【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）棉花恢復(fù)系幼蕾cDNA文庫構(gòu)建及發(fā)育相關(guān)基因的克隆生物化學(xué)與分子生物學(xué)碩士論文

密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 棉花 恢復(fù)系 幼蕾 庫構(gòu)建及 發(fā)育 相關(guān)基因的克隆 of of 摘 要 棉花是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，如何高效地利用棉花雜種優(yōu)勢成為當(dāng)今世界棉花育種關(guān)注的焦點(diǎn)之一，三系是培育棉花雜交種 、利用雜種優(yōu)勢非常有效的途徑，能夠 產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益 。 但是由于恢復(fù)系資源狹窄，強(qiáng)優(yōu)勢三系組合較少， 如果 能夠通過基因 克隆 技術(shù) 得到使棉花 具有恢復(fù)能力 的相關(guān)基因，進(jìn)一步 獲得工程恢復(fù)系，對擴(kuò)大恢復(fù)系資源、擴(kuò)大三系雜交種的應(yīng)用具有非常重要的意義。 本研究以高產(chǎn)抗蟲三系雜交棉恢復(fù)系為材料，該恢復(fù)系 聚合了來源于哈克尼西棉的恢復(fù)基因和來源于陸地棉的恢復(fù)加強(qiáng)基因， 構(gòu)建其幼蕾 篩選可育系和不育系差異表達(dá)基因，獲得如下結(jié)果： 1. 以棉花恢復(fù)系 3 5 天幼蕾為材料， 改進(jìn) 熱硼酸 /蛋白酶 K 法 沉淀 用量，選用 和改進(jìn)的熱硼酸 /蛋白酶 K 法提取總 過比較表明熱硼酸 /蛋白酶 K 法是提取棉花幼蕾 適宜方法，該法提取的棉花幼蕾總 整性較好，純度較高， 觀沒有任何顏色，棉酚褐化現(xiàn)象得到很好的抑制。 2. 從棉花恢復(fù)系幼蕾總 純化出 構(gòu)建棉花恢復(fù)系幼蕾 庫， 最終獲得的未擴(kuò)增文庫約含克隆子 106，重組率約為 92%，平均插入片段大小為 文庫擴(kuò)增后，獲得的文庫滴度為 109 滿足基因表達(dá)和克隆研究的要求。 3. 根據(jù)三系雜種 和不育系抑制差減獲得的大小為 380其兩端設(shè)計引物，初步篩選棉花恢復(fù)系幼蕾 庫，獲得了 1 個陽性克隆。對該陽性克隆子進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)： （ 1） 該基因外源插入片 段 長為 1462 源序列比較分析發(fā)現(xiàn)，該片段序列與陸地棉纖維 庫中得到的 8%。與雜交稻中得到的 9%。在開花期一天的纖維中、三周的陸地棉組織及擬南芥中得到的 是這些 （ 2） 該基因序列中 135 1343 區(qū)域?yàn)橐粋€ 完整的編碼序列，在序列開始有起始密碼子（ 于末端有終止密碼子 (全長 1209編碼 402個氨基酸。 （ 3） 氨基酸序列比較分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的蛋白序列與番茄中的轉(zhuǎn)座酶（ 有 98%的同源性。因此，暫命名為： 綜合以上結(jié)果及文獻(xiàn)推測，本實(shí)驗(yàn)分離到的基因可能與棉花幼蕾發(fā)育以及可能因轉(zhuǎn)座行為引起的育性相關(guān) 。 關(guān)鍵詞 ：棉花幼蕾，基因， 庫 is an in to of s is an to of of by is it is to of In to be is of of as 1. 5 s as by NA by 2. of 06of 2% of of 09 be to 3. 