【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）大豆疫霉菌的分子檢測(cè)植物病理學(xué)碩士論文

密級(jí) 論文編號(hào) 國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩士學(xué)位論文 大豆疫霉菌的分子檢測(cè) I 摘 要 由大豆疫霉菌 （ 引起的大豆疫霉根腐 病 （ 是大豆毀滅性病害之一，是我國(guó)的重要對(duì)外檢疫對(duì)象。本實(shí)驗(yàn)利用 子標(biāo)記技術(shù)研究大豆疫霉菌的分子特征，建立 應(yīng)體系，根據(jù)病原菌 平在種間的變異特點(diǎn)，尋找到大豆疫霉菌的特異性 增條帶 ，并 將其 轉(zhuǎn)化為更為穩(wěn)定方便的 記 。 在此技術(shù)的基礎(chǔ)上 ，初步 建立大豆疫霉菌的快速檢測(cè)技術(shù)體系。 研究獲得的 主要結(jié)果如下： 1. 通過(guò)單孢分離技術(shù)，純化 大豆疫霉菌菌株 34 個(gè)并鑒定了各菌株的毒力類型；培養(yǎng)其它卵菌 9個(gè)和大豆種傳、土傳真菌 23 個(gè)，為 本研究和其它相關(guān)研究奠定良好的病原學(xué)基礎(chǔ)。 2. 建立了適用于大豆疫霉菌的 應(yīng)體系；從 112 對(duì)引物中篩選出 56 對(duì)多態(tài)性引物，經(jīng)過(guò)擴(kuò)增，在引物對(duì) 得了對(duì)大豆疫霉菌的特異性擴(kuò)增條帶，其中引物對(duì) 大豆疫霉菌中能特異地?cái)U(kuò)增出約 660 片段，該片段用于進(jìn)一步研究。 3. 將特異性擴(kuò)增片段回收、克隆、測(cè)序、分析序列，根據(jù)序列特征設(shè)計(jì)引物。檢測(cè)結(jié)果表明，已成功將該 記轉(zhuǎn)化為 記。 4. 以 記引物進(jìn)行特異性的 檢測(cè)，能在大豆疫霉菌中穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增出大小約為 280 特異性片段，而其它參照菌中則無(wú)擴(kuò)增。該 記的檢測(cè)靈敏度達(dá)到 10 模擬實(shí)際檢測(cè)中可能出現(xiàn)的情況，在 大豆疫霉菌 混入其它真菌的 能特異性地檢測(cè)出大豆疫霉菌。 5. 通過(guò)對(duì)各技術(shù)環(huán)節(jié)的優(yōu)化，初步建立了 大豆疫霉菌快速分子檢測(cè)技術(shù)體系。 關(guān)鍵詞 ：大豆疫霉菌（ 子檢測(cè) is an a on it is an In is to . on NA . is . a a . in as 1. 34 P. of 9 to 3 of in as in of 2. . 56 of in . in by A 660 bp 3. on a a in . It to a 4. a 280 bp in of . in of is 0 pg NA . 5. A . of 文縮略詞 縮略詞 英文全稱 中文全稱 mp GA NA , N, N, N增片段長(zhǎng)度多態(tài)性 氨芐青霉素 堿基對(duì) 乙二胺四乙酸二鈉鹽 表達(dá)序列標(biāo)簽 聚丙烯酰胺凝膠電泳 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 數(shù)量性狀位點(diǎn) 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性 抗病基因同源序列 每秒轉(zhuǎn)速 特征序列擴(kuò)增區(qū) 單核苷酸多態(tài)性 簡(jiǎn)單重復(fù)序列 序列標(biāo)簽位點(diǎn) 三內(nèi)切酶擴(kuò)增的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 N, N, N, N三（羥甲基）氨基甲烷 513 吲哚 錄 第一章 引言 1 豆疫霉菌 . 