【畢業(yè)學位論文】（Word原稿）MyD88siRNA誘導豬調節(jié)性樹突狀細胞的實驗研究-臨床醫(yī)學胸心外科博士論文

保密 2 年 申請同濟大學醫(yī)學 博 士學位論文 二一年五月 導豬調節(jié)性樹突狀細胞的實驗研究 培養(yǎng)單位：醫(yī)學院 一級學科：臨床醫(yī)學 二級學科：胸心外科 研 究 生： 指導教師： 教授 保密 2 年 A in 2008 書脊 2010 by of o. 055407030) 君 同濟大學 學位論文版權使用授 權書 本人完全了解同濟大學關于收集、保存、使用學位論文的規(guī)定，同意如下各項內容：按照學校要求提交學位論文的印刷本和電子版本；學校有權保存學位論文的印刷本和電子版，并采用影印、縮印、掃描、數字化或其它手段保存論文；學校有權提供目錄檢索以及提供本學位論文全文或者部分的閱覽服務；學校有權按有關規(guī)定向國家有關部門或者機構送交論文的復印件和電子版；在不以贏利為目的的前提下，學?？梢赃m當復制論文的部分或全部內容用于學術活動。 學位論文作者簽名： 年 月 日 同濟大學學位論文原創(chuàng)性聲明 本人鄭重聲明：所呈交的學位論文，是本人在導師指導下，進行研究工作所取得的成果。除文中已經注明引用的內容外，本學位論文的研究成果不包含任何他人創(chuàng)作的、已公開發(fā)表或者沒有公開發(fā)表的作品的內容。對本論文所涉及的研究工作做出貢獻的其他個人和集體，均已在文中以明確方式標明。本學位論文原創(chuàng)性聲明的法律責任由本人承擔。 學位論文作者簽名： 年 月 日 縮語表 縮 語 表 突細胞 原遞呈細胞 節(jié)性 T 細胞 C 未成熟樹突細胞 植物抗宿主病 8 髓樣分化因子 88 周血單個核細胞 組豬粒單集落刺激因子 重組豬白細胞介素 - 4 多糖 向角散射 向角散射 縮語表 混合淋巴細胞反應 干擾素 干擾 C 外周血單核細胞來源的 信號調節(jié)蛋白 亡結構域 原相關分子模式 式識別受體 介素 1 受體相關激酶 瘤壞死因子受體相關因子 擾素調節(jié)因子 7 摘要 摘要 目的 通過 合刺激豬外周血單核細胞，獲得豬外周血單核細胞來源的采用 擾豬 髓樣分化因子 88（ 因的表達，從而誘導出豬調節(jié)性 對干擾前后的細胞表型，免疫學功能及生物學活性進行檢測，探討豬調節(jié)性 誘導耐受的機制，為臨床應用于移植耐受奠定基礎。 材料和方法 提 取豬外周血單個核細胞（ 經 導，體外培養(yǎng)得到未成熟單核來源的 過化學合成法制備針對 因 對（序列 1 和序列 2），在 染試劑介導下轉染 以轉染無義 別給予 1的 用 測干擾前后 因的表達水平。流式細胞術 (檢測 面 6， , 分子表達， 測定混合淋巴細胞培養(yǎng) 同種異體 T 細胞的刺激能力， 測定 泌 度。 結果 1. 聯合應用 激豬外周血單核細胞，可以獲得豬外周血單核細胞來源的 胞； 2. 質體介導的 染的最小最適的 度為 10 3. 與無義對照組相比，序列 1 和序列 2 干擾組 蛋白質表達水平下降 80%以上； 4. 測豬 表型為 6+； 摘要 激后 達有升高，而 列 1 和列 2 干擾后 6， 達降低； 5. 混合淋巴細胞反應中隨著混合細胞中刺激細胞的比例增加， T 細胞反應性逐漸增強， 最強；轉染 ，較之干擾前，刺激指數下降，T 細胞反應性下降，與 差異均具有統(tǒng)計學意義 ( 染后， 應分泌的 應分泌的 高，與 相比，差異具有顯著性（ in PS 按照刺激細胞：反應細胞 =1： 10 的比率進行 檢測上清液中 圖 圖 細胞因子檢測結果 第 3 章 豬 表型鑒定，免疫學功能檢測和體外成熟誘導 19 論 我們采用流式細胞術， 及相關細胞因子檢測來研究 表型特征和免疫學功能。