【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）抗菌肽LfcinB15-W4,10多拷貝表達(dá)載體的構(gòu)建及融合表達(dá)微生物制劑與應(yīng)用技術(shù)碩士論文

密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩士學(xué)位論文 抗菌肽 0 多拷貝表達(dá)載體的 構(gòu)建及融合表達(dá) of 0 F of 0 I 摘 要 隨著傳統(tǒng)抗生素的廣泛使用，關(guān)于藥物殘留和菌株耐藥性等問題的爭論日益激烈。研究與開發(fā)更為有效，同時(shí)對人、動物及環(huán)境安全 無害 的傳統(tǒng)抗生素替代品是當(dāng)今科研領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。抗菌肽由于具有有效的抗菌活性及 獨(dú)特 的抗菌機(jī)制，在替代傳統(tǒng)抗生素方面顯示了巨大潛力。牛乳鐵蛋白肽（ 其衍生肽具有高效廣譜抗菌等多種生物學(xué)功能。其衍生肽 0 是由 15 個氨基酸殘基組成的陽離子型抗菌肽 ， 由于氨基酸序列的優(yōu)化，其功能活性較 所提高，且本身不含稀有氨基酸和外源化學(xué)成分，所以是一種極具應(yīng)用潛力的健康安全的抗菌替代物。本研究 比較了 0 和 常用抗生素的體外抑菌活性， 通過基因工程技術(shù)表達(dá) 0，為 大 規(guī)模生產(chǎn) 0 奠定 了 理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。本研究主要結(jié)論如下： 在 體外抑菌實(shí)驗(yàn)中，化學(xué)合成 0 的總體抑菌效果比青霉素、金霉素、鏈霉素、多西環(huán)素稍差，但是仍然對測試菌株表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌 活性 。根據(jù) 0 氨基酸序列，按照大腸桿菌密碼子偏愛性設(shè)計(jì)合成編碼基因 ， 設(shè)計(jì)非對稱粘性末端 5 接酶作用下首尾串聯(lián)成多聚體編碼序列。分別設(shè)計(jì)含有 和 酶切位點(diǎn)的接頭，將多聚體編碼基因定向插入表達(dá)載體 建重組表達(dá)載體 0)n。經(jīng)菌落 序驗(yàn)證后得到含有單拷貝至七拷貝和九拷貝編碼基因的轉(zhuǎn)化子。 導(dǎo) 表達(dá) ，蛋白質(zhì)電泳分析結(jié)果表明不同拷貝數(shù)的多聚體融合蛋白得到特異性誘導(dǎo)表達(dá)，其中四聚體融合蛋白表達(dá)水平最高，占菌體 總 蛋白的 45%。經(jīng) 親和層析柱純化回收四聚體融合蛋白，純度達(dá)到 上，每 1 升細(xì)菌培養(yǎng)物可得到約 73 合蛋白。按照每毫克四聚體融合蛋白加入 5 單位凝血酶進(jìn)行裂解，在 25 保溫 48h 可實(shí)現(xiàn)完全裂解，經(jīng)電洗脫回收得到純度在 99以上的 0 四聚體。利用薄層瓊脂擴(kuò)散法檢測重組 0 四聚體抑菌活性，對金黃色葡萄球菌 5923 具有明顯的抑制作用。經(jīng)微量肉湯稀釋法測定其 對金黃色葡萄球菌 最小抑菌濃度 （ 為 16 g/ 本實(shí)驗(yàn)成功實(shí)現(xiàn)了抗菌肽 牛 乳鐵蛋白 肽 衍生肽 0 在大腸桿菌 的串聯(lián)融合表達(dá)，平均每升細(xì)菌培養(yǎng)物最終可以獲得 10 度 99以上的具有抑菌活性的重組0 四聚體，為基因工程方法生產(chǎn) 0 及其它抗菌肽奠定了理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞 ： 抗菌肽，牛乳鐵蛋白肽，多聚 體 化 ， 融合表達(dá)， 大腸桿菌 on of of to is of be in as of to of as as 0 is a 5 0 of of t so it is of In 0 0 by is in In of in 0 0 in 0 on to . 