1 用分子標(biāo)記工具 . 2 記技術(shù) . 3 記技術(shù) . 3 記技術(shù) . 4 記技術(shù) . 4 記技術(shù) . 5 記技術(shù) . 5 記技術(shù) . 5 物病原真菌的分子檢測(cè)研究 . 8 豆疫霉菌的分子研究 . 9 究的內(nèi)容和目的意義 . 10 究技術(shù)路線 . 11 第二章 材料和方法 . 12 驗(yàn)材料 . 12 豆疫霉菌 . 12 它卵菌 . 12 它真菌 . 13 豆疫霉菌生理小種鑒別寄主 . 13 養(yǎng)基 . 14 究方法 . 15 豆疫霉菌的分離 . 15 豆疫霉菌菌株毒力的鑒定 . 15 豆疫霉菌單孢純系建立 . 15 驗(yàn)用菌的液體培養(yǎng) . 16 因組 提取 . 16 析體系 . 17 異標(biāo)記 段的克隆 . 21 序 ,物設(shè)計(jì)及篩選 . 23 記引物的檢測(cè) . 23 第三章 結(jié)果與分析 . 24 孢純系的建立 . 24 豆疫霉菌單孢純系 . 24 照菌的分離和培養(yǎng) . 24 豆疫霉菌菌株毒力測(cè)定 . 24 V 因組 提取 . 25 應(yīng)體系中的建立 . 25 切和連接條件的篩選 . 25 擴(kuò)增條件篩選 . 26 擇性擴(kuò)增條件篩選 . 27 染程序 . 29 記的篩選 . 29 物的 回收擴(kuò)增 . 30 收產(chǎn)物的克隆 . 31 序，設(shè)計(jì)引物 . 31 序 . 31 列比對(duì)分析 . 32 計(jì)引物 . 33 物的檢測(cè) . 33 異引物的初步檢測(cè) . 33 異引物的專一性檢測(cè) . 35 異引物的靈敏度檢測(cè) . 36 豆疫霉菌快速分子檢測(cè)技術(shù)的構(gòu)建 . 37 第四章 結(jié)論與討論 . 38 論 . 38 建了適于大豆疫霉菌研究的 術(shù) . 38 過(guò) 增，在大豆疫霉菌中發(fā)現(xiàn)了 3 條特異性標(biāo)記的條帶 . 38 將引物 增出的 記成功轉(zhuǎn)化為 記 . 38 建了可以用于大豆疫霉菌快速檢測(cè)的分子檢測(cè)技術(shù) . 38 論 . 38 參考文獻(xiàn) 41 附錄 46 致謝 51 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 1 第一章 引言 豆疫霉菌 由大豆疫霉菌 大豆毀滅性病害之一，也是我國(guó)的重要對(duì)外檢疫對(duì)象。該病于 1948 年在美國(guó)印第安那州首次發(fā)現(xiàn)。此后，加拿大、巴西、阿根廷、日本、澳大利亞等國(guó)家和歐洲、非洲地區(qū)相繼報(bào)道了該病害的發(fā)生（ 1985）。在美國(guó)，大豆疫霉根腐病在發(fā)現(xiàn)不久后很快上升為重要性僅次于大豆胞囊線蟲(chóng)病的病害，造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。 1989 年北京農(nóng)業(yè)大學(xué)沈崇堯先生在我國(guó)東北地區(qū)首先發(fā)現(xiàn)了大豆疫霉根腐病。此后，一些研究者也相繼在黑龍江省分離到大豆疫霉菌（周肇蕙等， 1995；李寶英和馬淑梅， 1996；王曉鳴等， 1998）。至 1997 年，大豆疫霉根腐病已在黑龍江省的 29 個(gè)縣（市）和 4 個(gè)國(guó)營(yíng)農(nóng)場(chǎng)發(fā)生，發(fā)病面積達(dá) 80000 公頃，成為危害黑龍江省大豆生產(chǎn)的新問(wèn)題（韓曉增等， 1998）。近年的調(diào)查表明，大豆疫霉根腐病在我國(guó) 9 ?。ㄗ灾螀^(qū)）均有發(fā)生，其中在東北和黃淮大豆產(chǎn)區(qū)較為嚴(yán)重。 大豆疫霉菌可在大豆的任何生育階段侵染大豆。在水淹條件下引起種子腐爛、出苗前死亡和出苗后鉤狀期死亡。苗期癥狀為植株近地表莖部出現(xiàn)水浸狀病斑、葉片變黃萎蔫，嚴(yán)重時(shí)植株猝倒死亡。