【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）在人類上皮癌細(xì)胞A431細(xì)胞中PHGPx對細(xì)胞移行的影響-生物科技研究所

中華醫(yī)事科技大學(xué)生物科技研究所 士論文 在人類上皮癌細(xì)胞 胞 移行 的影響 of on in 431 究 生傅怡翔 ( u) 指導(dǎo)教授 : 陳清俊 博士 (D.) 中華民國 一百 年 一 月 011 謝 首先要先感謝我的指導(dǎo)教授陳清俊老師，我從沒當(dāng)過專題生，一開始進(jìn)來什么技術(shù)都不會，都是老師慢慢教我的。也要感謝成功大學(xué)黃暉升老師以及華醫(yī)科大的陳璟賢老師給予本論文最佳的建議以及修正，使論文能更加完善。 想當(dāng)初進(jìn)實(shí)驗(yàn)室學(xué)姊剛好要畢業(yè)，什么都不會的我，有時(shí)候都不 知道該怎辦，實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)真的很重要，我覺得實(shí)驗(yàn)并沒有簡單困難之分，只有經(jīng)驗(yàn)跟沒經(jīng)驗(yàn)之分，沒經(jīng)驗(yàn)的我一開始做最基本實(shí)驗(yàn)，所花之時(shí)間也是別人兩三倍，但是結(jié)果又并不如意，不會還是會給自己打氣，再做一次就好，在此還要謝謝盧宇秋學(xué)弟在實(shí)驗(yàn)室大大小小的整理以及給一些我沒有的經(jīng)驗(yàn)。 感謝家人在這兩年多全心的給我支持，也要感謝各位同學(xué)以及學(xué)弟妹的幫忙。以前跟同學(xué)吃飯打球所有話題永遠(yuǎn)離不開實(shí)驗(yàn)主軸，有時(shí)候還會聊到要不要一起休學(xué)了，當(dāng)然是開玩笑的，有這些朋友讓自己抒發(fā)心情，又覺得困難沒什么大不了了。 要感謝的人實(shí)在太多了，而在書寫 論文時(shí)候指導(dǎo)教授指正，實(shí)在很感謝老師。謝謝各位這兩年的照顧。 文 摘要 磷脂氫谷胱甘肽氧化酶 (身具有極強(qiáng)的抗氧化作用，目前已知它不僅可保護(hù)細(xì)胞膜免遭受過氧化的損傷，而且還可能參與細(xì)胞訊息傳遞的調(diào)控?；|(zhì)金屬蛋白酵素 9（ : ）屬于 家族成員之一， 它與腫瘤的轉(zhuǎn)移特別有關(guān)。研究指出幾乎所有的癌細(xì)胞皆會有細(xì)胞移行的作用。 之前實(shí)驗(yàn)室的研究發(fā)現(xiàn)，在多種癌細(xì)胞中， 現(xiàn)皆有較高的趨勢。至于本篇論文，主要在探討癌細(xì)胞中大量表現(xiàn)之否與癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有關(guān)，而其機(jī)制又是如何？本篇所使用的細(xì)胞株有三：分別為 定型細(xì)胞株 (5)， 定型細(xì)胞株 (8) ，以及 定型細(xì)胞株 ()。 經(jīng)由傷口愈合的實(shí)驗(yàn)發(fā) 現(xiàn)：當(dāng)細(xì)胞大量表現(xiàn) 后的愈合能力明顯比 降低 之細(xì)胞要來得快。另外，由 ， 量表現(xiàn) 的細(xì)胞其 的 表現(xiàn)量相對比細(xì)胞要來的高，此意味著細(xì)胞中的 量表現(xiàn) 時(shí)，所促使細(xì)胞移行加速的機(jī)制是需要透過 的表現(xiàn)方能達(dá)成 。至于 ，由于 結(jié)果顯示其變化量不大，所以可以排除其與 成細(xì)胞移行加速之關(guān)系 。 