4 0 of 0)n. to by CR NA In 0 5% of 73 mg 0)4 . by at a U/mg 5 8 9% . 5923. IC . 5923 6 g/mL by 0 10 mg of 9% a 0 to 錄 第一章 引言 . 1 究目的與意義 . 1 菌肽研究進(jìn)展 . 1 介 . 1 菌肽的來源及分類 . 1 菌肽生物學(xué)功能及其機(jī)理 . 5 菌肽基因工程 . 7 菌肽研究前景 . 8 鐵蛋白肽研究進(jìn)展 . 9 鐵蛋白（ 介 . 9 鐵蛋白肽及其衍生肽研究進(jìn)展 . 10 第二章 0 抑菌活性測定 . 19 驗(yàn)材料 . 19 驗(yàn)方法 . 19 驗(yàn)結(jié) 果 . 20 論與討論 . 21 第三章 0 串聯(lián)多聚體表達(dá)載體構(gòu)建及其融合表達(dá) . 22 驗(yàn)材料 . 22 粒與菌株 . 22 飾酶類與其他生化試劑 . 22 物合成及 序 . 22 養(yǎng)基及緩沖液等配制 . 23 要儀器設(shè)備 . 24 驗(yàn)方法 . 24 0 編碼基因串聯(lián) . 24 組表達(dá)載體構(gòu)建及其鑒定 . 27 組融合蛋白表達(dá)及誘導(dǎo)條件優(yōu)化 . 30 的融合蛋白表達(dá)純化 . 31 血酶裂解融合蛋白及 0 多聚體純化 . 32 組 0 多聚體抑菌實(shí)驗(yàn)及 定 . 32 驗(yàn)結(jié)果 . 33 0 編碼基因串連連接 . 33 組表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化子鑒定 . 33 合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) . 33 導(dǎo)條件優(yōu)化 . 35 目的融合蛋 白的純化 . 37 血酶酶切及四聚體電洗脫回收 . 38 0 四聚體抑菌實(shí)驗(yàn)及 定 . 38 論與結(jié)論 . 40 乳鐵蛋白肽衍生肽 0 . 40 因工程表達(dá) 0 . 40 論 . 43 參考文獻(xiàn) . 45 致 謝 . 53 作者簡歷 . 54 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 引言 1 第一章 引言 究目的與意義 在日常生產(chǎn)和醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域?yàn)E用抗生素，引起的大量耐藥性菌株的產(chǎn)生和藥物殘留等問題 的爭論日益激烈，其解決方案越來越受到科學(xué)家以及高層決策者的普遍關(guān)注。研究與開發(fā)更為有效，同時(shí)對人體和動物及環(huán)境有安全保障的抗生素替代品成為當(dāng)今科研領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一?？咕模?乳鐵蛋白肽（ 其衍生肽具有高效的廣譜抗菌活性等多種生物學(xué)功能，且本身不含稀有氨 基酸和外源化學(xué)成分，所以是一種極具應(yīng)用潛力的健康安全的抗菌替代物。其 15 肽衍生肽 0 由于其氨基酸序列的優(yōu)化，其功能活性較 較大提高。由于 0 不同于傳統(tǒng)抗生素的抗菌機(jī)制，而在實(shí)際應(yīng)用中不易產(chǎn)生耐藥性菌株，因而在替代傳統(tǒng)抗生素方面顯示了巨大的潛力和廣闊的應(yīng)用前景。