【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）菊粉內(nèi)切酶基因克隆、表達(dá)及菊寡糖中試設(shè)計(jì)微生物學(xué)碩士論文

密級(jí) 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩士 學(xué)位論文 菊粉內(nèi)切酶基因克隆、表達(dá)及菊寡糖中試設(shè)計(jì) 891 F 891 要 菊粉是一種天然果聚糖，菊粉內(nèi)切酶能夠水解菊粉生成低聚果糖，低聚果糖是一種功能性食品添加劑，其保健作用體現(xiàn)在能夠降低血糖水平，促進(jìn)人體和動(dòng)物腸道的微生態(tài)平衡和提高免疫力等等。 利用微生物菊粉內(nèi)切酶可以一步法水解菊粉獲得 高達(dá) 80%的 低聚果糖 ，但是只有少數(shù)微生物產(chǎn)菊粉內(nèi)切酶，并且產(chǎn)酶量極低，從而造成分離純化困難，制約低聚果糖工業(yè)的發(fā)展。本研究的主要目的就是構(gòu)建菊粉內(nèi)切酶的工程酵母來(lái)高效表達(dá)菊粉內(nèi)切酶，為解決目前低聚果糖生產(chǎn)中的問(wèn)題提供有效的解決途徑。 本研究以黑曲霉 9891 的基因組 模板進(jìn)行 增獲得了編碼菊粉內(nèi)切酶的基因，并將它克隆進(jìn)表達(dá)載體 過(guò)酶切、 測(cè)序驗(yàn)證后，將重組表達(dá)載體 酶切線(xiàn)性化后電轉(zhuǎn)化到 組子通過(guò)營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。重組菊粉內(nèi)切酶在 實(shí)現(xiàn)了表達(dá)并在 7L 發(fā)酵罐中對(duì)其進(jìn)行了優(yōu)化表達(dá)研究，蛋白分泌量達(dá) 達(dá)產(chǎn)物的 析表明，蛋白質(zhì)分子量大小約為 59粉內(nèi)切酶的活性測(cè)定結(jié)果為 1501U/蔗糖為底物 ）和 291U/菊粉為底物），同原始供體菌株相比，分別高 105 倍和 273 倍，通過(guò)酶學(xué)特性研究顯示該酶反應(yīng)最適 適溫度是 55 。 同時(shí)還對(duì)菊粉內(nèi)切酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了模擬，得到了該蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)的初步信息。根據(jù) 泳和酶的功能性分析，證明目的蛋白已在 成功實(shí)現(xiàn)表達(dá)。且重組轉(zhuǎn)化子 891(傳穩(wěn)定性良好。 同時(shí)完成了中試生產(chǎn)線(xiàn)建設(shè)設(shè)計(jì)方案，包括菊粉 內(nèi)切 酶水解生產(chǎn) 菊粉 寡糖 的工藝設(shè)計(jì)；設(shè)備選型； 低聚 果糖工藝生產(chǎn)設(shè)備平面布置 初步方案等酶法生產(chǎn) 菊粉 寡糖 的生化工程的下游工作 。 鍵詞： 菊粉內(nèi)切酶， 黑曲霉 ， 巴斯德畢赤酵母， 菊粉 寡 糖， 中試工藝設(shè)計(jì) is a of of is as a of It an in as to to of of in to to so It be at 0% in by it of of to it is to to of is to of in to an to in of In is CR of NA 891 it is by is on of in a 7 of of mg/of is 9of 501 U/as 91 U/ml as 105 73 of of it 5 . At of is to is in 891(In of is of of by of of by of of of of 錄 第一部分 引 言 1 1 菊粉化學(xué) 1 2 菊粉內(nèi)切酶的研究進(jìn)展 3 3 菊粉內(nèi)切酶的應(yīng)用 