通過流式細胞術檢測豬 面的白細胞抗原，發(fā)現豬達 低水平表達 分子，其免疫表型結果為 6+，符合豬 免疫表型特征 26, 30, 31。豬 表達 T 細胞， B 細胞以及 胞的表面標記分子。豬等動物的 以持續(xù)性檢測到低表達的單核 /巨噬細胞表面標志物 達的與否也使 別于存在于豬血液中的傳統(tǒng) C， 32。 人類被認為是單核 /巨噬系統(tǒng)而非 胞的特征性標記，但是研究發(fā)現，隨著 單核細胞被誘導成為 表達率有所下降。我們的結果顯示豬 激成熟以后 達比較恒定，并無明顯升高，但也有學者認為豬 達在成熟后降低 22。無論是 是 續(xù)性共表達是豬體外誘導培養(yǎng)的 大特 征。豬 人 著高度同源性33，我們用克隆號為 76單克隆抗體檢測到豬 定表達 到 熟刺激后表達無明顯增高 22。 （ ，即豬 類抗原。隨著培養(yǎng)時間的延長，表達 細胞比例逐漸增高。我們發(fā)現， 從 表達來看 多個峰，說明體外誘導 在異質性。 分類上被稱為豬的 是一種表達于髓系來源細胞的分子，存在于粒細胞和單核細胞分化階段的早期，在功能上代表信號調節(jié)蛋白（ , 34。在人和鼠等其他一些動物中， 認為與 激 T 細胞的能力有一定關聯，但在豬 否具有相同功能還有待進一步實驗證實 35。豬表達 c 和 些分子屬于 2 整合素，是細菌 使重要的細胞粘附功能 36。另外，豬 表達 者是 面表達的一種 37；后者則是一種 肌動蛋白聚合蛋白 38。 用 養(yǎng)出的 未成熟 C， 共刺激分子 表達，是研究 熟過程的良好模型 22, 39。我們用為成熟誘導劑對豬 體外進行成熟誘導，圖 10， 11 顯示，用 8 小時以后， 達無明顯改變， 子表達上調，也有人報道 熟后表達下調 28。 豬 因為他們在受到 6 的表達上調。 第 3 章 豬 表型鑒定，免疫學功能檢測和體外成熟誘導 20 例如， 膿桿菌 白，脂磷壁酸和肽聚糖； 配體 多聚尿苷酸（ 40, 41。 體對 最大作用是誘導其成熟，最直接的表現是有關抗原遞呈的表面分子如 類分子， 6的表達上調 ， 熟后， 子表達上調，而且從細胞內轉移到細胞表面， 但是 熟后刺激 T 細胞能力的增強并不僅僅取決于這些分 子表達的上調 42。 果表明， 激成熟的 未經成熟刺激處理的同時相 比，刺激 T 細胞增殖的能力更強，說明 導成熟的 導同種異體 T 細胞反應的能力更強大，我們發(fā)現當 T 細胞比例降至 1： 100時，仍然能觀察到 T 細胞明顯的免疫刺激作用。隨著 成熟，趨化因子受體表達和吞噬抗原的能力下降，而刺激 T 細胞增殖的能力增強，這些功能上的變化表明 攝取抗原逐漸過渡到提呈抗原的階段 41, 43。 成熟過程中，細胞表面的共刺激分子 有所升高，從而為激活 T 細胞提供必要的共刺激信號，我們的結果表明，豬 人類和小鼠等動物一樣，受到成熟刺激后，也會呈現共刺激分子表達上調， 刺激能力增強等反應。 與 刺激不同的 如 誘導 應細胞因子 應細胞因子有 0。有意思的是， 豬 刺激下均能同時誘導較強的 泌，因而所誘導的T 細胞反應并不偏向于 者 應，而我們 細胞因子檢測結果發(fā)現豬 成熟刺激 導后，成熟前后分泌 水平變化無顯著性差異 26。然而， 成熟和細胞因子應答也會受到免疫調節(jié)的影響。體內的不同環(huán)境和所遇到的不同刺激信號病原體而接受到的不同刺激信號，會具有多樣的反應性。體外實驗有時僅能模擬一部分體內的實際情況。同樣，我們在體外實驗所觀察到關于 結論，有時候可能在體內環(huán)境下不一定完全適用。 如果采用 僅以 以刺激豬 養(yǎng) 710天后產生豬骨髓來源的 胞（ 其免疫表型和生物學特性與 本相同 26，在受到 成熟刺激以后，共刺激分子和 子 表達上調，對同種異體 T 細胞增殖刺激能力增強，從比較動物學的觀點來看，與其他相動物類似 44。