肺結(jié)核的新診斷技術(shù)課件

1、肺結(jié)核的新診斷技術(shù)1 江蘇省結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室江蘇省結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室 肺結(jié)核的新診斷技術(shù)2 NTP中現(xiàn)行實(shí)驗(yàn)室技術(shù)中現(xiàn)行實(shí)驗(yàn)室技術(shù) 涂片：萋尼染色顯微鏡檢涂片：萋尼染色顯微鏡檢 培養(yǎng)：固體培養(yǎng)基：簡單法、離心法培養(yǎng)：固體培養(yǎng)基：簡單法、離心法 藥敏：固體培養(yǎng)基：絕對濃度法、比例法藥敏：固體培養(yǎng)基：絕對濃度法、比例法 菌種鑒定：鑒別培養(yǎng)基生化試驗(yàn)菌種鑒定：鑒別培養(yǎng)基生化試驗(yàn) 傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)不能適應(yīng)不斷深入的結(jié)核病傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)不能適應(yīng)不斷深入的結(jié)核病 防治工作的需要防治工作的需要 肺結(jié)核的新診斷技術(shù)3 實(shí)驗(yàn)室新診斷技術(shù)總覽 細(xì)菌學(xué)檢測方法 發(fā)光二極管熒光顯微鏡（LED） 液體培養(yǎng) 分子生物學(xué)檢測方

2、法 Genexpert HAIN Genechip 免疫學(xué)檢測方法 ELISOPT 42:2321-2325 2 Mean of 14 studies in MGIT960 = 10.7% (2.0-30.0) = acceptable range 培養(yǎng)方法培養(yǎng)方法 敏感性敏感性 (95% CI) 結(jié)果報(bào)告周期結(jié)果報(bào)告周期 污染污染 (%) 涂陽涂陽涂陰涂陰 羅氏培養(yǎng)羅氏培養(yǎng)0.76 (0.73-0.79)22.333.73 5 MGIT9600.88 (0.84-0.91)11.716.5 13.8-16.6 210.7(2.0-30.0) 5 10 MGIT + 羅羅 氏氏 0.92 (0

3、.87-0.95) 肺結(jié)核的新診斷技術(shù)8 MGIT 7 ml MGIT 7 ml MGIT 7 ml MGIT 7 ml MGIT 7 ml MGIT 7 ml MGIT 7 ml + S MGIT 7 ml + I MGIT 7 ml + R MGIT 7 ml + E GCSIRE 0,8 ml BACTEC MGIT SIRE 補(bǔ)充劑 每種藥物每種藥物0,1 ml 轉(zhuǎn)移 0,5 ml 陽性 MGIT 培養(yǎng)物 0,1 ml 陽性 MGIT 培養(yǎng)物 9,9 ml 蒸餾水 轉(zhuǎn)移 0,5 ml 插入BACTEC MGIT 960 BACTEC MGIT 960 TB 藥敏試驗(yàn)藥敏試驗(yàn) S.I.R

4、.E. 肺結(jié)核的新診斷技術(shù)9 LED顯微鏡顯微鏡 發(fā)光二級管發(fā)光二級管 (LED) 技術(shù)技術(shù) 提供價(jià)廉、穩(wěn)定的光源提供價(jià)廉、穩(wěn)定的光源 壽命壽命 150,000 h 反復(fù)開關(guān)不影響壽命反復(fù)開關(guān)不影響壽命 不釋放有毒氣體不釋放有毒氣體 不需要暗室不需要暗室 操作人員工作負(fù)荷減輕操作人員工作負(fù)荷減輕 肺結(jié)核的新診斷技術(shù)10 肺結(jié)核的新診斷技術(shù)11 GenoType MTBDRplus, HAIN 檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群以及利福平、異煙肼耐藥相關(guān)的突變檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群以及利福平、異煙肼耐藥相關(guān)的突變 檢測檢測XDR的試劑盒也已經(jīng)發(fā)布的試劑盒也已經(jīng)發(fā)布 INNO-Lipa Rif TB 檢測結(jié)核

5、分枝桿菌復(fù)合群以及于利福平耐藥相關(guān)的突變檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群以及于利福平耐藥相關(guān)的突變 大多數(shù)利福平耐藥的菌株同時(shí)也耐異煙肼大多數(shù)利福平耐藥的菌株同時(shí)也耐異煙肼 WHO 鼓勵(lì)使用的工具鼓勵(lì)使用的工具 可使用涂陽痰標(biāo)本和培養(yǎng)物進(jìn)行操作可使用涂陽痰標(biāo)本和培養(yǎng)物進(jìn)行操作 快速、簡便易用，僅需基本快速、簡便易用，僅需基本PCR技術(shù)技術(shù) 然而，價(jià)格比較昂貴，且不能檢測造成耐藥突變的熱點(diǎn)區(qū)域外的突然而，價(jià)格比較昂貴，且不能檢測造成耐藥突變的熱點(diǎn)區(qū)域外的突 變變 11 肺結(jié)核的新診斷技術(shù)12 MTBDRplus 操作流程 DNA提取提取 用用NALC/NaOH 處理痰標(biāo)本處理痰標(biāo)本 2) PCR擴(kuò)增擴(kuò)增

6、3) 雜交雜交 擴(kuò)增產(chǎn)物和擴(kuò)增產(chǎn)物和 固化在固化在 膜上的特異性探針雜交膜上的特異性探針雜交 4) 結(jié)果判讀結(jié)果判讀 肺結(jié)核的新診斷技術(shù)13 rpoB 野生型探針: WT1 - WT8 rpoB 突變探針: MUT1-3: D516V, H526Y, H526D, S531L 野生型缺失 野生型突變 MTBDRplus rpoB 511513516518522526531533 rpoB WT2rpoB WT4rpoB WT6 rpoB WT8rpoB WT7 rpoB MUT1 (D516V) rpoB MUT3 (S531L) rpoB MUT2A (H526Y) rpoB MUT2B (