5 4 達(dá)系統(tǒng) 7 5 問(wèn)題的提出與解決方案 10 6 本研究的目的和意義 12 第二部分 菊粉內(nèi)切酶的基因克隆及其在 的表達(dá) 13 1 材料 13 2 方法 16 粉內(nèi)切酶基因的克隆 16 組酵母的構(gòu)建 20 組酵母的產(chǎn)酶發(fā)酵 21 組酶的酶學(xué)性質(zhì)研究 23 解產(chǎn)物的 23 3 結(jié)果分析與討論 24 粉內(nèi)切酶基因的克隆 24 25 粉內(nèi)切酶的序列分析和高級(jí)結(jié)構(gòu)模擬 28 選與驗(yàn)證 34 35 組酶的酶學(xué)性質(zhì)研究 40 43 第三部分 菊粉寡糖中試生產(chǎn)工藝設(shè)計(jì)與產(chǎn)業(yè)化的前期研究 44 1 菊粉寡糖中試生產(chǎn)工藝設(shè)計(jì)方法 44 44 罐中發(fā)酵過(guò)程的模擬 45 45 46 2 產(chǎn)業(yè)化的前期研究方法 48 業(yè)化的原料 48 業(yè)化儀器設(shè)備選型 48 聚果糖工藝生產(chǎn)設(shè)備平面布置 50 第四部分 結(jié) 論 52 參考文獻(xiàn) 54 V 致 謝 60 作者簡(jiǎn)介 61 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一部分 引言 1 第一部分 引 言 菊粉內(nèi)切酶（ 以水解菊粉生成低聚果糖 （ 寫(xiě) ，利用微生物菊粉 內(nèi)切酶一步法水解菊粉可以獲得高純度的低聚果糖。低聚果糖除了有糖醇的功能外，其還具有 增殖 雙歧桿菌 、調(diào)節(jié)腸道功能，抑制內(nèi) 毒素 、 保護(hù)肝臟，調(diào)節(jié)脂肪代謝，不引起血糖波動(dòng)， 提高免疫力 、抗腫瘤 等功能，目前已被國(guó)際公認(rèn)為 具有 保健 功能的 甜味劑 。 1 菊粉化學(xué) 粉的分布 果聚糖（ 一類(lèi)由果糖苷和果糖連接組成的長(zhǎng)鏈碳水化合物，其分子結(jié)構(gòu)和分子量各不相同，廣泛分布的在單子葉、雙子葉和綠色藻類(lèi)中，有三種不同形式 （ 990; 993） ， 它們分別為：菊粉（ 左旋果聚糖（ 革蘭明糖 （ 。其中菊 粉 是由呋喃果糖以 旋果聚糖以 革蘭明糖則是 -(2,1)和 -(2,6)鍵兩種連接方式都有。菊粉又稱(chēng)菊糖，它是一類(lèi)天然果聚糖， 1804 年德國(guó)科學(xué)家 次從旋復(fù)花屬 （ 土木香（ 莖中提取得到 一種 果聚糖 ， 1818年 其命名為菊粉。 菊粉在自然界中的分布十分廣泛，其主要來(lái)源是植物。在雙子葉植物中的菊科、龍膽 科、橘梗科等科和單子葉植物的百合科、禾本科中的很多植物都含有菊粉（見(jiàn)表 1 表 1要含菊粉的植物及其菊粉含量 he 源 組織分布 菊粉含量（濕重） /% 菊芋 (.) 塊莖 15苣 (.) 根莖 15麗花（ 塊莖 15馬夏（ 球莖 12公英 (花瓣 12蒜 (球莖 9筍 (嫩芽 10羅門(mén)參 (根莖 4鮮薊 (葉子 3蔥 (球莖 2蒡 (根莖 國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一部分 引言 2 某些真菌和細(xì)菌中也含有菊粉，例如在假單胞菌類(lèi)（ 腸細(xì)菌類(lèi)（ 鏈狀球菌類(lèi)（ 放線(xiàn)菌類(lèi)（ 芽孢桿菌類(lèi)（ 乳酸桿菌類(lèi)（ 中就發(fā)現(xiàn)有菊粉的存在。 粉的結(jié)構(gòu)特征 菊粉是由呋喃果糖以 還原性末端連接一個(gè)葡萄糖殘基 （ 1951） ，為線(xiàn)性直鏈結(jié)構(gòu)。其 聚合度 及 平均 分子量大小與不同 的植物來(lái)源 、 收獲季節(jié) 、氣候、土壤以及生產(chǎn)加工過(guò)程 有關(guān)。 標(biāo)準(zhǔn) 菊粉 的 聚合度為 2 60，其平均聚合度為 10 12， 長(zhǎng)鏈菊粉的平均聚合度為 25。 