用傳統(tǒng)化學(xué)合成法生產(chǎn) 0，其生產(chǎn)工藝復(fù)雜，對設(shè)備要求高，成本昂貴。本課題的研究目的即利用基因工程技術(shù)構(gòu)建 0 重組表達(dá)載體，以期構(gòu)建基因工程菌株， 高效表達(dá) 0，并對重組 0 的抑菌活性進(jìn)行鑒定。解決 0 來源問題、降低其生產(chǎn)成本，為下一步規(guī)模生產(chǎn)抗菌肽 0 創(chuàng)造條件，奠定理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。構(gòu)建重組表達(dá)載體，在大腸桿菌中利用基因工程技術(shù)表達(dá) 0，還為研究和生產(chǎn)其它種類活性肽，提供重要依據(jù)，對活性肽類規(guī)?；a(chǎn)和應(yīng)用具有重要意義。 菌肽研究進(jìn)展 介 青霉素的發(fā)現(xiàn)與廣泛應(yīng)用使人們在應(yīng)對病原微生物感染而引發(fā)的各類疾病時(shí)不再束手無 策，并由此研制了大量的 保護(hù)人類健康做出了巨大貢獻(xiàn)。但隨著傳統(tǒng)抗生素的廣泛使用，不斷產(chǎn)生出諸多新的問題。其負(fù)面作用主要有： 品或飼料工業(yè)中抗生素的添加，導(dǎo)致產(chǎn)品中抗生素藥物的殘留，直接威脅人類健康，破壞生態(tài)環(huán)境；破壞生物機(jī)體內(nèi)正常的微生態(tài)平衡；對人和動物的機(jī)體免疫力產(chǎn)生不良影響（熊家林等， 2001；郭興華等， 2002）。于是人們開始尋找新型的抗菌制劑，研究發(fā)現(xiàn)，某些陽離子型生物多肽具有廣譜的抗菌活性，同時(shí)在抗菌機(jī)制等方面具有許 多傳統(tǒng)抗生素?zé)o法比擬的優(yōu)越性，且目前為止還未發(fā)現(xiàn)會誘導(dǎo)抗藥菌株的產(chǎn)生，很有希望成為新一代抗菌制劑（ 1997）。 菌肽的來源及分類 生物在進(jìn)化過程中，機(jī)體必須具備防御有害病原體入侵的防御機(jī)制才能得以生存繁衍，因而中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 引言 2 在長期進(jìn)化過程中形成了巧妙而又復(fù)雜的免疫系統(tǒng)。普遍認(rèn)為高等生物有機(jī)體在受到病原體入侵時(shí)，首先起作用的是先天性免疫機(jī)制，其次才是 T 細(xì)胞與 B 細(xì)胞等免疫細(xì)胞的獲得性免疫機(jī)能發(fā)揮作用，二者共同抵擋病原體的侵染。研究發(fā)現(xiàn)，在自然界中，昆蟲、哺乳動物和兩棲動物等許多種類的生物有機(jī)體的先 天免疫系統(tǒng)能夠產(chǎn)生各種種類的活性物質(zhì)用來抵御病原微生物的侵害（ ， 1998）。先天性免疫是保護(hù)有機(jī)體免受外來病原體侵害的第一道屏障。而對于低等動物，它們在沒有淋巴細(xì)胞和抗體的情況下，依賴于體內(nèi)一種不同于傳統(tǒng)抗菌物質(zhì)的活性肽來抵抗微生物的入侵，抗菌肽的存在對于它們抵抗病原微生物侵害顯得尤為重要（ 001），在免疫防御系統(tǒng)中扮演著極為重要的角色。在機(jī)體受到病原體侵害時(shí)，抗菌肽以活性形式由細(xì)胞或組織內(nèi)合成或釋放出來，發(fā)揮抗菌及其它生物學(xué)功能（ 2003）。 