DB51T 660-2007 豬肉中己烯雌酚殘留檢測方法－酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法

案號： 四川省地方標(biāo)準(zhǔn) 660 2007 豬肉中己烯雌酚殘留檢測方法 酶聯(lián)免疫吸附測定 ( ig 007布 2007施 四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局 發(fā)布 660 2007 I 目 次 前言 . 范圍 . 1 2 規(guī)范性引用文件 . 1 3 制樣 . 1 品的制備 . 1 品的保存 . 1 4 測定方法 . 1 法提要或原理 . 1 劑和材料 . 1 器和設(shè)備 . 2 定步驟 . 2 果計算和表述 . 2 5 檢測方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度 . 3 敏度 . 3 確度 . 3 密度 . 3 660 2007 言 本標(biāo)準(zhǔn)按 2000 標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則進(jìn)行編制 本標(biāo)準(zhǔn)由 四川省畜牧食品局提出 并歸口。 本標(biāo)準(zhǔn)由 四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局批準(zhǔn) 本標(biāo)準(zhǔn)起草單位： 四川省獸藥殘留監(jiān)控中心、四川省獸藥監(jiān)察所 本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人： 程江 、彭莉、岳秀英、 熊浩山、官艷麗、王海波、吳曉嵐 660 2007 1 豬肉中己烯雌酚殘留檢測方法 酶聯(lián)免疫吸附測定 ( 1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了 豬肉中己烯雌酚 殘留 量 檢 測 的制樣和酶 聯(lián) 免疫 吸附測定 法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬肉中己烯雌酚的殘留量的快速篩選檢測。對于可疑樣品需用確證法確認(rèn) 。 2 規(guī)范性引用文件 下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn) 的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。 準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第 1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則 (, 1997, 6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)則和試驗(yàn)方法 農(nóng)牧發(fā) 20031號 獸藥殘留試驗(yàn)技術(shù)規(guī)范（試行） 3 制樣 品的制備 取適量新鮮或冷凍的空白或 供試豬肉 組織，絞碎并之使均勻，密封。 品的保存 下 冰箱中貯存?zhèn)溆谩?4 測定方法 法提要或原理 豬肉中殘留的己烯雌酚用 叔丁基甲基醚 提取， 酶 聯(lián) 免疫 吸附測定 法 測定 ,其基本原理是抗原抗體反應(yīng)。 酶標(biāo)板的微孔包被有偶聯(lián)抗原， 標(biāo)樣或 樣品 中的 己烯雌酚 與 微孔 中預(yù) 包被 的 偶聯(lián)抗原 競爭 己烯雌酚特 抗體 。 通過洗滌除去 沒有與特異性 抗體 結(jié)合的酶標(biāo)記抗原。加入底物液 ，結(jié)合到板上的酶標(biāo)記物將底物轉(zhuǎn)化為有色產(chǎn)物。 加入終止液，在 450光度值與試樣中 己烯雌酚 濃度 呈 反比。 劑和材料 以下所用的試劑，除特別注明者外均為分析純試劑；水為符合 6682規(guī)定的二級水。 丁基甲基醚 腈 己烷 烯雌酚試劑盒 （采用官方備案的試劑盒 ） 己烯雌酚 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液 0ng/ 酶標(biāo)板 8條 12 孔，包被有偶聯(lián)抗原 酶標(biāo)記物 己烯雌酚 抗體 臨用前將抗體用稀釋了的復(fù)溶液按 1： 11倍稀釋（ 5000的己烯雌酚抗體溶液 底物 溶 液 A 660 2007 2 底物 溶 液 B 濃縮洗滌液 臨用前用水將其稀釋 20倍作為洗滌液 濃縮復(fù)溶液 臨用前用水將其稀釋 5倍作為稀釋了的復(fù)溶液 終止溶液 器和設(shè)備 標(biāo)儀 （配備 450 平 感量 分析天平 感量 漩渦混合儀 蕩器 織勻漿機(jī) 凍離心機(jī) 吹 儀 心管 2050量移液器 單道 20L， 50L， 100L， 1000L；多道 50 250L 定步驟 料的制備 試料的制備包括： 取絞碎后的供試樣品 ,作為供試試料。 取絞碎后的空白樣品 ,作為空白試料。 取絞碎后空白樣品 ,添加適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為空白添加試料。 取和凈化 取 10000r/5 g，置 50 15旋 1蕩 106000r/ 下離心 10上 層清夜移至雞心瓶中。再加 15并兩次上清液， 于 45 水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干 。 加 2雞心瓶中， 旋渦溶解殘留物， 然后將其轉(zhuǎn)移至 20加 2法操作，轉(zhuǎn)移至同一離心管中。在離心管中加 5 渦動 60s， 15， 6000 r/棄 去 上層液體，再加 5離心管中同法操作， 取下層液體， 60下 氮?dú)獯蹈桑尤?1動 60000動 60s，即可 作為試樣供 分析。 品測定程序 （ 20 26條件下操作） 使用前將試劑盒置于室溫（ 20 26 ）平衡 30上， 注意每種液體試劑使用前均須搖勻。 取出需要數(shù)量的酶標(biāo)板微孔條插入框架中，將不用的微孔條放入自封袋，保存于 2 8 。將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣品和標(biāo)準(zhǔn)品均需做兩個平行實(shí)驗(yàn)。 加 入 50 L 標(biāo)準(zhǔn)溶液或試樣溶液 到 微孔 底部 ， 每孔再 加入 50 L 己烯雌酚抗體 溶液 ， 輕輕振蕩混勻， 用蓋板膜封板， 25 環(huán)境 中反應(yīng) 30 倒出孔中液體，將酶標(biāo)板倒置在吸水紙上拍打，去除孔中 液體。每孔加入 250L 洗滌液， 10吸水紙拍干，如此重復(fù)操作共洗板 5 次 。 加入 100L 酶標(biāo) 記物到 微孔 底部 ，用蓋板膜封板， 25 環(huán)境 中反應(yīng) 30出酶標(biāo)板，如前述洗板 5 次。 加入 50L 底物液 A 和 50L 底物液 B 到 微孔 中 ，輕輕振蕩混勻， 25 環(huán)境 避光顯色 15 加入 50L 終止液 到 微孔 中 ，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于 450，測定每孔吸光度值（ 果計算和表述 所獲得的標(biāo)準(zhǔn)或樣品吸光度值的平均值除以第一個標(biāo)準(zhǔn)（ 0標(biāo)準(zhǔn)）吸光度值的平均值再乘以 100%， 660 2007 3 得到以百分比給出的吸光度值，以式（ 示： 百分吸光度值 = 100% 式中 : B 為標(biāo)準(zhǔn)溶液或供試樣 品 的平均吸光度值； 為零濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。 以 標(biāo)準(zhǔn)溶液中 己烯雌酚 濃度 (ng/自然對數(shù)為 分吸光度值為 Y 軸，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。 相對應(yīng)的供試樣品的濃度（ ng/以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出。 也可以求出回歸曲線的方程，計算未知樣品中己烯 雌酚的濃度。如果有專業(yè)計算機(jī)軟件可直接求出