【國家標(biāo)準(zhǔn)】GB 5413.16-2010 嬰幼兒食品和乳品中葉酸(葉酸鹽活(發(fā)布稿.僅供參考-標(biāo)準(zhǔn)分享網(wǎng))

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)010中華人民共和國衛(wèi)生部發(fā)布 2010布 2010施食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中葉酸（葉酸鹽活性）的測定 of in 010 I 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)代替 幼兒配方食品和乳粉 葉酸（葉酸鹽活性）測定 。 本標(biāo)準(zhǔn)與 要變化如下： 對磷酸鹽緩沖液作了調(diào)整； 增加了米粉的處理方法； 增加了光密度法測定步驟。 本標(biāo)準(zhǔn)所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為： 413 010 1 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中葉酸（葉酸鹽活性）的測定 1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了嬰幼兒食品和乳品中葉酸（葉酸鹽活性）的測定方法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于嬰幼兒食品和乳品中葉酸（葉酸鹽活性）的測定。 2 規(guī)范性引用文件 本標(biāo)準(zhǔn)中引用的文件對于本標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標(biāo)準(zhǔn)。 3 原理 利用干酪乳桿菌（ 469 對葉酸的特異性，在含有葉酸的樣品中生長產(chǎn)生的酸度和形成的光密度來測定葉酸的含量。 4 試劑和材料 除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純，水為 6682 規(guī)定的二級水。 胰腺： 稱取 100 燥的雞胰腺， 加 20 餾水， 攪拌 15 離心 10 3000 轉(zhuǎn) /分鐘） ，取上清液，臨用前配制。 生理鹽水：稱取 9.0 g 氯化鈉溶解于 1000 中，分裝于具塞試管中，每管 10 121滅菌 15 周準(zhǔn)備一次。 酸鹽緩沖液 酸鹽緩沖液（ ）：稱取 g 磷酸二氫鉀， g 磷酸氫二鉀，用 1000 溶解。臨用前按 0.5 g/100 入抗壞血酸。 酸鹽緩沖液（用于谷物及谷物制品前處理）：稱取 14.2 g 磷酸氫二鈉，用 1000 溶解。臨用前按 1.0 g/100 入抗壞血酸，用氫氧化鈉溶液 A（ 酸鹽緩沖液 于谷物及谷物制品測試）：稱取 14.2 g 磷酸氫二鈉，用 1000 溶解。臨用前按 1.0 g/100 入抗壞血酸，用氫氧化鈉溶液 A（ 酸鹽緩沖液（ 0.1 ）（用于谷物及谷物制品標(biāo)準(zhǔn)溶液制備）：溶解 g 磷酸二氫鉀于水中稀釋到 1000 氫氧化鉀溶液（ 酸標(biāo)準(zhǔn)品。 水（ ）。 苯（ 壞血酸（ 株：干酪乳桿菌（ 469。 010 2 養(yǎng)基 酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基：胨化乳 15 g，酵母浸膏 5 g，葡萄糖 10 g，番茄汁 100 酸二氫鉀2 g，聚山梨糖單油酸酯 1 g，瓊 脂 10 g，加蒸餾水至 1000 20 25 ）。 121高壓滅菌 15用。 酸桿菌肉湯培養(yǎng)基：胨化乳 15 g，酵母浸膏 5 g，葡萄糖 10 g，番茄汁 100 酸二氫鉀2 g，聚山梨糖單油酸酯 1 g，加蒸餾水至 1000 20 25 ）。 121高壓滅菌 15用。 酸測定用培養(yǎng)基：酪蛋白胨 10 g，葡萄糖 40 g，乙酸鈉 40 g，磷酸氫二鉀 1 g，磷酸二氫鉀 1 g， .2 g， .6 g， .5 g，硫酸腺嘌呤 10 酸鳥嘌呤 10 嘧啶 10 嘌呤 20 山梨糖 0.1 g，谷光甘肽 5 酸鎂 0.4 g，氯化鈉 20 酸亞鐵 20 酸錳 15 黃素 1 生素 酸硫胺素 400 g，泛酸鈣 800 g，煙酸 800 g，生物素 20 g，加蒸餾水至 1000 20 25 ）。 注： 市售商業(yè)化合成培養(yǎng)基效果更穩(wěn)定。 