區(qū)的 染牛,用原位雜交對牛體內(nèi)的 1 型干擾素基因的表達情況進行檢測和定位,結(jié)果指出, 染牛在肺單核細胞和肺淋巴結(jié)有大量的達,而 則只有 肺支氣管上皮細胞內(nèi)表達 (et 000)。 1990 年 把原位雜交和 合起來,對細胞內(nèi)單拷貝和低拷貝基因進行檢測和定位并獲得了成功,首次開創(chuàng)了原位 術(shù) ( in (et 990),使得原位雜交的敏感性和特異性又有很大提高。目前,原位 術(shù)已廣泛應(yīng)用于病毒等外源性基因的檢測和定位,如 (et 2002; et 1999; 李西啟等,2001)。 1995 年 用原位 術(shù)對 行了研究獲得了重大發(fā)現(xiàn)( et 1995)。他們一致認(rèn)為,原位 術(shù)在原位檢測細胞內(nèi)低拷貝基因方面具有更高的靈敏性和特異性,是原位檢測和研究低拷貝基因的良好手段。 在病理范圍內(nèi),原位雜交除用于病毒性疾病的診斷外,還廣泛用于腫瘤研究 (李西啟等, 2001; 董躍蘭等, 2003; et 1992)。對癌基因、抑癌基因及各種功能基因在轉(zhuǎn)錄水平的 表達及其變化的檢測,如在腫瘤發(fā)病的分子機理研究方面,已發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中有抑癌基因 突變或缺失。同時,發(fā)現(xiàn)許多病毒的感染與腫瘤的發(fā)生有關(guān) (et 1999; 李西啟等,2001)。研究結(jié)果對加深理解腫瘤的發(fā)生機理、判斷預(yù)后和治療反應(yīng)等都有一定的意義。 在發(fā)育生物學(xué)的研究中,原位雜交將有助于人們從基因水平來揭示生物體發(fā)育的奧秘(et 1990)。現(xiàn)已證明,不論是形體發(fā)育、細胞分化,還是圖式形成過程,都涉及到基因的時空調(diào)控。只有準(zhǔn)確的基因表達的時空調(diào)節(jié),才 能保證發(fā)育過程按照嚴(yán)格的時空秩序進行。 在遺傳學(xué)研究中,原位雜交被遺傳學(xué)家用于基因的定位和繪制基因圖譜 (et 1990; 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒 論 - - 4 et 1992)。同時,在植物遺傳育種上用于異源染色質(zhì)及多種染色體畸變檢測、植物基因工程及基因表達的研究及對遺傳連鎖關(guān)系進行細胞遺傳學(xué)鑒定。 究內(nèi)容和方法 為了弄清楚 細胞和宿主體內(nèi)的復(fù)制和貯存部位,我們利用原位雜交和原位 1) 首先建立 原位雜交 檢測方法,用該方 法對感染 胞進行了檢測和定位,確定 因組在 染細胞中的復(fù)制和增殖部位。同時,鑒定該方法的敏感性和特異性。為用該方法對 染組織中的 測和定位提供試驗資料。 2) 建立原位 測方法,并應(yīng)用該技術(shù)對感染 行檢測和定位研究,同時與用 原位雜交 檢測方法做比較,以判斷原位 檢測感染細胞中 可行性。 3) 用所建立的 原位雜交 對 乳鼠和牛體內(nèi)的感染與分布情況進行定位研究,初步判定 主要感染部位和持續(xù)性存在部位。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 用原位雜交對 胞中的 位 - - 5 第二章 用 原位雜交 對 胞中的 位 摘要: 用地高辛 分子 標(biāo)記的寡核苷酸探針對感染 的病毒 行檢測和定位,同時也對探針的特異性和敏感性進行驗證。結(jié)果表明本實驗所設(shè)計的寡核苷酸探針不僅具有較高的敏感性,同時也具有很好的特異性,能準(zhǔn)確地對感染 胞的病毒 行定位,從分子水平上證明 要在細胞質(zhì)中進行復(fù)制和繁殖。 關(guān)鍵詞: 原位雜交, 針 , 料 株 : 試驗用毒株 O/8 是本 實驗 室保存毒株。 胞 : 本試驗使用的 胞系是本 實驗 室常用細胞系。 要試劑: 敏感加強型原位雜交檢測試劑盒 (堿性磷酸酶)(武漢博士德生物工程有限公司)、多聚甲醛( 多聚賴氨酸( 715 萬)( s 液( 100)、硫酸葡聚糖鈉( 去離子甲酰胺( 吐溫 20( 、 性樹膠、胎牛血清( 蛋白酶等。 法 病毒的復(fù)壯 當(dāng) 胞長成單層時用 O/8 接種,觀察病毒的致細胞病變情況待 80%左右的細胞出現(xiàn)病變時,收獲細胞培養(yǎng)物,凍融 3 次后,再接種 胞,直至病毒的 應(yīng)穩(wěn)定典型為止,收獲病毒 凍存?zhèn)溆谩?胞的培養(yǎng) 涂片細胞按細胞常規(guī)培養(yǎng)方法培養(yǎng)。細胞爬片用直徑為 60平皿(放置多聚賴氨酸處理的飛片) 37 5% 養(yǎng)箱 培養(yǎng)細胞,使用含有 10% 養(yǎng)液(加 10 萬單位 微克 /毫升的青、鏈霉素)。