在探討作用機(jī)制方面， 當(dāng)細(xì)胞額外 添加 然會導(dǎo)致 大量表現(xiàn) 細(xì)胞，其 細(xì)胞移行的能力會下降 ，但相較之下，細(xì)胞則下降的更加明顯，由此說明， 促進(jìn)細(xì)胞移行的作用是與其具抗氧化能力有關(guān)。另外，經(jīng)由 iv 實(shí)驗(yàn)發(fā) 現(xiàn) ，以 抑制素反應(yīng)所需之麩氨基硫后，可觀察到 量表現(xiàn)的細(xì)胞，其 能力會比 胞來的好。而 細(xì)胞，則其 能力會比 胞更差，由此說明，細(xì)胞中的 喪失抗氧化活性之下，也是能促進(jìn)細(xì)胞的 力 。由于細(xì)胞移行時(shí) 必須要有結(jié)構(gòu)蛋白的參與方能達(dá)成，所以此結(jié)果是否暗示了 能也屬于細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白，因此當(dāng)其大量表現(xiàn)時(shí)即會對 細(xì)胞移行有正向的幫助。 綜合以上的結(jié)果，我們的結(jié)論是細(xì)胞中的 有促進(jìn)細(xì)胞移行之作用，此作用的達(dá)成除了與 的表現(xiàn)有直接相關(guān)外，身具抗氧化能力與可能是結(jié)構(gòu)蛋白的細(xì)胞功能也是促成的因素之一。 v of to of is to As in be an in In it in a of in In we In we In be . , so we 2of a on vi to we of on As of it to a on we on . it it be of 錄 口試委員審定書 致謝 文摘要 文摘要 錄 目錄 寫對照表 一章 緒論 前言 胱甘肽過氧化酶 ( 質(zhì)金屬蛋白酵素（ 胞移行 生理功能 驗(yàn)?zāi)康呐c設(shè)計(jì) 二章 材料方法 藥品材料 宮頸上皮癌細(xì)胞 (培養(yǎng) 備 方墨點(diǎn)法 (三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 量 /降低表現(xiàn)之穩(wěn)定細(xì)胞株 量對細(xì)胞傷口愈合的影響 量對細(xì)胞轉(zhuǎn)移表現(xiàn)的影響 量對細(xì)胞中 現(xiàn)量的影響 身的抗氧化能力對細(xì)胞移行之影響 促進(jìn)細(xì)胞移行的能力是否與它本身即是結(jié)構(gòu)蛋白有關(guān) 四章 討論與結(jié)論 量 /降低表現(xiàn)之穩(wěn)定型細(xì)胞株 量表現(xiàn)與降低表現(xiàn)對細(xì)胞的影響 胞中 表現(xiàn)量對細(xì)胞運(yùn)動性 的 影響 抗氧化能力與協(xié)助細(xì)胞運(yùn)動 之關(guān)系 現(xiàn)量與 以及 的關(guān)系 身是否也屬于結(jié)構(gòu)蛋白之探討 考文獻(xiàn) 表 錄 果圖目錄 1 in 2 in 3 in 4 in 5 of 6 in 7 in 8 of in 9 of in 10 of in in 11 of in in 12 of 13 of in in 14 in 15 EM in 16 in in 17 on in x 縮寫對照表 縮寫 全文 2 2 5,52 R e - 12 - 第一章緒論 第一節(jié) 前言 知與細(xì)胞抗氧化作用息息相關(guān) ( 1993; et 1996; et 1999; 1999 )。但除了抗氧化作用之外，文獻(xiàn)上就很少有人發(fā)現(xiàn) 其他的功能角色。曾有一篇文獻(xiàn)提及，多種癌細(xì)胞的 現(xiàn)量似乎都比正常細(xì)胞高出許多 (et 1999)，這 意味著 了在正常細(xì)胞中能扮演抗氧化的正向角色外，在癌細(xì)胞里可能也有其它未知的重要功用。 