氧化鉀溶液（ 4 ）：稱取 224 g 氫氧化鉀于 1000 杯中，用 400 溶解，冷卻至室溫后，轉(zhuǎn)移至 1000 量瓶中，用水定容。 瓜蛋白酶溶液： 1 g 蛋白酶（活力 6000 U/ 40 ）溶于 100 酸鹽緩沖液（ 。臨用前配制。 1 g ）溶于 100 酸鹽緩沖液（ 。臨用前配制。 m 滅菌濾膜。 準(zhǔn)溶液的制備 酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液（ 500 g/稱取 55 56 確至 0.1 酸標(biāo)準(zhǔn)品（ 用50 餾水轉(zhuǎn)入 100 量瓶中，加 2 水（ 溶液制備后，按式（ 1）計(jì)算溶液的體積，要求貯備液中葉酸鹽的濃度為 500 g/ 貯備液體積（ =5001001000 貯備液體積（ =50 ( 1) 式中： m葉酸標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量，單位為毫克（ ； c葉酸標(biāo)準(zhǔn)品的純度，單位為克每百克（ g/100 g） 。 用水稀釋溶液至刻度，用吸管加水至計(jì)算要求的體積，充分混合，放入棕色試劑瓶中 2 4 冰箱冷藏，保存期為 4 個月。 酸標(biāo)準(zhǔn)中間液（ 50 g/吸取 10 酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液（ 100 色容量瓶中，用水定容至刻度，充分混勻， 2 4 冰箱冷藏，保存期為 1 個月。 酸標(biāo)準(zhǔn)工作液（ ng/0.1 ng/吸取 1 酸標(biāo)準(zhǔn)中間液（ 100 水定容至刻度，混合。再吸該液 1 100 色容量瓶中，定容，混合。 從上液中分別吸取 5 250 500 色容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液（ 容到刻度，混勻，即為高濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液（ 0.1 ng/低濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液（ ng/臨用前配制。 酸（ 1 ）：量取 83.0 酸溶于水中，冷卻后定容至 1000 010 3 氧化鈉溶液 A（ 4 ）：稱取 160 g 氫氧化鈉于 1000 杯中，用 400 溶解，冷卻至室溫后，轉(zhuǎn)移至 1000 量瓶中，用水定容。 氧化鈉溶液 B（ 0.1 ）：吸取 2.5 氧化鈉溶液 A（ 移至 100 量瓶中用水定容。 氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（ 0.1 ）：稱取 4 g（精確至 g）氫氧化鈉用水稀釋至 1000 鄰苯二甲酸氫鉀標(biāo)定。保存此溶液的容器要密封，以防二氧化碳滲入。 氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)定：稱取約 g（精確至 g）于 105 110 烘至恒重的鄰苯二甲酸氫鉀，用 50 二氧化碳的水溶于錐形瓶中，加兩滴 5 g/L 的酚酞指示劑，用配好的氫氧化鈉溶液滴定至粉紅色，同時作空白實(shí)驗(yàn)。按式（ 2）計(jì)算氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度： c=( 2) 式中： c氫氧化鈉的濃度，單位為摩爾每升（ ） ； m稱取的鄰苯二甲酸氫鉀的質(zhì)量，單位為克（ g） ； 氫氧化鈉溶液的用量，單位為毫升（ ； 空白試驗(yàn)氫氧化鈉溶液的用量，單位為毫升（ 。 酞溶液：取 0.5 g 酚酞溶于 75 積分?jǐn)?shù)為 95 %的乙醇中，加入 20 ，再加入氫氧化鈉溶液（ 直至加入一滴立即變成粉紅色，再用水定容至 100 麝香草酚藍(lán)指示劑：稱取 0.1 g 溴麝香草酚藍(lán)于研缽中，加入 1.6 氧化鈉溶液 B（ 磨，加少許水至完全溶解，轉(zhuǎn)移至 250 量瓶中用水定容。 5 儀器和設(shè)備 5.1 ：精度為 心機(jī)：轉(zhuǎn)速 2000 轉(zhuǎn) /分鐘。 光光度儀。 平：感量為 0.1 化培養(yǎng)箱： 36 1 定管：分刻度值為 0.1 渦旋振蕩器。 6 分析步驟 試菌液的制備 酪乳桿菌 （ 469 凍干菌粉轉(zhuǎn)入乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基 （ 中， 36 1 培養(yǎng) 24 h 后，轉(zhuǎn)接至乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基（ 管中，再 36 1 培養(yǎng) 24 h。