2 SH an ST A of to A by CR of as (1) of 426by ST 8% to SH 9% to it s 3 of t (2) An RF is 351343bp 209an a GA a 02 (3) of by is 8% We a of to to 目 錄 第一章 文獻(xiàn)綜述 . 1 . 1 通 庫 . 1 長 庫 . 4 何從微量樣品中構(gòu)建 . 6 高 庫構(gòu)建效率的新方法 . 6 建 庫的載體系統(tǒng) . 7 . 8 . 8 . 11 . 13 物生殖發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的研究進(jìn)展 . 14 胞核雄性不育 (因 . 14 胞質(zhì)雄性不育 (因 . 15 物細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的研究進(jìn)展 . 18 花細(xì)胞質(zhì)雄性不育的研究進(jìn)展 . 20 花 幼蕾發(fā)育相關(guān)基因的克隆策略 . 21 建基因表達(dá)的 . 22 制差減雜交 . 22 第二章 棉花恢 復(fù)系幼蕾 . 25 . 25 . 25 儀器及藥品處理 . 26 法 . 26 果與分析 . 40 花恢復(fù)系幼蕾總 . 40 . 42 入片段的初步檢測和重組率的測定 . 43 部文庫的擴(kuò)增 . 44 結(jié) . 46 第三章 棉花恢復(fù)系幼蕾發(fā)育相關(guān)序列的初步篩選 . 47 料與方法 . 47 料 . 47 法 . 47 . 49 花恢復(fù)系幼蕾發(fā)育相關(guān) . 49 切鑒定陽性克隆 . 49 花幼蕾中特異性表達(dá)基因序列分析 . 50 結(jié) . 56 第四章 討論 . 57 高 . 57 格防止 染，并設(shè)法抑制其活性 . 57 證 . 57 . 57 長 . 59 粒體的質(zhì)粒樣 . 59 第五章 結(jié)論 . 61 創(chuàng)新點(diǎn) . 62 參考文獻(xiàn) . 63 致謝 . 68 作者簡歷 . 69 英文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 那霉素 芐青霉素 碳酸二乙酯 二醇雙 (2四乙酸 乙烯吡咯烷酮 二烷基磺酸鈉 二胺四乙酸 血清白蛋白 硫蘇糖醇 EB 化乙錠 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 胞核雄性不育 胞質(zhì)雄性不 育 達(dá)序列 家生物信息中心 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 1 第一章 文獻(xiàn)綜述 從 20 世紀(jì) 70 年代開始，由于限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)以及質(zhì)粒等載體的應(yīng)用，推動了 外重組技術(shù)的發(fā)展， 庫構(gòu)建是基因克隆的重要方法之一。 于克隆和大量表達(dá)，它不 像 基因組 有內(nèi)含子而難以表達(dá)，因此可以從 庫中篩選到所需的目的基因，并直接用于該目的基因的表達(dá) （ 1993） 。它是發(fā)現(xiàn)新基因和研究基因功能的基礎(chǔ)工具。 從 1976 年 功的構(gòu)建了第一個 庫以來，構(gòu)建 庫的技術(shù)方法經(jīng)歷了一個逐步發(fā)展完善的過程。初期 庫，由于當(dāng)時技術(shù)條件的限制，選用質(zhì)粒載體存在著合成效率低、難以擴(kuò)增和保存等缺點(diǎn)，而 組 載體為表達(dá)型 庫構(gòu)建和保存提供了質(zhì)的飛躍。 對提高 庫的效價作出了貢獻(xiàn)。