待細胞長成單層時接種上述病變穩(wěn)定的 ( 107 。 引物設(shè)計與合成 根據(jù) O/8 的基因組序列,用生物學(xué)軟件設(shè)計并合成了引物, +) 5- -) 53,由寶生物(大連)有限公司合成。 寡核苷酸探針的設(shè)計與 合成 通過 列分析軟件比較 C 型、 O/8、 、 7五株序列 ( 序列均來自 的 3D 區(qū),選擇 D 區(qū)最保守的序列作為探針(序中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 用原位雜交對 胞中的 位 - - 6 列比對見附錄 1)。采用尾段標(biāo)記技術(shù),在 3尾段標(biāo)記非放射性標(biāo)記物地高辛分子, 合成與 標(biāo)記工作由武漢博士德生物工程有限公司完成(表 2 表 2用的寡核苷酸探針 稱 探針序列( 5 長度( 22 5529 28 30 細胞涂片的制備 培養(yǎng)細胞直接涂片 將 胞培養(yǎng)在 100胞瓶中 ( 37 ) ,所使用的培養(yǎng)液是含有 10% 胎牛血清( 10 萬單位 微克 /毫升的青、鏈霉素)。當(dāng)細胞生長成單層時接種上述病變穩(wěn)定的 ( 107 接毒細胞 4h 已出現(xiàn)明顯的細胞病變,同時設(shè)立 陰性 對照。棄掉培養(yǎng)液,并用培養(yǎng)液洗滌 1 次,棄掉洗液。用 胰蛋白酶消化細胞,把消化后的細胞移入 量離心管, 1600g 離心 5 滌細胞,1600g 離心 5 釋細胞為 2106 后取 10L 細胞懸液滴在多聚賴氨酸處理的載玻片上( 室溫?zé)o塵條件下自然 干燥,然后用 4%多聚甲醛( 配制的 溫固定 30滌 5復(fù)一次, 洗 5餾水充分洗滌,自然干燥后 凍 存?zhèn)溆谩?細胞爬片的制備 將多聚賴氨酸處理的無菌載玻片放置于直徑為 60皿內(nèi),進行 胞培養(yǎng),所使用的培養(yǎng)液是含有 10%( V/V) 胎牛血清的 10 萬單位 微克 /毫升的青、鏈霉素),平皿置于 37 5% 養(yǎng)箱。當(dāng)細胞生長成單層后,接毒 ( 107收集接毒后 2h、 4h、 6h、 8h 和 10h 的蓋玻片,用 5滌 2 次 ; 4多聚甲醛室溫固定 30用 滌 5滌 2 次, 洗 570% 酒精中 4保存,或自然干燥后 凍存?zhèn)溆谩?交 從所使用的細胞毒中提取 生物公司)進行 應(yīng)體系為: 5 L; 0L ; L; L; L; L;L; L, 0L,無 水 15L)。擴增程序: 50 , 3094 ,594 , 256 , 72 , 30 循環(huán), 72 , 10擴增產(chǎn)物 電泳 后的 轉(zhuǎn)膜 、 雜交程序參考分子克隆第三版。 感染細胞 原位雜交 1) 暴露靶核酸:上述準(zhǔn)備好的細胞涂片滴 加用 3%檸檬酸新鮮配制的胃蛋白酶, 37 消化中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 用原位雜交對 胞中的 位 - - 7 5120滌 3 次 5理蒸餾水洗 1 次。 2) 預(yù)雜交:將細胞切片放置在濕盒里,每張切片加 1020L 預(yù)雜交液,蓋上原位雜交專用蓋玻片在 42 恒溫箱預(yù)雜交 24h。揭去蓋玻片,吸取多余預(yù)雜交液,不洗。 3) 雜交:每張切片加 1020L 含探針的雜交液( 2g/溫箱 42 雜交過夜。 4) 雜交后洗滌:揭掉蓋玻片, 37 的 2滌 5 次; 5 次; 5 次。 5) 滴加封閉液: 37 30去多余液體,不洗。 6) 滴加生物素化鼠抗地高辛: 37 60 室溫 120滌 5 次。 7) 滴加 37 30滌 5 次。 8) 顯色: 20)按 1: 20 的比例用 釋,混勻。顯色液加至標(biāo)本上。 37 避光顯色 3060時鏡下觀察當(dāng)出現(xiàn)背景染色時及時終止,蒸餾水充分洗滌。核固紅復(fù)染 515洗。梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,鏡下觀察。 結(jié)果 果 如圖 2示,只有 標(biāo)條帶的區(qū)域有清晰的雜交條帶,而 沒有條帶出現(xiàn),雜交 鏈霉親和素 酶底物 性磷酸酶 生物素化鼠抗地高辛抗 體 地高辛標(biāo)記寡核苷酸探 針 病毒 序列 圖 2原位雜交和檢測系統(tǒng)示意圖,主要成分包括地高辛分子標(biāo)記的寡核苷酸探針、生物素化鼠抗地高辛抗體、鏈霉親和素、堿性磷酸酶和底物 of in 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 用原位雜交對 胞中的 位 - - 8 雜交條帶 2 3 M 圖 21
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