培養(yǎng)好的乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基（ 管的培養(yǎng)物作為貯備菌種。 010 4 貯備菌種培養(yǎng)基上分別轉(zhuǎn)接到三個乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基 （ 試管中， 放入培養(yǎng)箱中 36 1 培養(yǎng) 24 h。每月轉(zhuǎn)接一次，作為月接種管貯于冰箱中。每月定期從月接種管中重新接種 3 個轉(zhuǎn)接管保存新菌株。 月接種的培養(yǎng)管中的一支再接種一支乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基 （ 試管， 36 1 培養(yǎng) 24 h，作為日接種管每日測定用。 日接種管中接種一管乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基（ 36 1 培養(yǎng) 24 h。在無菌條件下離心該培養(yǎng)液 10 2000 轉(zhuǎn) /分鐘），棄去上清液。用 10 理鹽水（ 蕩洗滌菌體，離心 10 2000 轉(zhuǎn) /分鐘），棄去上清液，用 10 理鹽水（ 蕩清洗。如前離心操作，棄去上清液。再加 10 理鹽水（ 混勻。吸 1 菌懸液于 10 理鹽水（ ，混勻制成測試菌液。 生理鹽水（ 對照，用分光光度計(jì)，于 550 長下，測測試菌液（ 光密度值，此值應(yīng)在 60 % 80 %之間。 樣的制備 制品 稱取 2 g（精確至 g）試樣（約含葉酸 5 g）于 100 杯中，用 25 30 復(fù)原樣品，轉(zhuǎn)入 100 量瓶中，用水定容至刻度，溶液中葉酸的質(zhì)量濃度大約為 g/取 1 胰腺（ 一個 180 5 帶螺旋蓋的試管中，充分混合。加 18 抗壞血酸的磷酸緩沖液（ ，再加 1 苯（ 。同時制備 空白對照管，吸 1 餾水和 1 空白管中，加 18 抗壞血酸的磷酸緩沖液（ 1 苯（ 。在 37 下，樣品管和空白管保溫 16 h 后，于 100 水浴加熱 5 磷酸鹽緩沖液（ 適當(dāng)稀釋，得到濃度約為 0.1 ng/葉酸鹽溶液。 若確定樣品中強(qiáng)化葉酸與原生葉酸相比所占比例很大，則可以用 1 液加 19 抗壞血酸的磷酸緩沖液（ 100 水浴加熱 5 用磷酸鹽緩沖液（ 釋，得到濃度約為 0.1 ng/葉酸鹽溶液。 物及谷物制品 稱取大約含 1 g 葉酸的試樣于 150 角燒瓶中。加 20 mL 酸緩沖溶液（ ，混勻后加 50 和 1.0 苯（ 。加蓋后 121 15 菌，然后迅速冷卻。加 1 瓜蛋白酶溶液（ ，于 36 1 保溫 3h 后 100 加熱 3 卻。加 1 ， 36 1 保溫 2 h 后加 4 胰腺 （ ， 加蓋， 36 1保溫 16 h 后 100 加熱 3 冷卻。 用 1 鹽酸（ 水稀釋定容到 100 濾得到澄清濾液，然后吸取 1 清濾液用磷酸鹽緩沖液 容至 100 到濃度約為 0.1 ng/葉酸鹽溶液。 若確定樣品中強(qiáng)化葉酸與原生葉酸相比所占比例很大則可以直接在樣品中加 20 含抗壞血酸的磷酸緩沖液（ 50 ，于 121 滅菌 15 后吸取 1清濾液， 磷酸鹽緩沖液 釋，得到濃度約為 0.1 ng/葉酸鹽溶液。 準(zhǔn)曲線管的制作 按表 1 順序加入蒸餾水、標(biāo)準(zhǔn)工作液（ （測定谷物及谷物制品的標(biāo)準(zhǔn)溶液用磷酸鹽緩沖液（ 替磷酸鹽緩沖液（ ）和葉酸測定用培養(yǎng)基（ 培養(yǎng)管中。表 1 中每一編號需制作 3 管。試管 ，相當(dāng)葉酸含量為 010 5 表 1 標(biāo)準(zhǔn)曲線管的制作 試管號 2 4 6 8 10 蒸餾水（ 5 5 4 3 2 1 0 2 1 0 標(biāo)準(zhǔn)溶液（ 0 0 1 2 3 4 5 3 4 5 培養(yǎng)基（ 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 注1： 試管 加低濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液。 注2： 試管 加高濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液。 