抗菌肽能夠有效殺死細(xì)菌或抑制細(xì)菌生長，其生成和釋放是宿主免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分（ 2003），天然的抗菌肽通常是由十幾個至幾十個氨基酸殘基組成的小分子多肽，一般小于 10 有多個帶正電荷的氨基酸，如賴氨酸（ 精氨酸（ 多數(shù)抗菌肽的等電點(diǎn)大于 7，表現(xiàn)出較強(qiáng)的陽離子性， N 端親水， C 端疏水具有雙親性，水溶性好，具有較好的熱穩(wěn)定性，對較高的離子強(qiáng)度和 均具有較強(qiáng)的抗性。此外部分抗菌肽具備抵抗胰蛋白酶或胃蛋白酶水解的能力，例如 ?？咕挠苫蚓幋a、核糖體合成（ ， 2004），或由大分子功能蛋白降解形成。 人首次通過對滯育的天蠶 注入活的 為誘導(dǎo)，從蠶蛹的血淋巴中首次分離出兩種低分子量的，具有極強(qiáng)抗菌活性的肽類物質(zhì)（ ，1980）。后來，霍夫曼等人證實(shí)了這些肽的存在。他們用事先浸泡在細(xì)菌培養(yǎng)液中的針頭對昆蟲進(jìn)行注射，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌對昆蟲沒有產(chǎn)生任何影響，而在 12 至 24h 以后，昆蟲產(chǎn)生了大量的肽類抗菌物。 人在 公布了它們的一級結(jié)構(gòu)并給這類肽正式命名為 1981）。所以抗菌肽原先的概念是某些昆蟲經(jīng)外部刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生的具有抗菌作用 的 肽類物質(zhì)。 （ 1989）從豬的小腸中分離到與抗菌肽同源性極高的短肽序列，使人們對抗菌肽的起源 及其 在生物進(jìn)化中的地位產(chǎn)生了新的見解。隨后又在其他生物體內(nèi)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了多種抗菌肽，隨著研究的深入和進(jìn)一步展開， 一些抗菌肽的氨基酸序列和基因序列陸續(xù)得到確定。 如蛙皮素（ 蜂毒素（ 防御素（ （石強(qiáng)與劉飛鵬， 2000）?？咕姆植紡V泛，由于近年來人們對抗菌肽的愈加關(guān)注及多肽分離鑒定及合成技術(shù)的不斷進(jìn)步，如今抗菌肽的發(fā)現(xiàn)速度越來越快，發(fā)現(xiàn)的種類越來越多。圖 1出了截止到 2001 年來已發(fā)現(xiàn)的抗菌肽數(shù)量。到 2004 年 11 月 1 日為止（ 已有 880 種抗菌肽從各種不同的生物組織中分離 得到 ，其來源包括昆蟲、植物、兩棲類動物、哺乳動物、魚類、蟹類、線蟲類、蠕蟲類等各類生物。 抗菌肽在自然界中分布廣泛，來源不一， 雖然在序列和結(jié)構(gòu)上各不相同，但還是有很多共同的特征，例如分子量比較小，并且?guī)в休^強(qiáng)的正電荷和具有雙親性的結(jié)構(gòu)等。按照抗菌肽的結(jié)構(gòu)特征，可以分為以下幾類（ 2002）：（ 1）陽離子型抗菌肽，是抗菌肽種類最多的一類，到目前為止，已經(jīng)從不同物種中發(fā)現(xiàn) 400多種陽離子型抗菌肽，其中一半以上在昆蟲體內(nèi)分離得到。陽離子型抗菌肽按照結(jié)構(gòu)不同又可分為以下三類：單鏈無半胱氨酸殘基的 螺旋或由無規(guī)卷曲連接的兩段的 螺旋組成的肽， 括一個或幾個 二硫鍵的富含半胱氨酸的抗菌肽；富含某種氨基酸如 1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 引言 3 圖 1980 至 2001 年已發(fā)現(xiàn)的抗菌肽數(shù)量 1of 980 001 圖 1980 至 2001 年每年新發(fā)現(xiàn)的抗菌肽數(shù)量 1of 980 001 一些陽離子型抗菌肽及其特性。（ 2）陰離子型抗菌肽，是在哺乳動物上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一類新型抗菌肽。（ 3）芳香族二肽。