有所區(qū)別的是，豬血液中的 在于，其表型為 有特征性高表達的 子和 第 3 章 豬 表型鑒定，免疫學功能檢測和體外成熟誘導 21 6，如果繼續(xù)在體外培養(yǎng)，這些細胞的 共刺激分子表達將進一步明顯提高，并呈現明顯的樹突狀形態(tài) 19。豬皮膚來源的 高表達 和共刺激分子 6，但不表達 與豬的 型不完全一致 45。 我們的結果顯示用 外誘導 到的 型符合 征，與人類似，豬 受到 刺激發(fā)生成熟過程中 分子表達上調，趨化因子受體表達和吞噬能力下降，而刺激T 細胞增殖的能力增強。 第 4 章 構建和 染試驗 22 第 4 章 構建和 染實驗 料 胞 按照上文所述方法培養(yǎng)得到的豬 要實驗器材 玻璃制品： 各型 刻度吸管 、燒杯、燒瓶 塑料制品： 各型號移液器、 槍頭、 、 離心管、培養(yǎng)板、 培養(yǎng)皿、細胞計數板 儀器設備： 、 900HT (司 )、 普通 及倒置 顯微鏡 （ 水平式離心機 （ 司）、生物安全柜（ 司 ） 要實驗試劑 胎牛血清 2 司 250 M） 司 重組豬粒單系集落刺激因子（ 司 重組豬白細胞介素 司 青霉素 (10萬 U) 華北制藥公司 鏈霉素 (10萬 U) 華北制藥公司 克隆抗體 司 逆轉錄酶緩沖液 司 第 4 章 構建和 染試驗 23 司 司 5緩沖液 司 寡聚（ 2 司 度各為 x ) 司 法 構建 46 按照 用計算機軟件設計，委托上海吉瑪基因公司合成。 序列一： 5 - 3 ; 5 序列二： 5 5 無義對照： 5 5 脂質體轉染 1. 將雙鏈 5 M） 6 l 加入 無血清培養(yǎng)液 250 l 中 ,混合均勻； 2. 將 無血清培養(yǎng)液 250 3. 將稀釋后的 合均勻，在常溫下孵育 15分鐘； 4. 6孔培養(yǎng)板輕輕吸去原來的培養(yǎng)液，更換新鮮的 .5 5. 將 孔板的培養(yǎng)液中，輕柔第 4 章 構建和 染試驗 24 前后搖擺培養(yǎng)板 , 使混合均勻， 0 6. 將上述三組（干擾一組，干擾二組和無義對照組） 組設兩個復 孔， 48小時后 72小時后 擾后 白表達的檢測 離心收集懸浮的 06細胞，加入 1% 20 150 2 10 10 心吸取上清獲得蛋白裂解液。用標準蛋白曲線法測定蛋白質的濃度。調整至相同量蛋白質，加入 3 上樣緩沖液，煮沸 5分鐘，經干式電轉至 3% 脫脂奶粉過夜封閉。次日，加入一抗兔抗 1 1 000) , 小鼠抗 1 1 000) 常溫下孵育 1 3%脫脂奶粉洗膜 3次 , 每次 1015 溫下相應加入二抗，辣根過氧化物酶偶聯的抗兔 1 3 000) 常溫下孵育 1 h 以上 , 次 , 用化學發(fā)光 法或加入堿性磷酸底物顯色 , 進行 擾后 達的檢測 計數 5 106個細胞，加入 1照說明書的步驟提取總 用紫外分光光度法測定 88:1。以 3寡聚（ 2為引物， 反轉錄酶將 轉錄合成 時定量 應采用 x 900列分析儀上進行。具體的 應為：總體積 20 l，包括 x ) 10 l，引物 (10 m) l ，模板 5 l。 應分兩步：初始變性 95 C 10 秒，繼之為 95 C 5 秒， 60 C 30 秒共 40 個循環(huán)。用 18s 為陽性內對照。引物序列為： 5引物 3 引物 物采用羅氏應用科學提供的 件在線設計。 