成株期植株受侵染后癥狀首先表現(xiàn)為下部葉片變黃，隨后上部葉片逐漸變黃并很快萎蔫；近地表莖部病斑褐色，并可向上擴(kuò)展至第 10 11 節(jié)位，莖皮層及髓變褐，中空，易折斷；根腐爛，根系發(fā)育不良；未死亡病株的莢數(shù)明顯減少，空莢、癟莢較多，籽粒皺縮。成株期感病植株的病莖節(jié)位也有病莢產(chǎn)生，其癥狀為綠色豆莢基部出現(xiàn)水浸狀斑，病斑逐漸變褐并從莢柄蔓延至莢尖，最后整個(gè)豆莢呈黃褐色干枯，種子失水干癟，種皮、胚和子葉均可帶菌。大豆疫霉菌為土傳真菌，也能以卵孢子和菌絲體方式存活于大豆種子的種皮、胚和子葉內(nèi)。大豆疫霉菌的致病性也受大豆植株生育期和發(fā)育狀況的影響。 大豆疫霉菌為土傳真菌，但病菌寄生性強(qiáng)，不能在土壤顆粒上競(jìng) 爭(zhēng)生長(zhǎng)和定殖，卵孢子在植株病殘?bào)w和土壤中能存活多年。大豆疫霉菌在利馬豆、玉米粉、 等培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，菌落均勻，邊緣整齊。菌絲寬 3 9 m，易卷曲；菌絲體珊瑚狀，分枝近直角，在分枝基部稍縊縮，老熟后產(chǎn)生隔膜；菌絲可形成結(jié)節(jié)狀、膨大體和厚垣孢子。孢囊梗簡(jiǎn)單，頂生游動(dòng)孢子囊；游動(dòng)孢子囊倒梨形和橢圓形，無(wú)乳突；游動(dòng)孢子卵圓形，一端或兩端鈍圓，側(cè)面平滑，有兩根鞭毛。周肇惠等（ 1996）研究證實(shí)卵孢子只產(chǎn)生于帶菌種子的種皮，檢測(cè)大豆種皮存在卵孢子與否可以作為大豆種子帶菌檢測(cè)方法之一。 1957 年， 現(xiàn)了大豆對(duì)大豆疫霉菌存在抗性分化。 1959 年 現(xiàn)不同大豆疫霉菌分離物在毒力上有差異，認(rèn)為大豆疫霉菌存在生理株系。 1965 年 次報(bào)道了大豆疫霉菌的生理專化型，描述了 1 號(hào)和 2 號(hào)小種。 1963 年育成了含有單抗性基因 大豆商業(yè)品種，此后的十年間抗病品種在美國(guó)北部地區(qū)廣泛推廣種植，大豆疫霉根腐病得到了基本控制。但正是由于這些抗病品種的廣泛應(yīng)用，對(duì)病原菌造成相對(duì)高的選擇壓，加速了大豆疫霉菌的毒力分化。 1972 年， 美國(guó)北部地區(qū)發(fā)現(xiàn)對(duì) 當(dāng)時(shí)推廣的帶有抗病基因的品種 有毒力的分離物，并定名為 3 號(hào)小種，隨后 4 9 號(hào)小種也相繼在北部地區(qū)和加拿大被鑒定。此后，在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 2 抗病品種 小種互作下新的大豆疫霉菌生理小種便不斷產(chǎn)生，其變異速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于從 1 號(hào)、 2 號(hào)小種到 3 號(hào)小種的變異。有研究認(rèn)為，在土壤中還可能存在更為豐富的生理小種多樣性（ 1990），由于田間種植品種的同質(zhì)性較高，存在于土壤中的許多小種尚不能通過(guò)田間發(fā)病植株分離來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。大豆疫霉菌是具有寄主?；缘闹虏【?。已有的研究表明，大豆疫霉菌與大豆品種之間的互作具有基因?qū)虻奶?征（ et 1995） 。在與寄主抗病性互作中，大豆疫霉菌 毒力也在演變和快速進(jìn)化，新的生理小種不斷出現(xiàn)，而且在大豆抗病性利用越多的地區(qū)，大豆疫霉菌的毒力變異就越快（ et 996） 。至 2000 年，通過(guò)在 13 個(gè)大豆疫霉菌生理 小種鑒別寄主上接種鑒定，國(guó)際上已報(bào)道了 63 個(gè)大豆疫霉菌生理小種 （ 1965; 2000） ，許多研究者還報(bào)道了更多的毒力基因類型。 事實(shí)上，一些研究者已直接從土壤中分離鑒別出許多新生理小種。