（ 4）來源于氧結(jié)合蛋白的多肽。（ 5）由已知功能的較大的多肽或蛋白質(zhì)解離而來的具有抗菌活力的肽。表 1 近幾年國內(nèi)外科學(xué)家比較感興趣和研究較為成熟的抗菌肽有天蠶素（ 蛙皮素（ 峰毒素（ 鐵蛋白肽（ 。其中乳鐵蛋白肽（ 稱 來源是天然產(chǎn)物乳汁，本身不含稀有氨基酸和外源化學(xué)成分，所以 為一種更為健康安全的產(chǎn)品從眾多的抗菌肽中脫穎而出，越來越受到各國科學(xué)家們的親睞 ?？咕膶Υ蠖鄶?shù)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌、真菌、病毒、寄生蟲都具有不同程度的抑制作用?，F(xiàn)在大多數(shù)研究者均認(rèn)為抗菌肽是自然界普遍存在的抵御病原微生物感染的一道防線，它可在生物體的各個器官組織的免疫防御系統(tǒng)中抵御外源病原物的入侵。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 引言 4 表 1離子型抗菌肽（ 2002） 2002) 結(jié)構(gòu)及代表性抗菌肽 來源 抗微生物活性 陽離子型抗菌肽 蟲，豬 細(xì)菌，真菌，病毒，原蟲 囊組織 細(xì)菌 棲類動物 細(xì)菌，原蟲 棲類動物 細(xì)菌，真菌 富含某種氨基酸的抗菌肽 富含 蠅 細(xì)菌 翅目昆蟲 細(xì)菌，真菌 富含 翅目昆蟲 細(xì)菌 富含 細(xì)菌，真菌 富含 細(xì)菌 含有一個二硫鍵的抗菌肽 雙翅目昆蟲 細(xì)菌，真菌 蛙 細(xì)菌 含有兩個二硫鍵的抗菌肽 I 鱟 細(xì)菌，真菌，病 毒 子 細(xì)菌，真菌 豬 細(xì)菌，真菌，病毒 含有三個二硫鍵的抗菌肽 乳動物 細(xì)菌，真菌 乳動物 細(xì)菌，真菌 蟲 細(xì)菌，真菌，原蟲 細(xì)菌，真菌 含有多于三個二硫鍵的抗菌肽 細(xì)菌，真菌 蠅 真菌 子 細(xì)菌，真菌，原蟲 翅目昆蟲 細(xì)菌，真菌 物 真菌 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 引言 5 表 1陽離子型抗菌肽（ 2002） 2002) 結(jié)構(gòu)及代表性抗菌肽 來源 抗微生物活性 陰離子型抗菌肽 神經(jīng)肽衍生物 ，人 細(xì)菌 牛，人，水蛭，蚌類 細(xì)菌 含有 羊 細(xì)菌 細(xì)菌 芳香族二肽 氨酰 3， 4鱟 細(xì)菌，真菌 來源于氧結(jié)合蛋白的多肽 血藍(lán)蛋白衍生物 蝦 細(xì)菌 血紅蛋白衍生物 扁虱 細(xì)菌 乳鐵蛋白 人 細(xì)菌，病毒 菌肽生物學(xué)功能及其機(jī)理 抗菌肽作為一種分子量低、水溶性好、熱穩(wěn)定性好、抗菌譜廣、安全可靠的抗菌物質(zhì)日益受到人們的關(guān)注?？咕氖撬拗髅庖叻烙到y(tǒng)產(chǎn)生的一類對抗外界病原體感染的肽類活性物質(zhì)，是一種非特異性的免疫應(yīng)答產(chǎn)物，所以微生物和其他一些理化因素都可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗菌肽。抗菌肽的生成和釋放是 宿主免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分?？咕膶?xì)菌、部分真菌、原蟲、病毒及癌細(xì)胞等均具有不同程度的殺傷作用。抗菌肽抗菌活性強(qiáng)， 并且其抗菌譜中包括好多具有傳統(tǒng)抗生素抗性的菌株。關(guān)于抗菌肽的抗菌機(jī)制，一般認(rèn)為抗菌肽 通過改變細(xì)胞膜的通透性而發(fā)揮抗菌作用，這不同于傳統(tǒng)抗生素通過阻斷生物大分子合成和破壞細(xì)胞壁以達(dá)到殺菌目的作用機(jī)理。