近年來， 庫構(gòu)建的新方法、新技術(shù)雖多種多樣、層出不窮，但其共同目的是使得 庫構(gòu)建 更加迅速、簡便、高效、高質(zhì)量、滿足研究的需要。 庫是指某生物某發(fā)育時期所轉(zhuǎn)錄的全部 反轉(zhuǎn)錄形成的 段與某種載體連接而形成的克隆的集合。 庫構(gòu)建的基 本 原理是用 逆轉(zhuǎn)錄引物，或者用隨機(jī)引物，給所合成的 上適當(dāng)?shù)倪B接接頭，連接到適當(dāng)?shù)妮d體中獲得文庫。其基本步驟包括 ： 提取 （ 例如熱硼酸 /蛋白酶 K 法，異硫氰酸胍法，鹽酸胍 酚法等等，提取方法的選擇主要根據(jù)不同的樣品而定 )，要構(gòu)建一個高質(zhì)量的 庫，獲得高質(zhì)量的 至關(guān)重要的， 所以處理 品時必須仔細(xì)小心。由于 存在所有的生物中，并且能抵抗諸如煮沸等這樣的物理環(huán)境，因此建立一個無 的環(huán)境對于制備優(yōu)質(zhì) 很重要。在獲得高質(zhì)量的 ，用反轉(zhuǎn)錄酶 引導(dǎo)下合成 一鏈， 酶 H 和大腸桿菌 合酶 I，同時包括使用 菌體多核苷酸酶和大腸桿菌 接酶進(jìn)行的修復(fù)反應(yīng)），合成接頭的加入，將雙鏈 隆到載體中去，分析入片 段 ，擴(kuò)增 庫、對建立的 文庫進(jìn)行鑒定。 1.1 庫構(gòu)建方法及其研究 將某一特定類型細(xì)胞表達(dá)的 轉(zhuǎn)錄形成與之互補(bǔ)的 將其和載體 組，并轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞里或包裝成噬菌體顆粒，得到一系列克隆群體。每個克隆只含一種 信息，足夠數(shù)目克隆的總和則包含細(xì)胞全部 信息，這樣的克隆群體叫 庫。 像基因組 有內(nèi)含子很難表達(dá)。所以在基因工程研究中，真核細(xì)胞的 庫往往比基因組文庫更為有用。 通 庫 備 品 來源 品純度對構(gòu) 建出的 庫的質(zhì)量至關(guān)重要，從細(xì)胞總 分離純化出中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 2 所占比例為 1%2%的 要利用絕大多數(shù)真核， 3末端都具有長度為 20250個腺 苷 酸組成的 A)尾巴這一結(jié)構(gòu)特征 。 通過與偶聯(lián)在惰性固相介質(zhì) （ 如磁珠、纖維素、瓊脂糖及乳膠顆粒 ） 的 核 苷 酸退火，總 的 分通過其 3端 A)尾與 補(bǔ)雜交固定在固相介質(zhì)上，從而能與總 其它成分分離，再采用優(yōu)化的洗滌、洗脫條件處理，就可將結(jié)合在固相介質(zhì)上的 離下來，制備 出符合 庫構(gòu)建要求的純化 品。 成 一鏈 合成 定 了前 已 述及的模板 質(zhì)量外便是反轉(zhuǎn)錄酶和引物。反轉(zhuǎn)錄酶有禽源反轉(zhuǎn)錄酶 (鼠源反轉(zhuǎn)錄酶 (種。鑒于 活性低，常是拷貝較長 子的更好選擇，但 反轉(zhuǎn)錄效率高，故用得更普遍。近年來 司開發(fā)的基因工程 去了其 C 末端的 180 個氨基酸，不含 活性，更能保證 一鏈的全長和高產(chǎn)。反轉(zhuǎn)錄的引物常用 隨機(jī)六聚體核 苷 酸。 （ 1） 導(dǎo) 成法 由 1220 個 成的人工合成寡核 苷 酸片段，與 末端的 A)尾退火后，即可用作引物，引導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄酶以 模板合成互補(bǔ) 種方法基本被限定以 模板，當(dāng)制備的 品混有少量 ，不會對構(gòu)建出的庫質(zhì)量造成嚴(yán)重影響。但其只能從模板 端起始引發(fā) 合成，對于那些分子量較大而又有較 長 3端非編碼區(qū)的 說，通常會丟失模板 端的重要序列信息。