樣管的制作 按表 2 順序加入蒸餾水、試樣和葉酸測定用培養(yǎng)基于試管中，表中每一編號需制作 3 管。 表 2 試樣管的制作 試管號 1 2 3 4 蒸餾水（ 4 3 2 1 樣 品（ 1 2 3 4 培養(yǎng)基（ 5 5 5 5 菌 將標(biāo)準(zhǔn)曲線管和試樣管 121 滅菌 5 速冷卻到室溫（商品化培養(yǎng)基按標(biāo)簽說明進(jìn)行滅菌 )。 注 ：保證加熱和冷卻過程中條件均勻，滅菌管數(shù)過多或距離太近，在滅菌鍋中都可產(chǎn)生不良影響。 種 無菌條件下每管中均加入一滴（約 50 L）菌懸液（ ，加蓋，充分振蕩混勻所有試管（標(biāo)準(zhǔn)曲線未接種空白管 外） 。 養(yǎng) 度法： 36 1 培養(yǎng) 72 h。對每支試管進(jìn)行目測檢查，未接種管內(nèi)培養(yǎng)液應(yīng)是澄清的，標(biāo)準(zhǔn)曲線管和試樣管中培養(yǎng)液的濁度應(yīng)有梯度。未接種管中若出現(xiàn)混濁，則測定無效。 密度法：在 36 1 ，培養(yǎng) 16 h 24 h。其他同 定 度法 10 將未接種空白管 接種空白管 培養(yǎng)物轉(zhuǎn)至三角燒瓶中，以溴麝香草酚藍(lán)（ 指示劑，或用 以 滴定終點(diǎn)用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（ 定標(biāo)準(zhǔn)曲線未接種空白管 S 1 和接種空白管 S 2。記錄下消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液體積。 注： 如果接種空白滴定反應(yīng)消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液體積數(shù)等于或高于未接種空白水平的 1.5 測定結(jié)果無效。 10 將標(biāo)準(zhǔn)曲線管和試樣管中的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)至三角燒瓶中，以溴麝香草酚藍(lán)（ 指示劑，或用 以 滴定終點(diǎn)用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（ 定標(biāo)準(zhǔn)曲線管和試樣管的培養(yǎng)物。記錄下消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液體積。 注： 通常標(biāo)準(zhǔn)曲線管 耗的 0.1 的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液體積數(shù)在 8 12 間。 密度法 010 6 以接種空白管（表 1 中試管號 S 2）作對照，取出最高濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線管 蕩 5 s，在波長 550 回重新培養(yǎng)。 2 h 后同等條件重新測該管的光密度，如果兩次光密度的絕對差結(jié)果 2 %，則取出全部檢驗(yàn)管測定標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣的光密度。 準(zhǔn)曲線的繪制 以標(biāo)準(zhǔn)曲線管葉酸含量作橫坐標(biāo)， 以消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的毫升數(shù)或光密度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 樣管中葉酸含量的計(jì)算 按照 個試樣管測定的消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的毫升數(shù)或光密度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得對應(yīng)的葉酸含量。每一編號的三個試樣管應(yīng)計(jì)算管中每毫升測定液葉酸的含量，并與其平均值相比較。相對偏差小于 15 %的試管為有效試管，無效試樣管應(yīng)舍去，有效試樣管總數(shù)應(yīng)大于所有試樣管總數(shù)的2/3。重新計(jì)算每一編號的有效試樣管中每毫升測定液葉酸含量的平均值，以此平均值計(jì)算全部編號試樣管的總平均值 注： 樣品管