菊粉 分子式可以用 示，其中 G 為 菊粉 還原性末端連接 的 一個(gè)葡萄糖 分子 ， F 代表果糖分子， n 則代表果糖單位數(shù)。 在 20 世紀(jì) 60 年代，人們開(kāi)始了對(duì)菊粉物理化學(xué)結(jié)構(gòu)的研究， 1965 年提出菊粉分子物理化學(xué)結(jié)構(gòu)為 1977 年 為菊粉分子的最佳結(jié)構(gòu)為11980 年 通過(guò) 5 個(gè)折疊螺旋環(huán)，每?jī)蓚€(gè)螺旋環(huán)相隔 中 4 個(gè)折疊螺旋環(huán) 為 右手螺 旋，剩余的一個(gè)折疊螺旋環(huán)為左手螺旋。 在 1988 年利用小角度激光掃描并結(jié)合排阻色譜和動(dòng)態(tài)光束掃描等技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)菊糖晶體為桿狀體，最小結(jié)構(gòu)單元 為 平均直徑）；同年 過(guò)計(jì)算機(jī) 序模擬了菊糖 為菊糖分子結(jié)構(gòu)理論上為右手螺旋結(jié)構(gòu)，但多數(shù)研究者認(rèn)為實(shí)際存在形式可以是左手 螺旋 也可以是右手螺旋。 1996年 通過(guò) 糖溶液和乙醇按 1:4 比例在 55 制備單晶體，然后借助 透射電子顯微鏡和 3D 電子衍射證明：在室溫下菊糖晶體呈半 水合狀態(tài)，空間構(gòu)造為正菱形結(jié)構(gòu)，并結(jié)合 6 個(gè)水分子， 其 單元參數(shù)分別為 a=b=c=(認(rèn)為菊糖鏈為 6折疊螺旋環(huán)而不是 在 1980 年 人報(bào)道的 5 折疊螺旋環(huán)結(jié)構(gòu)； 其 由 2 個(gè)反 向 平行的 6折疊螺旋環(huán)圍繞晶體單元的 2 個(gè)折疊螺旋軸組成，結(jié)構(gòu)特征為 =660， =1540， =子衍射數(shù)據(jù)表明菊粉最佳的分子模型為 R= R= R 為晶體殘余因子），而菊粉分子在水合狀態(tài)下， a=b=c= R= R=并且結(jié)合的水分子數(shù)為 12個(gè)。 粉的 物化 性質(zhì) 粉的水溶性 菊粉易溶于熱水，微溶于冷水 ，其溶解度隨溫度升高而增加 。在 10 時(shí)其溶解度為 6%，加熱可以促進(jìn)菊粉溶解，在 80 時(shí)可以完全溶解。菊粉有 -,們的水溶性差異是由分子內(nèi)和分子間氫鍵引起的，譬如 D. I. et 1996） 。 另外 ，菊粉溶于水時(shí)，可以使水的冰點(diǎn)下降、沸點(diǎn)升高。 粉的粘度 菊粉溶液粘度會(huì)隨其濃度增加而增大，隨著溫度的升高而降低。菊粉分子相互交聯(lián)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，當(dāng)菊粉溶液濃度達(dá)到 10%， 經(jīng)過(guò)高剪切作用或 加熱 冷卻過(guò)程，菊粉逐漸形成微粒凝中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一部分 引言 3 膠網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，具有脂肪的滑潤(rùn)口感，成為有效的模擬脂肪。 粉的穩(wěn)定性 菊粉具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，在 100 加熱也不易分解，在 3 且高溫條件下可以被水解；凝膠狀態(tài)下的菊粉因?yàn)槿狈梢越Y(jié)合的自由水而非常穩(wěn)定。 粉的保濕性 菊粉吸濕性強(qiáng)而具有較好的保 濕性，可以降低水份活度，這種特性可以應(yīng)用到食品加工中延緩食品水份的蒸發(fā)，防止食品變味，以此延長(zhǎng)食品貨架期和保質(zhì)期。 2 菊粉內(nèi)切酶的研究進(jìn)展 菊粉的合成代謝依賴(lài)于果糖轉(zhuǎn)移酶，菊粉的分解代謝依賴(lài)于菊粉酶。