為了減少用 引物反轉(zhuǎn)錄合成過多的無意義的 A)尾，一種有效的變通方法是使用錨定 的 物 :5-( 11 M 為 的任一種， N 則為 4 種 脫氧核 苷 酸的任一種。因此合成出的是一個 3端隨機(jī)的混合引物群體，在反轉(zhuǎn)錄過程中，通過 機(jī)殘基的 錨定 作用，將引物的引發(fā)位點(diǎn)鎖定在表達(dá)基因真正的 3末端，從而減少了無義的 A)尾部序列的反轉(zhuǎn)錄。 （ 2） 隨機(jī)引物引導(dǎo) 成 隨機(jī)引物是人工合成的由 4 種核 苷 酸殘基隨機(jī)組合而成的長度為 610 個核 苷 酸的寡核 苷 酸片段混合物，利用這一混合引物引導(dǎo) 成時，一條模板可能會同時雜交上多個引物序列，并在模板多處位點(diǎn)上同時引發(fā) 轉(zhuǎn)錄合成。因此，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的引發(fā)效率高，在同一模板上，可以合成出多條相互重疊的 段，能更高效地反映出表達(dá) 長的序列信息，從而提高了文庫質(zhì)量，常用于產(chǎn)生表達(dá)文庫，加富長轉(zhuǎn)錄子的 5末端，或解決 到 級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的麻煩， 但它不能保證一個拷貝中含有全長 列，特別是 3端序列區(qū)。另外，使用隨機(jī)引物合成 需注意的一點(diǎn)是，這些引物不僅能以 模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，也能以任何種類的 子為模板，因此，對來源 品的純度要求更為苛刻。 鏈 轉(zhuǎn)換合成 （ l） 自身引導(dǎo)合成法 反轉(zhuǎn)錄酶催化的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束后，通常會使新合成出的單鏈 末端反轉(zhuǎn)形成具有部分雙鏈結(jié)構(gòu)的發(fā)夾環(huán)形式。利用這一特點(diǎn)，在完成 一鏈合成并與模板 離后，就可以利用發(fā)夾環(huán)中的雙鏈部分繼續(xù)作為 引物，引導(dǎo) 合酶以 成出互補(bǔ)的第二鏈 應(yīng)結(jié)束后，用 酸酶降解去除發(fā)夾環(huán)的單鏈部分，即可得到雙鏈形式的 段。這一方法的主要缺點(diǎn)是在用 酸酶去除發(fā)夾環(huán)時的反應(yīng)條中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 3 件要求極為苛刻，難以 控 制，目前己極少采用。 （ 2） 鏈置換法 首先利用 將雜交雙鏈中的 板鏈在內(nèi)部發(fā)生隨機(jī)降解，形成多段短的仍與 一鏈保持互補(bǔ)雜交的 段。這些互補(bǔ)的 段可被 合酶用作引物，引導(dǎo)合成出與 一鏈互補(bǔ)的第二鏈 種合成反應(yīng)在第一 鏈 板上多處同時引發(fā)，隨著合成產(chǎn)物的延伸，除了 5末 端的 物外，所有作為引物的 段均被新合成的互補(bǔ)鏈所置換。通過 接酶作用，將模板上分段合成的互補(bǔ)鏈連接成一條完整的 ，最后通過分離去除殘存的 5末端 段，并用 合酶削平 3端突出的單鏈形式的 可得到一個雙鏈形式的 段。這種方法可直接利用第一鏈反應(yīng)產(chǎn)物， 避 免了中間處理和純化過程所造成的時間消耗和 失，并且無損于 5端。 （ 3） 同聚物引導(dǎo)法 即在第一鏈的 3端用末端轉(zhuǎn)移酶加上一段同 聚 G，然后以 引物合成第二鏈。該法最大的缺點(diǎn)是獲得的 端上游有一段 dG: 基，可能會抑制表達(dá)過程中 轉(zhuǎn)錄，并且會給雙脫氧鏈終止法測序帶來困難。 但 該法在最佳條件下可高效克隆 端序列。 