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密級 論文編號 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 三個與水稻株型相關(guān)突變體的鑒定 與基因克隆 I 摘 要 隨著水稻基因組測序計劃的全面完成,闡明基因的生物學(xué)功能成為后基因組時代的重要研究內(nèi) 容,而水稻的株型是構(gòu)成產(chǎn)量的主要因素,對水稻株型發(fā)育的分子機理的了解可以為育種提供理論基礎(chǔ)。我們從 入水稻突變體庫中,篩選到三個與株型相關(guān)的突變體 :短穗大葉角 莖稈螺旋 并對這 3個突變體進行了形態(tài)學(xué)鑒定、遺傳分析和初步的生理學(xué)研究,克隆了 要結(jié)果如下: 1. 現(xiàn)為半矮化、穗型短而密 集、葉片窄、抽穗延遲等特點, 且 花器官數(shù)目增加,結(jié)實率低,穗軸和枝梗伸長受到抑制,該 突變體 屬于 發(fā)現(xiàn) 突變體對 溫度敏感;遺傳分析證實 穩(wěn)定遺傳的且受一對不完全顯性核基因控制; 對照植株用生型植株的株高 7%,而 步確定 2. 對 變體自交和雜交后代植株進行 性分析,并用 交證明用 中 果 入到 第 5染色體的 一個同源異型盒轉(zhuǎn)錄因子基因中; 對 碼產(chǎn)物進行了同源性分析;用 析了的器官表達,表明、葉、穗中 呈組成型 表達; 3. 利用酵母自激活研究了轉(zhuǎn)錄因子 激活功能, 以成功激活報告基因的表達;研究了其他禾谷類作物是否 具 果野生稻中含有該同源基因,而小麥、玉米、高粱、甘蔗無明顯的同源基因;構(gòu)建了 載體,遺傳轉(zhuǎn)化正在進行; 4. 對 變體的特征進行了 鑒定 , 株半矮化、葉角度大、葉片微卷和抽穗期延遲,突變體矮化類型也屬于 穩(wěn)定遺傳且受一對隱性核基因控制; 一染色體的 一個 據(jù)已有報道,將該基因命名為 對 明 根、莖、葉、穗中 呈組成型 表達;用 行亞細胞定位表明 5. 對 變體進行了鑒定,突變體苗期葉鞘彎曲、螺旋生長,分蘗期表現(xiàn)為分蘗角度變大、半矮化、遲抽穗、育性較差等特點;苗期取彎曲生長的葉鞘進行石蠟切片,發(fā)現(xiàn)彎曲部位的細胞排列緊密; 性分析表明突變體與 是共分離。 關(guān)鍵詞 水稻,株型, 簽,基因克隆 of of in in of to , of as 1. p2 p2 by a A3 at p2 to 2. p2 in a in . in 3. RF in of in 4. by A3 at to A3 at in t to of by a in a in . LA in in 5. at at of at in in as a of by a 錄 摘 要 . I . 要符號表 . 一部分 文獻綜述 . 1 第一章 水稻中的 簽 . 1 . 1 . 1 . 2 . 2 . 2 簽基因的分離 . 3 . 3 . 4 第二章 水稻株型發(fā)育的分子生物學(xué)研究進展 . 5 . 5 . 5 . 5 . 5 . 6 . 8 . 9 第三章 植物中的轉(zhuǎn)錄因子 . 10 . 10 . 10 . 10 錄因子 . 10 . 11 . 11 . 12 . 12 . 12 第四章 植物中的反向遺傳學(xué) . 14 . 14 . 14 義 作用機理 . 14 義 應(yīng)用 . 14 . 15 . 15 . 15 . 16 V . 16 因打靶概述 . 16 因打靶的操作步驟 . 16 因打靶在植物中的應(yīng)用 . 17 . 18 術(shù)的問世 . 18 術(shù)的操作過程 . 18 術(shù)的特點與優(yōu)勢 . 19 術(shù)的應(yīng)用 . 20 結(jié) 語 . 21 第五章 本研究的目的和意義 . 22 第二部分 研究論文 . 23 第一章 水稻短穗突變體的鑒定與基因克隆 . 23 . 23 . 24 . 24 . 24 . 25 . 25 . 25 . 26 . 26 . 26 . 26 . 26 . 26 . 27 交 . 27 . 27 . 27 . 28 . 28 . 29 . 30 . 30 . 30 . 30 . 35 . 35 . 36 . 36 . 38 . 42 共分離的分子生物學(xué)證據(jù) . 