對于癌癥而言 ，細(xì)胞是否已發(fā)生轉(zhuǎn)移通常被用來做為分期的標(biāo)準(zhǔn)，而細(xì)胞發(fā)生移行作用又是轉(zhuǎn)移的最初機(jī)制 (6 括癌癥和心血管疾病 (T et 2010) 。細(xì)胞 移行在很多疾病是特有的特征，包含癌癥和慢性炎癥 (T et 2010) ?；谝陨系年P(guān)系，本篇研究主要在探討，癌細(xì)胞中大量表現(xiàn)的 否會促使細(xì)胞移行加速，進(jìn)而使癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的機(jī)率大增。 本研究將 使用實(shí)驗(yàn)室所建立的三種穩(wěn)定型細(xì)胞株來加以探討，此三種細(xì)胞株分別是： 及細(xì)胞株。研究的方向除了會直接看表現(xiàn)量是否會影響細(xì)胞移行之外，我們還將分析造成此作用的原因是否是因 身的抗氧化能力造成，還是因它本身也屬于結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)之一。另外，如何增進(jìn)細(xì)胞移行的胞內(nèi)機(jī)制探討也將包含在本研究之中。 - 13 - 第二節(jié)文獻(xiàn)回顧 A . 麩胱甘肽過氧化酶 (麩胱甘肽過氧化酶通常存在于動物的組織中，它能夠減低細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化 (1993) 的發(fā)生，亦能調(diào)節(jié)脂氧酵素 (活性 (1999)。人體中已知有五種它們的結(jié)構(gòu)不相似，但共通點(diǎn)是含有微量元素硒 (1973 年的 明硒為組成 重要成分之一。典型的 )具有四個(gè)蛋白質(zhì)次單位，而每個(gè)次單位中的活化端都含有一個(gè)硒原子 (et 1973)。 人體中的反應(yīng)徒徑極為復(fù)雜，但最重要的功用是在細(xì)胞中扮演防御的角色 (et 2004)。 除了 外， 族還包括血漿中的 粒線體與細(xì)胞質(zhì)中的 以及主要位于細(xì)胞膜上的 一種強(qiáng)力抗氧化劑，而 度在人類治療癌癥病人有很大關(guān)系 ( et , 1999; M et 1998)， 經(jīng)由 便把細(xì)胞內(nèi)外許多部位所產(chǎn)生的 脂質(zhì)過氧化物，還原成不具毒性的 是水 (1983; 1993)。至于 可再經(jīng)由麩胱甘肽還原酵素 (原為 此在細(xì)胞膜表面， 藉由這些反應(yīng)來對抗外來的過氧化氫，以達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的功能(et 1993)。 - 14 - B. 硒 1957 年 實(shí)硒是生物必需微量元素，而且是一種多功能的人體必需的微量元素。硒具有抗脂質(zhì)過氧化，保護(hù)生物膜的作用。硒是一種化學(xué) 元素 ，它的 化學(xué)符號 是 原子序 34，屬 于 非金屬 類，硒缺乏會造成硒蛋白質(zhì)酵素的活性下降。例如：當(dāng)血漿硒的含量過低時(shí)， 活性就會相對減少 (1988)。在人體中大多是以 或是 形式存在。硒最主要的功能是作為各種 且能直接影響其酵素活性及功能。 1973年 證實(shí)硒是 個(gè)必需組成成分。 1982 年 現(xiàn)一種位于膜上，具有 性，且可以用磷脂氫過氧化物作為基質(zhì)的酵素 硒的另一種生物活性形式， 功能主要為抗氧化。 C. 基質(zhì)金屬蛋白酵素（ (一 ) 早被描 述與純化的 在 1962 年 初， 從蝌蚪尾巴所發(fā)現(xiàn)的間質(zhì)性膠原酶 (始 ( ., 1962)， 而后才被更名為 。