抗菌肽比傳統(tǒng)抗生素殺菌速度快，極難產(chǎn)生耐藥性菌株。另外，由于一般細(xì)菌和腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜中磷脂（ 子和脂多糖（ 含量較 高，細(xì)胞膜多是帶負(fù)電荷的，而普通細(xì)胞的細(xì)胞膜是近中性的，所以陽離子 型 的抗菌肽更易與細(xì)菌和腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜相結(jié)合，選擇性的抑制細(xì)菌和腫瘤細(xì)胞的生長。因此，抗菌肽顯示出在醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)等各個領(lǐng)域上潛在的研究和應(yīng)用價(jià)值。 菌肽的抗細(xì)菌作用及其機(jī)理 抗菌肽對革蘭氏陰性及陽性細(xì)菌均有殺傷作用。國內(nèi)外已報(bào)道至少有百種以上的細(xì)菌均能被抗菌肽殺死或抑制。 抗菌肽分子可以在細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜上穿孔形成離子孔道，造成細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，引起胞內(nèi)可溶物滲出，而最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡?？咕姆肿邮紫冉Y(jié)合在質(zhì)膜上，接著其分子中的疏水 和兩親性結(jié)構(gòu)也插入到質(zhì)膜中，通過膜內(nèi)分子間的相互位移，抗菌肽分子聚集形成離子中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 引言 6 性通道，使細(xì)菌失去了膜內(nèi)外電勢差而死亡（饒賢才與胡福泉， 2001； ， 1993； ， 1993； ， 1996； ， 1994）。但是， （ 1994）認(rèn)為，抗菌肽只是結(jié)合到了單位膜的表面上，并未插入膜中，更未形成通道。然而，抗菌肽的作用部位是細(xì)菌細(xì)胞膜，以及抗菌肽的作用結(jié)果是導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜通透性增大等基本內(nèi)容是確切無疑的，這也正是抗菌肽與傳統(tǒng)抗生素抗菌機(jī)制不同的 本質(zhì)所在。 關(guān)于離子通道形成的具體過程，不同研究者提出了以下幾種不同模式：第一種為跨膜螺旋束模型（ 又稱為桶狀模型（ 螺旋束模型（ 該模型較適合于疏水性多肽與細(xì)胞膜的作用模式（ ， 1999） ；第二種為蛀洞模型（ 這種模型與第一種相似，但陽離子型抗菌肽如果按照第一種作用模型形成離子型通道時(shí)，會導(dǎo)致電荷密度過高，因此，為降低其電荷 密度，脂質(zhì)與抗菌肽結(jié)合形成離子通道（ ， 1996）；第三種為地毯式模型（ 對于僅由 11于其肽鏈過短而無法貫穿細(xì)胞質(zhì)膜雙層結(jié)構(gòu)（ 992），因此這類抗菌肽首先依靠兩親性結(jié)構(gòu)與質(zhì)膜結(jié)合，當(dāng)濃度達(dá)到裂解細(xì)胞膜的閾值時(shí)，離子通道形成，造成細(xì)胞裂解；第四種為變性劑樣效應(yīng)（ 多肽分子與脂膜結(jié)合的過程中，多肽插入脂膜的磷脂頭部之間，由于磷脂酰乙醇胺的頭部結(jié)構(gòu)占據(jù)了一定的結(jié) 合空間，因此脂質(zhì)結(jié)構(gòu)呈倒錐形，以此來緩解結(jié)合在雙層脂膜的抗菌肽對細(xì)胞膜的作用（ 1998）；第五種為平面擴(kuò)散模型（ 抗菌肽插入脂膜后導(dǎo)致脂膜產(chǎn)生曲張，形成由質(zhì)脂介導(dǎo)的跨膜通道（ ， 1997）。 