菊粉酶（ 能夠水解 是一種 誘導(dǎo) 酶 ， 學(xué)名為 于 菊粉酶 不僅能催化蔗糖水解 ， 而且能快速將菊粉水解成果糖。根據(jù)菊粉酶來(lái)源不同的可以將其分為微生物來(lái)源菊粉酶和植物來(lái)源菊粉酶 ； 根據(jù)微生物來(lái)源菊粉酶分泌方 式不同又可分為胞內(nèi)酶、胞外酶和胞壁結(jié)合酶 ； 根據(jù)菊粉酶酶切果聚糖鏈的方式分為菊粉內(nèi)切酶（ 菊粉外切酶 （ ，其中菊粉內(nèi)切酶催化水解菊粉的產(chǎn)物為低聚果糖，而菊粉外切酶則是催化從菊粉末端切下果糖基形成 粉內(nèi)切酶的微生物來(lái)源 現(xiàn)已有文獻(xiàn)報(bào)道產(chǎn)菊粉內(nèi)切酶的微生物包括真菌、酵母菌、放線(xiàn)菌和細(xì)菌。 表 1粉內(nèi)切酶的微生物來(lái)源 he 株 文獻(xiàn) 真菌 黑曲霉 . et 1978 黑曲霉 . et 1989 青霉 . et 1977 青霉 . et 1988 酵母菌 10 王艷等， 2001 放線(xiàn)菌 婁徹氏鏈霉菌 87 et 1989 細(xì)菌 黃假單孢菌 et 1999 假單孢菌 et 1997 節(jié)桿菌 . et 1987 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一部分 引言 4 粉內(nèi)切酶酶學(xué)性質(zhì) 來(lái)源于 et 1997）的菊粉內(nèi)切酶，其只作用于菊粉而不作用于蔗糖 和 棉子糖；純化酶 為 ， I/S 值無(wú)窮大；酶蛋白分子量為 68最適酶反應(yīng)溫度為 50 ，最適 源于 菊粉內(nèi)切酶分子量為64為 酶 I/S 值為 50，純化酶 I/S 值高達(dá) 4140；其水解菊粉的特點(diǎn)是隨著 低， 大， 降；最適反應(yīng) 且在 范圍內(nèi)相當(dāng)穩(wěn)定，在 55以下穩(wěn)定性很好，高于 55 穩(wěn)定性很差。 C， 1990）來(lái)源的菊粉內(nèi)切酶的分子量為 m 值為 1，不水解蔗糖。 et 1978）純化菊粉內(nèi)切酶分子量為 54水解菊粉，對(duì)蔗糖無(wú)作用，最適溫度為 45 ， 50 以上酶開(kāi)始失活， 80 時(shí)完全失活，最適 為 來(lái)源于 . et 1987） 的菊粉內(nèi)切酶其粗酶液經(jīng)硫酸銨沉淀和顯示兩個(gè)峰，其中一個(gè)峰用 l 脫，水 解菊粉為低聚果糖和果糖，另一個(gè)峰用 脫水解菊粉只產(chǎn)低聚果糖， 為 l。酶反應(yīng)最適 為 適溫度為 50 ；在 圍內(nèi)或 30的溫度范圍內(nèi)該酶較穩(wěn)定，最大酶活可 達(dá) 80%以上。 表 1屬離子和其它化合物對(duì)酶活性的影響 he of on 源 激活作用 抑制作 用 文獻(xiàn) 、對(duì)高氯汞苯甲酸、溴代琥珀酰胺、碳二亞胺 et 1997 、 C， 1990 . et 1987 87 et 1989 10 +、 王艷等， 2001 粉內(nèi)切酶的基因克隆 菊粉內(nèi)切酶通常具有 5 個(gè)保守序列，它們分別是： ， ， ， ， 。 青霉 菊粉 內(nèi)切酶有兩種類(lèi)型，其中一種類(lèi)型是來(lái)源于菊粉內(nèi)切酶，其 N 端序列為 另 一種類(lèi)型是來(lái)源于 菊粉內(nèi)切酶，它的 N 端序列為上述兩個(gè) 來(lái)源于 青霉 的菊粉 內(nèi)切酶 N 端序列中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一部分 引言 5 中，都存在 酶活性中心功能基團(tuán)。 C， 1990）的菊粉內(nèi)切酶的酶活性中心有 端序列為 其它微生物菊粉內(nèi)切酶的 N 端序列相比沒(méi)有序列相似性。 粉內(nèi)切酶的基因結(jié)構(gòu) 粉內(nèi)切酶基因 1548碼 5151信號(hào)肽， G+ et 1988） 。 