大豆疫霉菌分離 物在實(shí)驗(yàn)室條件下，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的保存，也會(huì)在致病毒性上發(fā)生變異，產(chǎn)生新生理小種（ 2000）。 用分子標(biāo)記工具 遺傳標(biāo)記是指可以明確反映遺傳多態(tài)性的生物特征。在經(jīng)典遺傳學(xué)中，遺傳多態(tài)性是指等位基因的變異。在現(xiàn)代遺傳學(xué)中，遺傳多態(tài)性是指基因組中任何座位上的相對(duì)差異。遺傳標(biāo)記可以幫助人們更好地研究生物的遺傳與變異規(guī)律。在遺傳學(xué)研究中遺傳標(biāo)記主要應(yīng)用于連鎖分析、基因定位、遺傳作圖及基因轉(zhuǎn)移等。在作物育種中通常將與育種目標(biāo)性狀緊密連鎖的遺傳標(biāo)記用來(lái)對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行跟蹤選擇。在現(xiàn)代分子育種研究 中，遺傳標(biāo)記的應(yīng)用已成為基因定位和輔助選擇的主要手段。遺傳標(biāo)記可以分為形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、蛋白質(zhì)標(biāo)記和 記。 根據(jù)對(duì) 態(tài)性的檢測(cè)原理和手段，分子標(biāo)記可大致分為以下四大類（張應(yīng)華等， 2002）： 第一類為基于 交的分子標(biāo)記。該標(biāo)記技術(shù)是利用限制性內(nèi)切酶酶解及凝膠電泳分離不同生物體的 子，然后用經(jīng)標(biāo)記的特異 針與之雜交，通過(guò)放射性自顯影或非同位素技術(shù)來(lái)顯示 多態(tài)性。其中最具代表性的是發(fā)現(xiàn)最早的 記。 第二類為基于 分子標(biāo)記。這類標(biāo)記技術(shù)可以在短時(shí)間內(nèi)將 少量的 品快速擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)電泳并通過(guò) 色、銀染、熒光標(biāo)記、同位素標(biāo)記或地高辛標(biāo)記等多種方法進(jìn)行檢測(cè)其多態(tài)性的差異。根據(jù)所用引物的特點(diǎn)，這類標(biāo)記可分為隨機(jī)引物 記和特異引物 記。隨機(jī)引物 記包括 記、 記等，其中 記使用較廣泛。隨機(jī)引物 增的段是事先未知的，具有隨機(jī)性和任意性，因此隨機(jī)引物 記技術(shù)可用于對(duì)任何未知基因組的研究。特異引物 記包括 記、 記、 記等。特異引物 擴(kuò)增的 段是事先已知的、明確的， 具有特異性，因此特異引物 記技術(shù)依賴于對(duì)各個(gè)物種基因組信息的了解。 第三類為基于 限制性酶切技術(shù)相結(jié)合的分子標(biāo)記。這類標(biāo)記可分為兩種類型，一種是通過(guò)對(duì)限制性酶切片段的選擇性擴(kuò)增來(lái)顯示限制性片段長(zhǎng)度的多態(tài)性，主要包括 記。另一種是通過(guò) 增片段的限制性酶切來(lái)顯示擴(kuò)增區(qū)段的多態(tài)性，如 記。 第四類為基于單個(gè)核苷酸多態(tài)性的分子標(biāo)記。它是由 列中因單個(gè)堿基的變異而產(chǎn)生的遺傳多態(tài)性，如 記。目前， 記一般通過(guò) 片技術(shù)進(jìn)行分析。 下頁(yè)表 1 匯總了常用的 態(tài)性分 析的標(biāo)記。