一般情況下，細(xì)菌胞內(nèi)滲透壓為高滲的，革蘭氏陽性菌的胞內(nèi)滲透壓高達(dá) 20大氣壓，革蘭氏陰性菌亦達(dá) 5大氣壓。在膜上形成跨膜離子通道后，胞內(nèi)離子大量流失，細(xì)胞不能保持其正常滲透壓而死亡。 根據(jù)不同的科學(xué)家研究結(jié)果顯示，抗菌機(jī) 制可能還存在以下幾種模型： a）抑制細(xì)胞呼吸：（ 1996）研究發(fā)現(xiàn)， 時(shí)，就對大腸桿菌表現(xiàn)出強(qiáng)烈的殺菌作用。但當(dāng)其濃度提高到 70 時(shí)，仍然檢測不到細(xì)胞內(nèi) K+的泄漏，這表明 能不是通過改變細(xì)胞通透性來殺菌的。當(dāng)利用 40 理細(xì)菌時(shí)， 1h 后，可檢測到細(xì)胞的呼吸作用變?nèi)酰?6h 后呼吸作用完全停止。由此認(rèn)為， 通過抑制細(xì)胞的呼吸作用來殺菌。 b）抑制細(xì)胞外膜蛋白的合成： （ 1991 年）研究發(fā)現(xiàn) 夠干擾大腸桿菌細(xì)胞外膜蛋白 和 因的轉(zhuǎn)錄，使這些蛋白質(zhì)含量減少，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性增加，細(xì)菌的生長受到抑制。 c）抑制細(xì)胞壁的形成： （ 1988）等研究認(rèn)為，能夠抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的形成，使細(xì)菌不能維持正常的細(xì)胞形態(tài)而生長受阻，但對已經(jīng)形成的細(xì)胞壁無作用。 菌肽的抗真菌作用 研究表明，在感染病菌（注射細(xì)菌或真菌或體壁損傷等）的情況下，昆蟲能快速合成大量抗菌肽，迅速殺滅已侵入的病菌，并阻止病 菌的進(jìn)一步侵染。到目前為止，在昆蟲中已發(fā)現(xiàn)了大量的抗細(xì)菌肽，抗真菌肽及既抗真菌又抗細(xì)菌的抗菌肽。 （ 1993） 從麻蠅中分離出一種抗真菌肽 首次報(bào)道了昆蟲抗真菌肽。 67 個氨基酸殘基組成，分子中富含甘氨酸和組氨酸。其在蒸餾水和鹽溶液中有較強(qiáng)的殺菌能力。有趣的是，從同一蠅中分中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 引言 7 離出的抗細(xì)菌肽 A 對 真菌有增效作用。隨后有從鞘翅目昆蟲東北大黑鰓金龜（ 蟲中分離得到 。 由 84 個氨基酸殘基組成，與麻蠅抗真菌肽 似，分子內(nèi)也富含甘氨酸和組氨酸，且分子量相近，但兩者在氨基酸序列上卻沒有明顯的同源性（ ， 1998）。果蠅幼蟲和成蟲經(jīng)細(xì)菌誘導(dǎo)，均可產(chǎn)生廣譜抗真菌肽 44 個氨基酸殘基組成，分子內(nèi)含 8 個半胱氨酸殘基，形成 4 個二硫鍵（ ， 2004）。 菌肽的抗病毒作用 1993）報(bào)道煙芽夜蛾幼蟲的血淋巴對 6 種 毒有明顯的抑制作用，使 病毒感染力迅速降低，而且這種抗病毒活性具有廣譜性。 （ 1999）試驗(yàn)表明來源于爪蟾的抗菌肽 其它 抗菌肽具有抗皰疹病毒 作用，還發(fā)現(xiàn)人的嗜中性粒細(xì)胞防御素（ 一種皰疹病毒有抑制作用。此外， （ 1998）研究報(bào)道，蜂毒素和天蠶素也可以在亞毒性濃度下抑制艾滋病毒 基因表達(dá)，從而抑制減少 菌肽的抗寄生蟲作用 抗菌肽可以有效地殺滅產(chǎn)生人類及動物的寄生蟲，如瘧疾、 病、萊什曼病等 。目前發(fā)現(xiàn)一種合成的天蠶素 作用的靶目標(biāo)是細(xì)胞質(zhì)膜，它可以快速降低 H 和 的通透性，破壞膜電勢，質(zhì)膜形態(tài)也受到損壞。 1998）研究發(fā)現(xiàn)昆蟲抗菌