文獻(xiàn)上顯示， 腫瘤發(fā)生有極大的關(guān)系，腫瘤要發(fā)生轉(zhuǎn)移之前必須先降解細(xì)胞外的基質(zhì)而 在原位增殖性腫瘤變成侵襲轉(zhuǎn) 移 癌 的 演 進(jìn) 過 程 中 ， 扮 演 著 極 重 要 的 角 色 ( 2009) 。 一種可分解細(xì)胞外基質(zhì)(蛋白酵 素， 不管在正常或病態(tài)的細(xì)胞 中， - 15 - 它們都扮演著重要角色。文獻(xiàn)指出，蛋白質(zhì)水解酶出現(xiàn)在輔助基底細(xì)胞 (量比在惡性侵略的細(xì)胞為 多， 暗示 了 腫瘤細(xì)胞可能會引發(fā)基質(zhì)細(xì)胞附近 的 蛋白質(zhì)水解 酶被 制造 ， 更直接的說法就是腫瘤發(fā)生后會刺激正常細(xì)胞產(chǎn)生額外的膠原酶、基質(zhì)溶素、以及明膠酶 A (., 2003)。至于侵略性的癌細(xì)胞則會增加它們蛋白水解的能力，而非僅增加蛋白質(zhì)水解酶的制 造量 (1992)。 此外， 它們還可集中蛋白質(zhì)水解酶作用于細(xì)胞外 圍， 誘發(fā)它制造出更多種的蛋白質(zhì)水解 酶， 以至基質(zhì)能完全分解 (1992)。文獻(xiàn)也顯 示，在 癌癥的發(fā)展過程中， 作用力會大于其被抑制 的效力，因此可導(dǎo)致 腫瘤細(xì)胞通過血管細(xì)胞 壁發(fā)生轉(zhuǎn)移， 并可促使惡性腫瘤生長所需的血管得以增生 ( 2006)。 (二 ) , 9; , 9 , 9 之分子量分別為 72 92 于兩種不同的明膠酶 (金屬蛋白酶 ( 它們 可分解第與型基底層 ( 非纖維狀膠原 質(zhì)， 也可分解第型的膠原質(zhì)、纖維結(jié)合蛋白 ( 型的短鏈膠原質(zhì)、彈性蛋白以及金屬蛋白酶 ( 2000)。 三種 比較表： 明膠酵素 A I; 72 - 16 - 明膠酵素 B , IV 92 2 金屬彈性蛋白酵素 V; 2 獻(xiàn)上提及 , 9 與癌癥的關(guān)系非常多，以下列舉幾個(gè)例子： 研究指出當(dāng)乳癌病患血中的 濃度增加時(shí) ， 則 該患者預(yù)后會較差 (2010)。 研究指出 和 活性高低與頭部和頸部癌正有關(guān)（ . et 2010） 。 研究指出在 在乳癌中會上升。 (. et 2010) 。 研究指出 加會促進(jìn)睪丸生殖細(xì)胞腫瘤發(fā)生。(et 2010) 。 和 是啟動多種癌癥風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)鍵角色之一，例如頸部癌與乳癌。 (. et 2010) 。 正常子宮頸組織的 表現(xiàn)多為陰性或弱陽性。可是 在子宮頸癌的表現(xiàn)率高達(dá) (孫 , 2008)。 、 、 等蛋白質(zhì)參與了黑色素瘤的 - 17 - 血管生成，其中 的作用尤其重要 (張 , 2005)。 食道鱗狀癌組織中， 和 ， 明顯高于癌組織旁正常粘膜組織的 ( P 二者在食管鱗狀癌中的表現(xiàn)呈現(xiàn)正相 關(guān)， 且與癌組織的分化 程度、侵襲深度、以及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移密切相關(guān) ( P (鄭 , 2005)。 D. 細(xì)胞移行 斑馬魚 是目前在該領(lǐng)域最常被用于做研究的生物，由于其胚胎透明，所以可在高解析度快進(jìn)攝影技術(shù)的幫助下，讓人觀察到細(xì)胞遷移的過程，并且可以利用 綠色螢光蛋白 (察細(xì)胞在斑馬魚體內(nèi)的分布情況 (et 2006)。 