鏈 克隆 克隆就是將合成出的雙鏈 隆在載體上，并導(dǎo)入相應(yīng)宿主細(xì)胞中。 （ 1） 修飾 修飾方法的選擇主要依據(jù)連接方案而定。為了提高文庫 段與載體的連接效率，早期使用的同聚物加尾法已被目前廣泛使用的銜接頭法代替。通常的做 法是給平端的雙鏈 段添加銜接頭。所謂銜接頭是人工合成含有某種限制酶酶切位點(diǎn)的短的雙鏈段，或者是一端為某種限制酶 黏 性末端的雙鏈 段。用前一種銜接頭連接后，需要經(jīng)相應(yīng)的限制酶酶切處理，才能使 段產(chǎn)生 黏 性末端，與相應(yīng)限制酶酶切處理的載體 了避免限制酶對 段內(nèi)部可能出現(xiàn)的酶切位點(diǎn)的切割，在添加銜接頭之前，文庫經(jīng)甲基化酶處理，以保護(hù)內(nèi)部可能出現(xiàn)的酶切位點(diǎn)。而添加后一類型的銜接頭時，則不必對文庫 行修飾處理。 采用普通添加銜接頭的方式，文庫 段與載體連接時的插入方向是隨機(jī)的。這種克隆結(jié)果對非表達(dá)型 庫的篩選并無影響，但對于表達(dá) 庫的篩選，只有 1/6 的插入片段具有正常表達(dá)的可能性，無形中極大地降低了文庫的可篩選容量?？朔@一問題的途徑是采用庫定向克隆策略。一種做法是引導(dǎo) 一鏈合成的寡核 苷 酸引物的 5端預(yù)先設(shè)計一種限制酶酶切位點(diǎn)，在雙鏈 成完畢后，再添加另一種限制酶酶切位點(diǎn)的銜接頭。采用這兩種酶進(jìn)行雙酶切后，就可使 段的兩端產(chǎn)生兩種不同的 黏 性末端，從而使文庫 段能定向插入到克隆載體上。 另外，通過設(shè)計特定序列的銜接頭，也能達(dá)到定向 插 入的目的。如用 引物合成的雙鏈 3 端序列 ， 添加 銜接頭，則在 創(chuàng)造出一個 酶切位點(diǎn) (行雙酶切，則可使雙鏈 段的兩端產(chǎn)生出兩種內(nèi)切酶的 黏 性末端，與相應(yīng)雙酶切的載體連接，就能定向插入到載體上。通過定向克隆構(gòu)建的表達(dá) 庫中，有 1/3 的插入片段具有正確表達(dá)的可能性。在定向克隆時，還可分別使用包含三種可能閱讀框架的銜接頭。用同一來源的 段 ，構(gòu)建出三個相應(yīng)的表達(dá)文庫，就能使所有的 段獲得表達(dá)篩選的可能性。 （ 2） 克隆 將制備的 隆到載體中去需考慮的關(guān)鍵問題是 載體的比例。必須尋找一個適當(dāng)?shù)谋壤员苊鈫蝹€重組體中含有多個串聯(lián) 子或產(chǎn)生過高的非重中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 4 組背景。為提高連接反應(yīng)效率，可在連接混合物中加適量 成的 庫一般應(yīng)進(jìn)行效價測定并擴(kuò)增，以利多次篩選并長期保存。 長 庫 構(gòu)建全長 庫，能夠使人們通過一次陽性篩選，就可獲得基因的全長序列，從而大大縮短了獲取基因 的全長信息所需花費(fèi)的時間。傳統(tǒng)的 成方法通常都是利用 端的 A)尾巴，以 引物，通過反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成 第一鏈。由于傳統(tǒng)的反轉(zhuǎn)錄酶 常常不能反轉(zhuǎn)錄出全長 列，因此往往會造成 5 端的缺失，尤其是在 長或者具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的情況下。為了更加有效地克隆新的基因，如何克服僅由 A)尾合成 術(shù)路線的局限性，以及由逆轉(zhuǎn)錄酶作用特點(diǎn)導(dǎo)致的局限性，建立富含全長 文庫就顯得非常有意義。 (1) 的帽子結(jié)構(gòu)的利用 人利用 5 帽的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，用細(xì)菌堿性磷酸酶(除無 5 端 護(hù)的部分降解的不完整 端的游離磷酸基因，再用煙草酸性磷酸酶 (除 5 的 成一段 ，繼而利用修飾的 逆轉(zhuǎn)錄，并進(jìn)行 應(yīng)，稱為 后克隆到載體建庫。這種方法由于利用帽的位置及結(jié)構(gòu)的特殊性，理論上在建庫的克隆產(chǎn)物中即含有大量的全長 列，利用極其少量的組織或 庫。其缺點(diǎn)是理論上會產(chǎn)生由于 化 增條件后盡可能減少了文庫的代表性和冗余性。 報道一種稱為 方法，能夠非常有效地建立全長的 庫。利用“帽結(jié)合蛋白”專門結(jié)合 帽結(jié)構(gòu)，含有完整帽子結(jié)構(gòu)的 富集。逆轉(zhuǎn)錄后用 作用于 合子，未被 合蛋白結(jié)合的“部分降解”的不完整 雖結(jié)合了“帽子結(jié)合蛋白”但 不完整的 被降 解，僅完整 有全長 一鏈結(jié)合保護(hù)的那些 保護(hù)，進(jìn)一步純化富集后建庫，獲得的克隆全長比例很高，但每次需極其大量的 100g )，另外，被帽結(jié)合蛋白結(jié)合的 端約 1050 丟失。 (2001)最近報道 方法，其原理是用過碘酸鹽標(biāo)記 5 的末端甲基化的后用免疫磁珠法分離并富集逆轉(zhuǎn)錄后全長的 行建庫。標(biāo)記的方法有其特殊性，即根據(jù) 5 末端帽結(jié)構(gòu)上的 糖基團(tuán)上有 2,3 鄰位兩個 團(tuán)，可被生物素酰 肼作用并標(biāo)記上生物素，而進(jìn)一步被富集分離，作幾次連接及擴(kuò)增即可克隆入載體。結(jié)果可以得到相當(dāng)長度的 95%為全長，得率和產(chǎn)量較前增加 1050 倍，并且由于不作 應(yīng)，可減少理論上的偏移和冗余性。但該方法中 板在化學(xué)試劑及酶反應(yīng)體系暴露時間較長，造成效率的降低，目前已有一些改進(jìn)的方法。另外用 閉吸附用的柱子，也可能造成一些非特異的污染。 目前，也有些研究人員根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄后的 大小進(jìn)行分級，即通過凝膠電泳，只回收分子量較大的片段，這樣，雖然建庫的 量減少了，但可大 大提高所建文庫中的較大插入片段的比例，有利于對較大基因進(jìn)行克隆。 以上方法 逆轉(zhuǎn)錄都是在 37進(jìn)行的，此溫度不能解開 能形成的二中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 5 級結(jié)構(gòu)，使逆轉(zhuǎn)錄酶不能通過二級結(jié)構(gòu)區(qū)段，而得不到全長的 一鏈，這也是制約大基因全長 庫的一個“瓶頸”。 (1998)報道，一種二糖海藻糖可以提高某些酶，如轉(zhuǎn)錄酶和 等的熱穩(wěn)定性 (熱穩(wěn)定效應(yīng) )，可提高耐熱溫度 5對某些酶還可在適當(dāng)高溫下增加酶的活性 (熱激活效應(yīng) )。這可以減少逆轉(zhuǎn)錄過程中的二級 結(jié)構(gòu)，增加全長其對較大基因 )第一鏈的合成比例。 ( 2 ) 導(dǎo) 二鏈合成法 在第一鏈 轉(zhuǎn)錄合成反應(yīng)完成后，可利用核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶在 雜交體的 3 末端添加上多個 基，產(chǎn)生出一段列。通過堿性蔗糖密度梯度離心，使 交雙鏈分離，并回收單鏈 入過量的 引物，通過 一鏈 3 端的 列退火雜交，從而引導(dǎo)合成出完 整的 二鏈。 (3)載體引導(dǎo) 合成法 首先用平端限制酶使克隆載體線性化，利用核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶在載體兩條鏈的 3 端分別加上一段 列。