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 3 表 1 記技術(shù)一覽表 of NA 文名稱 文名稱 文縮寫(xiě) 考文獻(xiàn) 制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 1980) 重復(fù)數(shù)可變串聯(lián)重復(fù) of 1987) 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 1990) 任意引物 1990) 增指紋 1991) 簡(jiǎn)單序列重復(fù)間區(qū) 1994) 簡(jiǎn)單序列重復(fù) 1992) 特異性序列擴(kuò)增 993) 序列標(biāo)簽位點(diǎn) 1989) 抗病基因類似物 1996) 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性 1995) 酶解擴(kuò)增多態(tài)性序列 1993) 等位特異性 1990) 單鏈構(gòu)象多態(tài)性 1992) 擴(kuò)增長(zhǎng)度多態(tài)性 1995) 專一性擴(kuò)增多態(tài)性 1991) 單核苷酸多態(tài)性 1998) 其中應(yīng)用最廣泛的標(biāo)記主要有下面介紹的幾種。 記技術(shù) 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（ 這一方法由 1980年 首先提出。該方法的出現(xiàn)開(kāi)創(chuàng)了直接應(yīng)用 平遺傳標(biāo)記的新階段。 術(shù)采用限制性內(nèi)切酶消化基因組 于限制性酶切位點(diǎn) (靶位點(diǎn) )列的點(diǎn)突變，或兩相鄰靶位點(diǎn)之間 列的插入、缺失，都會(huì)改變相應(yīng) 段的長(zhǎng)度。這種長(zhǎng)度上的差異 (多態(tài)性 )通過(guò)電泳分離和分子雜交檢測(cè)就形成一種可視的標(biāo)記。 1987 年 構(gòu)建了第一張人類的 記技術(shù) 在多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ 術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一類 1990 年 采用長(zhǎng)度為 9堿基的隨機(jī)核苷酸序列為引物擴(kuò)增基因組 得隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性 其稱為 記形成的遺傳學(xué)基礎(chǔ)是： 位區(qū)域內(nèi)，或因引物結(jié)合序列發(fā)生點(diǎn)突變，使擴(kuò)增子（ 個(gè)反向聚合的引物靶序列）丟失，產(chǎn)生顯性效應(yīng)的 記；或因擴(kuò)增子間發(fā)生序列的插入，缺失突變，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 4 產(chǎn)生共顯性的 記。由于擴(kuò)增子較小，一般在 2 下，在這種長(zhǎng)度范圍內(nèi)發(fā)生插入和缺失突變的機(jī)會(huì)很小。因此， 記主要以引物結(jié)合序列發(fā)生突變形成顯性分子標(biāo)記居多。 與 比， 析所需的基因組 很少，對(duì) 備的純度要求不高，微量快速的 離方法就能滿足 增的需要。 析的程序也簡(jiǎn)單，不涉及放射性同位素。物是 量在 60%以上的隨機(jī)引物。一般認(rèn)為 記適合檢測(cè)整個(gè)基因組 位區(qū)域內(nèi)變異，但有一些研究發(fā)現(xiàn)， 記在染色體基因組中存在不均勻分布的現(xiàn)象。 在的主要缺陷是使用的引物長(zhǎng)度較短，一般為 9堿基，為了增加引物與模塊結(jié)合的能力，使用較低的退火溫度，并且允許一定程度的堿基誤配。因此， 擴(kuò)增反應(yīng)的條件非常敏感，被認(rèn)為是穩(wěn)定性較差的一種標(biāo)記。 記技術(shù) 次由 1993）提出并應(yīng)用。它是通過(guò)對(duì)多態(tài)性 物測(cè)序的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)一對(duì)新的引物特異地?cái)U(kuò)增一個(gè)在遺傳上定義為一個(gè)位點(diǎn)的 段，一般在原 物的 3與 5端延長(zhǎng) 14 個(gè)堿基，利用兩端各 24 個(gè)堿基的引物進(jìn)行特異擴(kuò)增。