細(xì)胞骨架的定義分為狹義和廣義兩種 ： 前者是 微絲 、 微管 和 中間纖維 的總稱 ， 它們存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi) ， 又被稱為胞質(zhì)骨架 ； 后者則再包括 細(xì)胞 外基質(zhì) ( 核骨架 (核纖層 (細(xì)胞骨架是細(xì)胞運(yùn)動、胞器固定、細(xì)胞外型維持、細(xì)胞內(nèi)訊息傳導(dǎo)以及細(xì)胞分裂的基本物質(zhì)之一 (et 2006)。 器官發(fā)生 損傷時(shí)會對基體造成部分細(xì)胞和組織的流失，所以基體必須要對損傷進(jìn)行 修復(fù) (修復(fù)的形式分為兩種： 再生 和 纖維性修復(fù) 。這兩個(gè)過程都涉及到細(xì)胞的遷移，例如：上皮組織中的鱗狀上皮如果出現(xiàn)缺損時(shí)，其邊緣與底部的細(xì)胞就會產(chǎn)生分裂及增生，并向缺損中心遷移。雖然很多細(xì)胞都具有分裂與再生的能力，但是它們 - 18 - 最終能否成功修復(fù)受損組織卻要依賴 細(xì)胞外的基質(zhì) 。舉例來說，有一種細(xì)胞外的基質(zhì)稱為 透明質(zhì)酸 (它存在于遷移細(xì)胞的周圍時(shí)便能抑制細(xì)胞間的粘附，可促使細(xì)胞發(fā)生遷移作用 ( et 2007)。 細(xì)胞移行的五個(gè)步驟： 1. 2. 3. 4. 5. - 19 - 圖 12007) 有關(guān) 細(xì)胞移行間的關(guān)系，已有文獻(xiàn)明確地指出，呼吸道上皮細(xì)胞的修復(fù)機(jī)制中， 的表現(xiàn)與 細(xì)胞的延伸和移行作用有直接的關(guān)連性 (et 1999)。 此外， 也有許多文獻(xiàn)點(diǎn)出，最重要或第一次的上皮細(xì)胞再生的發(fā)生，通常是先起于細(xì)胞的移行而非細(xì)胞直接增生 (1953; 1974)。另外，在快速重建的細(xì)胞結(jié)構(gòu)中，細(xì)胞移行也扮演了重大的角色 (et 1996)。 身也 參與細(xì)胞的發(fā)炎反應(yīng)、腫瘤侵襲以及轉(zhuǎn)移。(F M, 1997; F 1998). - 20 - E. 生理功能： 于 族成員 之一，它的特點(diǎn)是 對于細(xì)胞膜上脂質(zhì)過氧化的親和力很高 (et 1995)，故被認(rèn)為是細(xì)胞膜上抵抗氧化傷害的第一道防御系統(tǒng) (et 1999)。在缺乏老鼠胚胎纖維母細(xì)胞中，其胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物的累積量會上升，而將細(xì)胞又暴露于高度氧化的壓力下，則更會引發(fā)細(xì)胞的死亡(et 2003; et 2003)。 除此之外， 精子形成和運(yùn)動方面也有關(guān)鍵性的角色， 以非酵素活性的形式，組成成熟 精子粒線體微囊的結(jié)構(gòu)蛋白，而粒線體維囊是包裝精子運(yùn)動所需能量 特有結(jié)構(gòu)。所以， 了可保護(hù)精子抵抗氧化的環(huán)境外，也成就了精子的運(yùn)動能力 (et 1999; et 2005)。 有文獻(xiàn)提到，過度表現(xiàn) 有效減少細(xì)胞內(nèi) 脂質(zhì)過度氧化，并抑制環(huán)氧酵素和脂氧酵素的活性，因此有利于減緩發(fā)炎的反應(yīng)( 1993; et 1996; et 1999; 1999 )。 還原過氧化氫的活性較差，但是對于磷 脂氫過氧化物則具有較高的活性。此外，它也能夠保護(hù)細(xì)胞免受氧化型低密度脂蛋白 (傷害，故對動脈粥樣硬化具有預(yù)防的效果 ( 1994)。 - 21 - 第三節(jié) 實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c設(shè)計(jì) 一、 研究目的 由文獻(xiàn)的匯整得知，大多數(shù)的癌細(xì)胞皆含有大量的 S et 1999)。而癌細(xì)胞之惡化程度與細(xì)胞是否會進(jìn)行移行，并導(dǎo)致癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系 (., 2010) 。 根據(jù)這兩項(xiàng)事實(shí)的串聯(lián)，于是我們假設(shè)細(xì)胞內(nèi)的 量多寡可能與癌細(xì)胞會發(fā)生移行有些相關(guān)。如果假設(shè)確定，則將進(jìn)一步去探討 身除了之前所述與抗氧化有關(guān)之外，它是否還有其他未知的功能角色。 - 22 - 二、 研究設(shè)計(jì) 圖 1驗(yàn)架構(gòu) 三、 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)說明 研究將采 用本實(shí)驗(yàn)室先前所建立之受誘導(dǎo)而能大量或減低現(xiàn)的穩(wěn)定型 胞株。首先會執(zhí)行 確認(rèn)細(xì)胞中的 量高低是否會對細(xì)胞愈合有所影響。接下來是2O2 EM SH - 23 - 以西方墨點(diǎn)法來觀察細(xì)胞中的 及 之相關(guān)性，以深入探討 細(xì)胞移行的影響機(jī)制如何。 假設(shè)胞內(nèi) 量的高低的確會影響細(xì)胞的愈合，則第二階段的 們將使用 及使用 間接抑制 抗氧化活性。藉 由處理，我們將可厘清 響細(xì)胞愈合的能力到底是透過其抗氧化的功能，還是由于它本身即是一種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)所致。當(dāng)然我們也會以西方墨點(diǎn)法來觀察在 處理之下，細(xì)胞內(nèi) 含量與 及 之表現(xiàn)量的相關(guān)性，以證實(shí) 如何去影響細(xì)胞的移行。 第三階段我們將更進(jìn)一步使用 去看細(xì)胞的運(yùn)動能力是否真的和細(xì)胞內(nèi)的 量有關(guān)，并 以前述同樣的處理方式，來證明 響細(xì)胞運(yùn) 動的機(jī)制為何。 - 24 - 第二章 材料與方法 第一節(jié) 藥品材料 A 50% s s ,5 M s - 25 - X () () N,N,N,N - 26 - m) 22他： 脫脂奶粉 6, 24 , 10 cm 5, 50 ml - 27 - 第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)方法 一、 子宮頸上皮癌細(xì)胞 (培養(yǎng) 胞培養(yǎng)在含有 10 % 養(yǎng)皿中，培養(yǎng)環(huán)境為 5 % 5 %空氣，溫度為 37 。當(dāng)細(xì)胞長滿時(shí)以 理細(xì)胞以執(zhí)行繼代培養(yǎng)。 二、 備 經(jīng)過 g/ 理過之 使用 別加入 5 l/ 1置 15 分鐘，將細(xì)胞刮下并使用 吸數(shù)次。接著以 12000 下離心 5 分鐘。取上清液為細(xì)胞溶解液，冷凍于 用。 【藥品試劑】 A. X : 20 g 0.1 g g g 加 去離子水 至體積 500 - 28 - 蛋白質(zhì)濃度測定 測定原理是依據(jù) et 1951)所發(fā)表之方法，先 配置 5種濃度的 濃度分別為 : 0、 體積 0.4 取 l 樣品液加上 l 去離子水使總體積為 0.4 管先加入 2 液均勻混合，于室溫下靜置 20 分鐘，再于每管加入0.2 N 之 s 蕩混