1、 細胞 110 7 2、 加 1 細胞用 1 第 4 章 構建和 染試驗 25 3、 勻漿（要徹底，后轉至 組織勻漿量 100 4、 顛倒混勻 10下，室溫 55、 加氯仿 1/5體積（ 必須按總體積的 1/5） 6、 顛倒混勻 10下，室溫 57、 4 ，離心 12000g， 158、 轉上層水相（約 400l ）于另一 中 9、 加等體積異 丙醇（約 400l ），混勻室溫 1010、 4 ，離心 12000g， 10棄上清 11、 加冰預冷的 75%乙醇（用 112、 4 離心 7500g， 5 13、 棄上清，空氣干燥 5能完全干燥） 14、 溶于 0l （ 10l （可在 55水中， （ 表 圖 第 5 章 干擾 誘導調節(jié)性 免疫調節(jié)作用 39 擾前后的 示 刺激細胞 :反應細胞 1:100 1:10 1:5 對照組 干擾 1 組 a 擾 2 組 b 隨著混合細胞中刺激細胞的比例增加， 漸增強， 最強；轉染 種反應性下降， 低。 擾前后的細胞因子檢測的結果 用 檢測 合淋巴細胞培養(yǎng)上清液中的細胞因子 分泌。 激后， 泌稍有增高，但與對照組相比，差異無顯著性（ P 染后， 泌增高，與對照第 5 章 干擾 誘導調節(jié)性 免疫調節(jié)作用 40 組相比，差異具有顯著 性（ P 圖 圖 圖 按照刺激細胞：反應細胞 =1： 10的比率進行 P 圖 按照刺激細胞：反應細胞 =1： 10的比率進行 擾組 P 第 5 章 干擾 誘導調節(jié)性 免疫調節(jié)作用 41 論 先天性免疫中的重要性在于 面的 于 識別，而族在 此識別過程中占據中心地位，是抗感染免疫反應中最重要的 特異性地識別病原相關分子模式 病原微生物進化中保守分子 , 如脂多糖 (肽聚糖、酵母多糖以及病原微生物的核酸等，通過誘導大量的趨化因子的分泌 , 以及上調趨化因子受體基因的表達，使免疫細胞快速而大量地向感染部位遷移；同時激活天然的免疫細胞，增強其吞噬和殺傷能力，在激活天然免疫中發(fā)揮重要作用 74, 75。另一方面， 能調節(jié)獲得性免疫， 噬抗原、共刺激分子的表達、 成熟、遷移至次級淋巴組織將抗原呈遞給初始T 細胞，激活初始 T 細胞等都受到 胞表面的 別的調控；而且抗原特異的 T 細胞激活并分化為效應細胞過程中需要的抗原肽 合物分子信號和共刺激分子信號也取決于 胞表面的 特定 識別。由此可見， 號傳導途徑是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁 76, 77。激活可以誘導很強的免疫應答反應，有利于機體 抗病原微生物感染或者組織損傷，但是過強的免疫反應也會導致許多不利影響，如產生自身免疫性疾病，內毒素休克，以及對移植物的排異反應等等。在穩(wěn)態(tài)條件下，機體存在 時地終止 信號，以避免過強的免疫反應，以免對機體造成不利的影響。 型跨膜蛋白，在抗感染免疫上有重要作用。 胞內區(qū)含有體同源區(qū)（ ,一保守結構， 號傳導通路上的許多蛋白質，如髓樣分化因子 88（ 8, 白介素 1受體相關激酶（ 腫瘤壞死因子受體相關因子 都具有 構域。 一種胞漿可溶性蛋白，結構上包括 N 端的死亡結構域 ( D) ,中間區(qū)域及 C 端的 共 3 個功能區(qū)域，是 究表明， 賴性信號轉導途徑是大多數 號傳導中的共同通路，其信號轉導的過程為 : 當 受體發(fā)生二聚化 , 構象改變，此時胞質中 構域與 C 端相互作用 , 端的 集下游同樣含死亡結構域的 致 身磷酸化 , 磷酸化的 離 合， 最終導致第 5 章 干擾 誘導調節(jié)性 免疫調節(jié)作用 42 和 激活，從而導致共刺激分子表達上調，并促使炎癥因子的分泌 78；另 外， ( 誘導型干擾素的分泌。因此， 號向下游傳導的重要的銜接分子 7, 78, 79。除了 外，所有的 可以通過 徑進行信號傳導，此信號通路稱為 信號通路是 依賴信號通路，通過另外的接頭蛋白 80。而 能通過 賴信號通路和 依賴信號通路這兩條途徑進行信號傳導 81。 巨噬細胞等抗原提呈細胞表面是表達 類最多的細胞，這些有識別 功能，例如 別革蘭氏陰性菌的脂多糖（ ， 別細菌 的 列。 