43 . 44 . 46 . 46 . 49 . 49 . 52 . 52 . 53 . 53 . 53 . 54 第二章 大葉角突變體的鑒定與基因克隆 . 55 言 . 55 . 55 料和方法 . 55 . 56 . 56 . 56 . 56 . 56 . 57 . 57 . 57 . 57 果與分析 . 58 . 58 . 60 . 61 . 62 . 63 . 64 . 65 . 66 亞細胞定位 . 67 論 . 69 與植物的發(fā)育調(diào)節(jié) . 69 . 69 . 69 第三章 莖桿螺旋突變體的鑒定與遺傳分析 . 70 . 70 . 70 . 70 組織切片 . 71 . 71 . 71 . 71 . 71 . 74 . 75 . 76 . 76 . 76 . 77 . 77 . 77 結(jié) 論 . 78 參考文獻 . 79 附錄 1 基本實驗方法 . 96 附錄 2 主要試劑及 培養(yǎng)基的配方 . 103 致 謝 . 106 作者簡歷 . 107 要符號表 菌人工染色體 基對 補 摩爾根 乙基焦碳酸鹽 氧核糖核苷三磷酸 (4 種 ) 巰基蘇糖醇 腸桿菌 二胺四乙酸 潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 霉素 丙基 那霉素 堿基 B 培養(yǎng)基 堿基 升 爾 開放閱讀框 1于 人工染色體 丙烯酰胺凝膠電流 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 機擴增多態(tài)性 稻基因組研究計劃 NA 涉 分鐘轉(zhuǎn)速 二烷基肌酸鈉 二烷基磺酸鈉 準(zhǔn)檸檬酸鈉鹽溶液 度不對稱 NA 熱水生菌 合酶 43 移 轉(zhuǎn)錄 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 水稻中的 簽 1 第一部分 文獻綜述 第一章 水稻中的 簽 言 隨著水稻基因組測序計劃的全面完成( Yu et 002;et 002; et 002; et 002),以研究基因的生物學(xué)功能為標(biāo)志的功能基因組學(xué)研究成為后基因組時代的核心任務(wù)。功能基因組學(xué)主要是在基因組水平上全面分析基因的生物學(xué)功能和他們之間的相互關(guān)系,以及在植物生長發(fā)育、代謝、環(huán)境應(yīng)答等過程的時空特異表達及調(diào)控機制。與結(jié)構(gòu)基因組學(xué)不同,功能基因組學(xué)是對基因及其功能進行研究,一旦獲得基因的部分或全部信息,研究者即可就該基因申請相關(guān)的專利。水稻的基因數(shù)目是有限的,在基因的巨大商業(yè)前景和應(yīng)用價值的驅(qū)使下,各國政府 和商業(yè)公司紛紛斥巨資投入對水稻功能基因組學(xué)的研究,分離具重要農(nóng)藝性狀(如高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)及抗逆性等)的基因成為投資者的基本目標(biāo)之一。 變體庫的構(gòu)建 突變體是遺傳學(xué)研究的基礎(chǔ)材料,綜觀遺傳學(xué)的發(fā)展歷程,從遺傳學(xué)三大規(guī)律的發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的兩次綠色革命的引發(fā),都與突變體的發(fā)現(xiàn)和利用密切相關(guān),隨著后基因組時代的到來,建立飽和的突變體庫成為水稻功能基因組學(xué)研究的必要組成部分。目前,水稻突變體庫的構(gòu)建主要有以下方法:( 1)自發(fā)突變,由于自發(fā)突變頻率低,很難獲得飽和的突變?nèi)后w。( 2)理化誘變,利用各種射線或化學(xué)誘 變劑處理種子或幼苗,這類突變較容易獲得飽和的突變體,目前應(yīng)用比較成熟,但容易使染色體造成大量的畸變,突變的隨機性使隨后的基因分析與克隆帶來很大的困難。( 3)基因標(biāo)簽法,將 轉(zhuǎn)座子或轉(zhuǎn)座子導(dǎo)入水稻中獲得插入的突變?nèi)后w,用于隨后的正向和反向遺傳學(xué)研究。其中, 利用玉米的轉(zhuǎn)座子 s 構(gòu)建水稻插入突變體庫也是應(yīng)用較多的方法之一。 