粉內(nèi)切酶基因 24391A 為信號(hào)肽，成熟酶蛋白 759其它微生物來(lái)源的菊粉酶多 135y. et 1996） 。黑曲霉內(nèi)切菊粉酶有兩種基因 度均為 1548碼 516 1 23信號(hào)肽，不含內(nèi)含子，二者間有 8 個(gè) 同，二者 G+C 別為 54%和 無(wú)花果曲霉菊粉內(nèi)切酶基因 1551碼 4921信號(hào)肽，與 切酶之間序列同源性高達(dá) 粉內(nèi)切酶的基因表達(dá) 解菊粉形成低聚糖產(chǎn)量達(dá) 78%，但是胞內(nèi)表達(dá)的原核表達(dá)系統(tǒng)普遍存在 著 分離純化困難 （ im et 1997） 。 (1998)將黑曲霉菊粉內(nèi)切酶基因 宿主菌、構(gòu)造表達(dá)載體 表達(dá)初步研究表明， 蛋白表達(dá)量很低，幾乎檢測(cè)不到。 （ 1999）將 4因工程菌，只產(chǎn)內(nèi)切酶，不產(chǎn)外切酶 ， 但表達(dá)水平很低。 3 菊粉內(nèi)切酶的應(yīng)用 聚果糖的功能 菊粉內(nèi)切酶可以水解菊粉生成低聚果糖，它可以 作為 功能性食品和飼料添加劑。它是理想的蔗糖替代品，除了有糖醇的功能外，其還具有以下幾個(gè)方面的功能。 殖 雙歧桿菌 、 調(diào)節(jié)腸 道 功能 測(cè)定了 雙歧桿菌 、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌和大腸桿菌的特定生長(zhǎng)速率，他們發(fā)現(xiàn)即使在純培養(yǎng)條件下， 低聚果糖 也比葡萄糖更能促進(jìn) 雙歧桿菌 的增殖。 低聚果糖對(duì)雙歧桿菌具有增殖作用 （ R, R, , et 1995） 的 機(jī)理是低聚果糖優(yōu)先被雙歧桿菌利用，產(chǎn)生醋酸鹽和乳酸鹽，降低了腸道內(nèi)的 ，從而抑制了有害菌如沙門(mén)氏菌、李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸菌群等的生長(zhǎng)。通過(guò)促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)來(lái)維持人體和動(dòng)物體腸道的微生態(tài)平衡，調(diào)節(jié)腸道功能，預(yù)防結(jié)腸癌 。 低聚果糖在腸道內(nèi)可以自身發(fā)酵成丁酸鹽能刺激結(jié)腸黏膜細(xì)胞的生長(zhǎng)，提高腸黏膜的吸收能力 （ .， 1994） 。 節(jié)脂肪 代謝 低聚果糖在腸道內(nèi)可以自身發(fā)酵成短鏈脂肪酸（醋酸鹽和丙酸鹽），抑制膽固醇的合成，還可降 低熱量及血液中膽固醇和 甘油 三酯的含量 （ L, , A, et 1998） ，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一部分 引言 6 可用來(lái)預(yù)防心 血 管病和高膽固醇病。 進(jìn)礦物 元素的 吸收 低聚果糖能大大提高 對(duì) 礦物質(zhì)的吸收 （ , , , et 1994） 。其在消化道 內(nèi) 能結(jié)合金屬離子 ， 形成的復(fù)合物在發(fā)酵 過(guò)程 中被降解，釋放出礦物元素 ，因而使金屬離子得到有效的吸收。另外，由發(fā)酵所產(chǎn)生的酸 類(lèi) 可以 降低結(jié)腸的 1許多礦物質(zhì)的溶解度 生物有效性（如磷酸鈣）大大的提高 （ , R, A, et 1992） 。 低血糖 低聚果糖是一種不會(huì)導(dǎo)致血液和尿液中葡萄糖升高的碳水化合物。它在腸道的上部不會(huì)被水解成單糖，因而不會(huì)升高血糖水平和胰島素含量 （ R.， 1999） ，適于糖尿病患者食用。最近研究表明，空腹血糖的降低是低聚果糖在結(jié)腸發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸的結(jié)果。 