分布尤為復雜，這也從側面反映了不同 群的相應功能。 活 T 細胞需要兩種信號：第一種是抗原肽 子復合物提供的抗原特異信號，第二種信號是 6 等共刺激分子提供的共刺激信號。已知第一種信號的提供與 密切關系；在抗感染免疫中，第二種信號主要也是由 供， 使 達共刺激分子 82。例如 經 進靜止 達 I、 膜分子，從而使 有這些處理和提呈抗原所必須的表面結構分子 , 促使 體刺激導致炎癥趨化因子受體如 調 , 而歸巢受體如 調，這樣有利于 遷移， 遷移過程中逐漸成熟，而 成熟對于其作為 刺激幼稚 T 細胞至關重要 83?？梢?， 號傳導途徑在調節(jié)成熟過程中發(fā)揮著重要的作用 84。 為 號傳導通路中的一個關鍵接頭蛋白，其功能缺陷不僅會導致許多 功能受損 7, 8，而且會令 成熟刺激不能產生相應的細胞因子。 使小鼠 導 對于 除小鼠 誘導了 應，這表明 子是調節(jié) 應和 應一個關鍵性的分子。一旦敲除了 子后，不能使該小鼠 導任何偏向于 反應，這證明了 于 作用需要通過 能起作用。 發(fā)現 陷將導致疫反 應缺陷 85，因為 除之 激下難以分泌 5 章 干擾 誘導調節(jié)性 免疫調節(jié)作用 43 而 誘導 應所需的細胞因子 86, 87。 用體內和體外實驗都證實了在 敲除的情況下， 過 號傳導通路誘導了 疫反應， 進一步實驗表明， 刺激 大量分泌 C 分泌，是誘導 應的強刺激劑），但是 敲除后小鼠 刺激下卻不能分泌 而 果補充外源性顯著增強該 泌 是無法逆轉 泌的高水平。這說明，盡管 是在抑制 C 所誘導的 應不單純是由促 胞因子分泌下降所導致的，此外可能還有別的機制 88。 根據 因序列的特點，我們設計 了針對 4 對 過預實驗篩選比較后我們選取了其中的兩對，即干擾一序列和干擾二序列。采用脂質體導入了針對 ，我們獲得了具有調節(jié)性 型的細胞，通過 而用 檢測 養(yǎng)上清液中的細胞因子（ 分泌，從而了解 擾后 免疫調節(jié)作用。從 看，顯增強了 同種異體 T 細胞的免疫刺激作用，而干擾后的 激 T 細胞增殖能力下降，說明 顯減弱了 這種刺激作用。而且，干擾后 泌上升，表明干擾后的導了 T 細胞由 應的偏移 89。與人和小鼠的 所不同88，我們的結果表明 能促進正常表達 豬 導 應，說明對于豬 說，依賴 信號傳導通路相對于 依賴的信號傳導通路并不更占據主導地位。但而當 子被干擾以后， 導了 應，說明依賴 子的信號傳導通路與非 子依賴的信號傳導通路這兩條通路之間存在一個很重要的動態(tài)平衡，抑制其中的一個通路的信號傳導， 另外一個通路就會占據主導地位。 在正常生理情況下，成熟 幼稚 T 細胞共同作用形成所謂的“免疫突觸”，并導致相應的細胞因子分泌 90, 91。已經有實驗證明通過阻斷 刺激分子 細胞刺激作用降低與細胞因子 92, 93。我們的結果說明，通過 術干擾豬 因，阻斷了號傳導途徑，抑制了 胞的成熟，其與同種異體反應性 T 細胞共同作用后的細胞因 子分泌被顯著改變。然而， 成熟和細胞因子應答也會受到免疫調節(jié)的影響。 族對于因在體內的不同環(huán)境和所遇到的不同病原體第 5 章 干擾 誘導調節(jié)性 免疫調節(jié)作用 44 而接受到的不同刺激信號，會具有多樣的反應性。體外實驗有時僅能模擬一部分體內的實際情況。同樣，我們在體外實驗所觀察到關于 結論，有時候可能在體內環(huán)境下不一定完全適用。 胞激活后究竟是向 應細胞抑或 應細胞方向分化在很大程度上取決于 及細胞所處的微環(huán)境，而不是 T 細胞本身的狀態(tài) 94。 C 采用何種方式誘導 T 細胞的免疫反應，例如大腸桿菌的 激 導 應；一種來自蠕蟲蟲卵的抗原能使 應 95, 96。此外， 成熟狀態(tài)對于誘導免疫反應方