處理后的載體與 體上的 A)尾互補(bǔ)，作為反轉(zhuǎn)錄酶的引物，引導(dǎo)合成出 一鏈，并通過末端轉(zhuǎn)移酶在 端添加上一段 列。降解去除模板 堿性蔗糖密度梯度離心分離回收質(zhì)粒兩條鏈。這兩條鏈的 3 末端都連上了一條新合成出 一鏈。分別用這兩 條鏈 分子數(shù)絕對過量的， 3 端加有 列，并經(jīng)變性處理的同一載體 過載體間的互補(bǔ)鏈及 交，形成一種環(huán)狀的，帶有大段缺口 (相對應(yīng)于 一鏈部分 )的雙鏈 于。最后用 將缺口填補(bǔ)的同時，合成出 成完整的環(huán)狀的雙鏈重組載體，可直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，構(gòu)建 庫。 (4)置換合成法 首先用雙酶切使載體線性化，其中的一種限制酶產(chǎn)生平末端。用末端轉(zhuǎn)移酶在平末端的 3 上 與 合退火。以載體上的 引物，合成一鏈。再用末端轉(zhuǎn)移酶在合成出的 末端加上 然后加入人工設(shè)計合成的一端帶有 另一端則帶有與載體上的粘性末端互補(bǔ)的接頭，經(jīng) 接酶處理，就形成一種含有 交體的雜合雙鏈環(huán)狀分子。再采用缺口平移反應(yīng)，合成出 成含有全長 入片段的環(huán)狀重組載體，直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌。用這一方法得到的是一個定向克隆的 庫。 (5)模板鏈轉(zhuǎn)換法 在反轉(zhuǎn)錄 反應(yīng)過程中，當(dāng)反轉(zhuǎn)錄酶催化 成到達(dá) 板的 5末端時，能夠不依賴模板，繼續(xù)在新合成的 末端添加數(shù)個脫氧核糖核苷酸殘基 ( 1992; 1994 )。不同來源的反轉(zhuǎn)錄酶對添加核苷酸殘基的性質(zhì)有不同的偏愛性。缺失 活性的 I 重組反轉(zhuǎn)錄酶，則專一性地在新合成出的添加 3 基，利用這一特性。在 一鏈合成的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中加入一種人工合成的 3 端 為 寡核苷酸引物 (稱為轉(zhuǎn)換鏈引物， ，當(dāng)I 反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成 達(dá)模板 末端時，在 3 末端加上的 可與轉(zhuǎn)換鏈引物中的 補(bǔ)，繼續(xù)引導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄酶以轉(zhuǎn)換鏈引物為模板，延伸合成出一段與引物互補(bǔ)的序列。在 二鏈合成時，就可利用形成互補(bǔ)的轉(zhuǎn)換鏈引物，通過 介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)，置換 板，合成出與 一鏈完全互補(bǔ)的 二鏈，從而得到全長的雙鏈 目前所報道的對全長 庫的構(gòu)建一般按 司 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 6 法或 劑盒 (用說明進(jìn)行。判斷一個 庫中的列是否是全長基因的 要方法有以下幾種。 5端：如果有同源全長基因的比較，可以通過與其它生物已知的對應(yīng)基因 5末端進(jìn)行比較來判斷。如果無同源基因的新基因，則首先判斷編碼框架是否完整，即在開放閱讀框的第 1 個 次，判斷是否有轉(zhuǎn) 錄起始點(diǎn)，一般加在 5帽結(jié)構(gòu)后有一段富含嘧啶的區(qū)域，或者是 序列與基因組序列中經(jīng)過酶切保護(hù)的部分相同，則可以確定得到的 5端是完整的。 3端：同樣可以用其它生物已知的對應(yīng)基因 3末端進(jìn)行比較來判斷，或編碼框架的下游有