制內(nèi)毒素、保護(hù)肝臟 雙歧桿菌 發(fā)酵低聚果糖，產(chǎn)生短鏈脂肪酸（主要是醋酸和丁酸），從而抑制外源致病菌和腸道內(nèi)腐敗細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，減少這些細(xì)菌產(chǎn)生的毒胺、吲哚、氨、硫化氫等致癌物對(duì)機(jī)體的損害，延緩機(jī)體衰老過(guò)程。攝入低聚果糖減少有毒代謝產(chǎn)物的形成，這大大減輕了肝臟分解毒素的負(fù)擔(dān)。 除上述功能以外， 低聚果糖可以激發(fā)免疫活性，促進(jìn)殺死腫瘤細(xì)胞的巨噬 細(xì) 胞的產(chǎn)生， 增加人體免疫功能，有抗腫瘤作用 （ S, , V.， 1997； A, D, K.， 2003） 。 也可以將菊粉水解產(chǎn)物膨化作為功能性飼料添加劑，具有相同的增殖雙岐桿菌作用， 具有 增加家禽的抗病能力 的 功效，被稱(chēng)為原生素（ 國(guó)內(nèi)曾有在產(chǎn)蛋雞飼料中添加低聚果糖生產(chǎn)無(wú)沙門(mén)氏桿菌雞蛋的報(bào)道。 聚果糖的應(yīng)用前景 功能性低聚糖產(chǎn)品于 1998 年在日本市場(chǎng)推出，歐洲在 90 年代初開(kāi)始發(fā)展， 我國(guó)在 2000 年已有商品上市，包括低聚異麥芽糖、低聚果糖、大豆低聚糖等，低聚木糖和木蘇糖也已完成中間試驗(yàn)。 低聚果糖由菊粉酶解或蔗糖酶轉(zhuǎn)化制成。歐洲市場(chǎng)大量產(chǎn)品是菊粉酶解產(chǎn)品，日本則以蔗糖酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)，我國(guó)也是蔗糖酶轉(zhuǎn)化。歐盟將低聚果糖批準(zhǔn)為食品配料，而不是食品添加劑。加拿大、澳大利亞、新西蘭 、 以色列等國(guó)家均批準(zhǔn)為食品配料，允許在食品標(biāo)簽上注明有雙歧桿菌增殖作用。美 國(guó) 、英 國(guó) 、法 國(guó) 、德 國(guó) 、澳大利亞以及臺(tái)灣都已生產(chǎn)含有菊糖及低聚果糖的食品?，F(xiàn)已應(yīng)用于乳制品、乳酸菌飲料、固體飲料、糖果、餅干、果凍和冷飲等多種食品， 特別是保健食品和老年食品中，約有 200 多個(gè)品種。并可作為填充劑，質(zhì)構(gòu)改良劑，風(fēng)味掩蓋劑和脂肪替代品應(yīng)用于食品中。 目前用菊粉水解制備超高果糖漿或結(jié)晶果糖作為強(qiáng)力甜味劑，已越來(lái)越 受 到國(guó)內(nèi)外的重視。日本、美國(guó)、法國(guó)、英國(guó)等工業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家已開(kāi)發(fā)出用菊粉一步水解制備超高果糖的工藝技術(shù)并應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。目前合成技術(shù)在不斷完善提高，其研究重點(diǎn)是尋找性能優(yōu)良的產(chǎn)菊粉酶的菌種和 各種水解工藝技術(shù)等。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一部分 引言 7 目前世界上菊粉及以其為原料生產(chǎn)的低聚果糖超過(guò) 10 萬(wàn)噸，進(jìn)口菊粉的售價(jià)約為 4 萬(wàn)元 /噸。我國(guó)菊粉及低聚果糖開(kāi)發(fā)相對(duì)較晚，目前國(guó)內(nèi)低 聚果糖的年生產(chǎn)能力約為 3000，據(jù)推算，我國(guó)目前低聚糖的市場(chǎng)容量約為 1噸 /年，預(yù)計(jì) 2008 年國(guó)內(nèi)市場(chǎng)將達(dá)到 8 萬(wàn)噸。 4 達(dá)系統(tǒng) 酵母是一類(lèi)種類(lèi)繁多的生物資源，已知有 80 個(gè)屬約 600 多種，數(shù)千個(gè)分離株。 