因此，與 比， 法（ 1）由于使用長(zhǎng)引物和高退火溫度，具有高穩(wěn)定性。（ 2）具有轉(zhuǎn)化顯性 記為共顯性的 記的可能性。（ 3）如果為顯性的話，可以直接染色檢測(cè)。 一種典型的特異擴(kuò)增反應(yīng)，是目前能將 記轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定標(biāo)記的較少方法之一?；谏鲜鰞?yōu)點(diǎn)， 記成為目前分子標(biāo)記在實(shí)踐中能直接應(yīng)用的首選標(biāo)記。在近幾年開(kāi)展的抗病基因標(biāo)記研究中，許多研究者均將 記轉(zhuǎn)化為 記，并在轉(zhuǎn)育后 代中得到了較好的驗(yàn)證（許勇， 1999）。 記技術(shù) 基于 展起來(lái)的一類 記技術(shù)， （ 1989)首先在人類基因組的物理作圖研究中使用 術(shù)， 術(shù)的基因原理是，對(duì) 記使用的克隆 (多為 行測(cè)序，根據(jù)序列信息設(shè)計(jì)一對(duì)引物，用于對(duì)基因組 行特異擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行常規(guī)的 泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性。進(jìn)行 物設(shè)計(jì)時(shí)一般選擇 行測(cè)序，測(cè)多態(tài)性的基礎(chǔ)是 為一種表達(dá)的基因組 其內(nèi)部存在許多易發(fā)生插入、缺失等突變的非表達(dá)區(qū)域，從而使得與兩引物配對(duì)的區(qū)域形成的擴(kuò)增子，表現(xiàn)多態(tài)性。 為一種基于 標(biāo)記技術(shù)，顯然具有 法比擬的實(shí)用上的可行性，但是，并非所有的 點(diǎn)都可以找到對(duì)應(yīng)的 記。 基于 術(shù)，首先必需要求引物配對(duì)區(qū)域之間的 度滿足 增的條件，形成一個(gè)擴(kuò)增子。但實(shí)際上許多插入序列遠(yuǎn)超過(guò)擴(kuò)增子的大小，使 增無(wú)法得到產(chǎn)物。 這類 記就無(wú)法轉(zhuǎn)化為 記。另外， 記并非總能與相應(yīng)的 記相對(duì)應(yīng)。有 些引物擴(kuò)增的產(chǎn)物則沒(méi)有長(zhǎng)度上的多態(tài)性。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 5 記技術(shù) 稱為微衛(wèi)星（ 廣泛存在于植物基因組中，一般是一組由一至六個(gè)堿基對(duì)序列串在一起的序列的重復(fù)。這種簡(jiǎn)單序列的重復(fù)次數(shù)存在豐富的多態(tài)性，并廣泛分布于整個(gè)染色體組中。 端有一段保守的 列，通過(guò)這段序列可以設(shè)計(jì)一段互補(bǔ)的寡聚核苷酸引物對(duì) 行 增。由于 態(tài)性僅是由簡(jiǎn)單序列的重復(fù)次數(shù)的差異引起的，通常表現(xiàn)為共顯性。 增產(chǎn)物的檢測(cè)通常采用高濃度的瓊脂 糖膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳。 記技術(shù) 生物學(xué)基礎(chǔ)仍然是植物基因組中存在的 檢測(cè)首先需要獲得 側(cè)保守的 列才能設(shè)計(jì)引物。為了獲得這段保守的序列信息，需要大量分離 測(cè)序的工作。 利用植物廣泛存在 特點(diǎn)，利用在植物基因組中常出現(xiàn)的列本身設(shè)計(jì)引物，無(wú)需對(duì)克隆測(cè)序。 物通常是一段長(zhǎng)度在 15右的一段簡(jiǎn)單重復(fù)序列，