驗室利用 ,000多個插入的水稻突變體庫( , et 1999),中科院上海植生所 和中國水稻研究所利用 ,000多株插入群體,并正在進行突變體庫的后續(xù)分析(王江等, 2000;朱正歌, 2001; et 2003)。近年來,眾多研究機構(gòu)構(gòu)建了大量的轉(zhuǎn)座子突變體庫( et 1999; et 2001; et 2001; et 2004; et 2004; et 2004; et 2004; et 2004),并有利用轉(zhuǎn)座子克 隆水稻新基因的報道( et 2003; et 2005)。但是總體來說這些標(biāo)簽系統(tǒng)沒有達到預(yù)想的效果。 日本的 2,000個個體的 et 1996; et 1997; et 2000; et 2001),并利用該群體分離了包括 et 2001;et 2001; et 2001; et 2003; et 2004 )。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 水稻中的 簽 2 由于 簽法在包括擬南芥在內(nèi)的眾多植物中獲得了巨大成功,近年來水稻中也構(gòu)建了大量的 文就 簽 述 位于農(nóng)桿菌內(nèi) Ti( Ri(粒上的一段 可以從農(nóng)桿菌中轉(zhuǎn)移并穩(wěn)定整合到植物核基因組中, 插入特點 由于 合的模式比較復(fù)雜,因此對 入特點的充分了解將有利于對突變體庫作系統(tǒng)研究。目前了解的插入特點主要表現(xiàn)在以下方面 : 首先, 初的研究結(jié)果表明, 最近研究顯示, 合到染色體 會引起染色體重排( et 998;et 999; et 000; et 002),當(dāng)基因組中導(dǎo)入大片段的外源 發(fā)生大范圍的染色體重組( et 005),這些特點為隨后的突變體分析帶來相應(yīng)的困難; 其次, 入的偏好性。其一是對宿主基因表達區(qū)域的偏好性,最初的雙子葉植物研究表明, et 1994; et 2000)。近來的研究表明, et 2002; et 002),最近對水稻的研究也發(fā)現(xiàn), 一特點使得構(gòu)建飽和突變體庫所需的群體大大縮?。?et 000; et 001; et 000 ; et 003; et 004);其二是 期研究認為 隨機 整合到基因組 中。但隨后在擬南芥中的研究證明 、 3調(diào)節(jié)區(qū)和內(nèi)含子區(qū)域( et 2002, et 2002),對水稻中插入的 究結(jié)果得出類似結(jié)論, 00 5、 3調(diào)節(jié)區(qū)和內(nèi)含子中( et 1997; et 003;et 004)。同時,對 前已有初步結(jié)論, et 002),對水稻插入突變體的旁側(cè)序列分析表明, 合位點處的基因組 界有小部分的同源性( et 004)。 最后, 多的研究結(jié)果表明, 且并非所有的位點 中 有部分或整個載體序列整合進基因組中,甚至存在多拷貝的串聯(lián)重復(fù)( et 004; et 004)。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 水稻中的 簽 3 上述特點的存在增加了 基因表達影響的復(fù)雜性,很大程度上不利于后代的功能分析。 簽基因的分離 分離 1) 質(zhì)粒拯救法。直接通過內(nèi)切酶酶切突變體染色體 接、環(huán)化、轉(zhuǎn)化細菌,篩選出含 et 992;); 2) 基于 根據(jù) 選突變體的基因文庫,再以篩選到的突變體的克隆部分序列為探針篩選野生型的基因文庫,從而獲得 完整基因的克??; 3) 基于 已知 過反向 et 1990), et 1995)等方法擴增 以擴增出的旁側(cè)序列為探針或進一步設(shè)計引物篩選野生型基因文庫,即可得到與突變相應(yīng)的完整基因的克隆。通過將克隆到的基因轉(zhuǎn)化突變體,進行功能互補試驗從而驗證基因的功能。其中 簽的改進 傳統(tǒng)的 簽策略在鑒定胚胎早期易發(fā)生致死突變的發(fā)育基因,以及研究微效多基因及基因間的補償作用時明顯存在不足。因此,需要發(fā)展新的
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