1978 年將來(lái)自于一株釀酒酵母的 因?qū)氲搅硪恢赆劸平湍?，用以?lái)互補(bǔ)后一株釀酒酵母的 陷 ,這標(biāo)志著酵母表達(dá)系統(tǒng)的建立。早在 20 世紀(jì)初人們已經(jīng)開(kāi)始認(rèn)識(shí)甲基營(yíng)養(yǎng)酵母， 1969年 現(xiàn)酵母可以利用甲醇的事實(shí)，此后人們發(fā)現(xiàn)幾種可以 在甲醇上生長(zhǎng)的酵母，其中包括：畢赤酵母屬 )、 漢遜氏酵母屬 )、 假絲酵母屬 )和 球擬酵母屬 )。 一種工業(yè)用甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母，它是一種可以高效表達(dá)外源蛋白的宿主菌(et 1998；李艷等， 2001)。 達(dá)系統(tǒng)利用緊密控制的甲醇誘導(dǎo)啟動(dòng)子控制基因表達(dá)。葡萄糖和甘油抑制乙醇氧化酶和二羥丙酮合成酶的調(diào)節(jié)區(qū)域，碳源限制情況下，乙醇氧化酶抑制解除而二羥丙酮合成酶 受到抑制，在甲醇中兩種酶均被充分誘導(dǎo)表達(dá)。重組 以在限制性基本培養(yǎng)基上進(jìn)行外源蛋白的生產(chǎn)， 失型菌株通常以分批方式培養(yǎng)，因?yàn)檫@類(lèi)菌株在甲醇上生長(zhǎng)極其緩慢，在 點(diǎn)有插入表達(dá)體的菌株采用連續(xù)方式進(jìn)行培養(yǎng)。 已經(jīng)用 達(dá)了許多胞內(nèi)及分泌型蛋白，對(duì)于不同的蛋白質(zhì)，表達(dá)水平從 1%至35%各不相同，對(duì)于大多數(shù)蛋白質(zhì)生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，隨著發(fā)酵規(guī)模的放大，細(xì)胞的密度的增長(zhǎng)呈線(xiàn)性放大，而發(fā)酵的時(shí)間則縮短。在一般情況下，胞內(nèi)蛋白質(zhì)溶于簡(jiǎn)單的緩沖液，并且具有較好的 生物活性。 達(dá)系統(tǒng)的研究 醇誘導(dǎo)調(diào)節(jié)序列 用 達(dá)外源蛋白的研究主要集中在建立以甲醇誘導(dǎo)啟動(dòng)子作乙醇氧化酶啟動(dòng)子的質(zhì)粒的構(gòu)建，同時(shí)也分離、克隆了一種編碼分子量為 76 000 蛋白質(zhì)的甲醇調(diào)節(jié)基因 。 研究發(fā)現(xiàn)這些基因的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄調(diào)控，乙醇氧化酶的上游序列與面包酵母的轉(zhuǎn)錄和翻譯啟動(dòng)子相似。 乙醇氧化酶的甲醇調(diào)控基因和二羥丙酮合成酶基因在表達(dá)載體上協(xié)調(diào)作用使外源蛋白在表達(dá)。 動(dòng)子是從 因組中分離出的大小為 1 000 一個(gè)基因片段，該片段直接置于乙醇氧化酶結(jié)構(gòu)基因之前。 種甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母作為外源基因表達(dá)的宿主菌株 （戴秀玉， 1997） ，其兼有原核細(xì)胞良好的可操作性和真核系統(tǒng)的翻譯后加工的雙重特點(diǎn)，并且發(fā)酵條件簡(jiǎn)單，適宜高密度培養(yǎng)，是外源基因表達(dá)的理想宿主。 氨酸脫氫酶突變體，它是常用的表達(dá)宿主菌。該突變菌 株是以亞中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一部分 引言 8 硝基誘變后產(chǎn)生的。 研究了缺失甲醇代謝的 因被破壞后產(chǎn)生的 株在甲醇中生長(zhǎng)緩慢；采用同樣的方法得到一株突變菌 菌株的 時(shí)被破壞，不含乙醇氧化酶，其不能在甲醇上生長(zhǎng)。 達(dá)載體 用于 達(dá)外源蛋白的載體包括來(lái)源于 用于篩選和維持的 母用于控制外源基因表達(dá)、選擇及某些情況下染色體整合的 列?，F(xiàn)已有兩種基本的表達(dá)載體，一 種是 用于自動(dòng)復(fù) 制，另一 種是 用于在酵母乙醇氧化酶位點(diǎn)整合。 這 兩 種 載體均具青霉素抗性基因及來(lái)自質(zhì)粒 復(fù)制起始區(qū)，另外，還有來(lái)自細(xì)菌的非編碼區(qū)基因連接在 匹配序列中 ，其長(zhǎng)度不超過(guò) 300 利用從乙醇氧化酶（ 因分離出的控制序列， 表達(dá)了很多外源蛋白；另外，研究表明 動(dòng)子在甲醇誘導(dǎo)表達(dá)生產(chǎn) 從 構(gòu)基因上游分離的 300因插入的 隆位點(diǎn)，它由一個(gè)合成的連接頭提供的含有單一 點(diǎn)的多接頭載體也已開(kāi)發(fā)出來(lái)，方便了各種不同末端的基因的插入。 自主型載體，如， 從 P. 因中分離的自主復(fù)制序列，含 因的自主質(zhì)粒經(jīng)數(shù)代培養(yǎng)后可以自動(dòng)存在，然后自發(fā)結(jié)合到 基因組中，這是一種在插入位點(diǎn)無(wú) 除的 入技術(shù)，是非常穩(wěn)定的。另外，自主型載體的 因的 制位點(diǎn)可定點(diǎn)插入外源基因，該克隆株表現(xiàn) 出 很高的穩(wěn)定性。例如鏈激酶基因在其自身的啟動(dòng)子作用下于 表達(dá) ,基因表達(dá)不穩(wěn)定 ， 而 存在鏈激酶分子的翻譯后斷裂 。 而將刪除信號(hào)序列的鏈激酶基因插入自主型質(zhì)粒 ， 轉(zhuǎn)化后經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后 ,載體自主地整合到 P. 因組 ， 從而得以穩(wěn)定保持 ,并且 產(chǎn)生的鏈激酶可以與抗體發(fā)生反應(yīng) ，跡及生化分析表明 ， 其特異活性與天然狀態(tài)的蛋白相同 。 最常見(jiàn)的結(jié)合載體 P. 第 二代表達(dá)載體，這種載體以外源基因取代 et 1992;001)。它和自主載體的不同之處在于：在 點(diǎn)發(fā)生同源重組必須無(wú) 列，并且需要有大約 1000 3 列。用 消化環(huán)狀載體后可得到含有 縱序列、外源基因、用于篩選的 因和一個(gè)較長(zhǎng)的 3域的基因盒，可將該線(xiàn)性基因盒插入 P. 株，得到 轉(zhuǎn)化體。 5% 轉(zhuǎn)化 子 出 在 甲醇 為唯一碳源的培養(yǎng)基 上 表現(xiàn)出 低生長(zhǎng)，表明表達(dá)體中外源表達(dá)基因取代了 因。其余轉(zhuǎn)化 子 是 表 型 ( et 1989)，甲醇上可生長(zhǎng)正常，表明外源表達(dá)體隨意結(jié)合于基因組上。在 破壞的菌株中，由于存在第二種乙醇氧化酶（ 得菌株有 10%乙醇氧化能力，因而可在甲醇中維持低速生長(zhǎng)。 擇性標(biāo)記 P. 母表達(dá)系統(tǒng)可以利用兩類(lèi)篩選標(biāo)記，一類(lèi)是營(yíng)養(yǎng)缺陷選擇標(biāo)記，包括 中 常用的篩選標(biāo)記，另一類(lèi)是顯性選擇標(biāo)記，如 。 從野生型 P. 株 分 離得到 因，將其插入表達(dá)載體，作為組氨酸 營(yíng)養(yǎng) 缺陷型突變體 選擇性標(biāo)記， 釀 酒酵母的 因與 的組氨酸突變互補(bǔ)，可中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一部分 引言 9 作為這種菌株的最初特性，是第一代 P. 體的選擇性標(biāo)記。 研究發(fā)現(xiàn) 來(lái)源于 釀 酒酵母 的編碼蔗糖酶的 因可作為 重要選擇性標(biāo)記。帶有 蔗糖酶 基因的 母可在蔗糖上生長(zhǎng)，而野生型的 卻不能生長(zhǎng)。 只有當(dāng)染色體上結(jié)合了這種基因后，才能獲得穩(wěn)定的可以在蔗糖上生長(zhǎng)的菌株 ，所以可以