7、H526D) 514515 rpoB WT1rpoB WT3rpoB WT5 509508505 肺結(jié)核的新診斷技術(shù)14 katG 基因突變 MTBDRplus katG 野生探針區(qū)域突變探針突變 KatG WT315KatG MUT1S315T1 KatG MUT2S315T2 肺結(jié)核的新診斷技術(shù)15 MTBDRplus inhA 野生探針區(qū)域突變探針突變 InhA WT1-15InhA MUT1C15T -16InhA MUT2A16G InhA WT2-8InhA MUT3AT8C InhA MUT3BT8A inhA 基因突變 肺結(jié)核的新診斷技術(shù)16 MTBDRplus 反應(yīng)條帶(示范

8、) 肺結(jié)核的新診斷技術(shù)17 南非的經(jīng)驗(yàn)：南非的經(jīng)驗(yàn)： Genotype MTBDR plus assay: 直接從涂片陽性標(biāo)本中檢測直接從涂片陽性標(biāo)本中檢測rpob基因突變基因突變 (耐利福平耐利福平), katG 基因基因 (高濃度異煙肼耐藥高濃度異煙肼耐藥), inhA 基因基因(低濃度異煙低濃度異煙 肼耐藥肼耐藥) 靈敏度、特異度，陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值靈敏度、特異度，陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值 耐利福平耐利福平 98.9, 99.4, 97.9, 和和99.7 耐異煙肼耐異煙肼 94.2, 99.7, 99.1, 和和 97.9 耐耐MDR-TB 98.8, 100, 100, 和和 99

9、.7 Barnard M, et al. Am J Respir Crit Care Med 2008;177:787-92 肺結(jié)核的新診斷技術(shù)18 激光共焦掃描儀 軟件判讀 結(jié)核耐藥檢測芯片獲北京市自主創(chuàng)新產(chǎn)品證書樣品制備儀雜交儀 n 通 量：兩個(gè)一線抗結(jié)核藥 n 速 度： 6 小時(shí)（比傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)法快 50-100 倍） n 靈敏度：103 CFU/反應(yīng) n 特異性：對照設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)；自動(dòng)判讀 基于rpoB/katG/inhA的基因突變，快速檢測分離株或者痰 樣本中結(jié)核桿菌多藥耐藥（利福平、異煙肼）。 International Journal of Tuberculosis and Lung

10、 Disease, 13:914-920, 2009（IF=2.3）18 獲國家醫(yī)療器械證書和歐盟CE認(rèn)證 肺結(jié)核的新診斷技術(shù)19 Xpert MTB/RIF 檢測結(jié)核分枝桿菌檢測結(jié)核分枝桿菌 檢測利福平耐藥檢測利福平耐藥 直接標(biāo)本檢測直接標(biāo)本檢測 100分鐘可獲得結(jié)果分鐘可獲得結(jié)果 肺結(jié)核的新診斷技術(shù)20 工作流程工作流程 痰 簡單，僅需1個(gè)步驟的準(zhǔn)備工作 獲得結(jié)果的時(shí)間 16 樣本 / 天 / 模塊 不需要生物安全規(guī) 綜合控制 性能性能 對 MTB特異 敏感性與培養(yǎng)相似 通過rpoB 基因檢測利福平耐藥 產(chǎn)品和系統(tǒng)設(shè)計(jì)產(chǎn)品和系統(tǒng)設(shè)計(jì) GeneXpert 系統(tǒng)的檢測模塊 測試模塊的擴(kuò)大和交換

11、 對非分枝桿菌實(shí)驗(yàn)室人員僅需要最多1天的培訓(xùn) GeneXpert 樣本準(zhǔn)備、擴(kuò)增、樣本準(zhǔn)備、擴(kuò)增、 檢測自動(dòng)化檢測自動(dòng)化 痰標(biāo)本可以直接放痰標(biāo)本可以直接放 入模塊中，而無需入模塊中，而無需 與任何試劑進(jìn)行混與任何試劑進(jìn)行混 合處理合處理 肺結(jié)核的新診斷技術(shù)21 報(bào)告結(jié)果時(shí)間報(bào)告結(jié)果時(shí)間: 1 h 45 min GeneXpert DNA 分子與分子與PCR試劑混合試劑混合 樣本自動(dòng)過濾和清洗樣本自動(dòng)過濾和清洗 超聲裂解捕獲的生物體，釋超聲裂解捕獲的生物體，釋 放放DNA 半嵌套實(shí)時(shí)半嵌套實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增擴(kuò)增 & 檢測檢測 集成反應(yīng)管集成反應(yīng)管 4 5 6 濃縮細(xì)菌去除抑制劑濃縮細(xì)菌去除抑制劑 1

12、 2 標(biāo)本液化和作用標(biāo)本液化和作用 15分鐘后轉(zhuǎn)移分鐘后轉(zhuǎn)移 2 ml 3 結(jié)束手工工作結(jié)束手工工作 7 結(jié)果可打印結(jié)果可打印 Xpert MTB/RIF 肺結(jié)核的新診斷技術(shù)22 單中心評估研究（初步結(jié)果）單中心評估研究（初步結(jié)果） 不同研究設(shè)計(jì)和研究人群，肺結(jié)核和肺外結(jié)核標(biāo)本不同研究設(shè)計(jì)和研究人群，肺結(jié)核和肺外結(jié)核標(biāo)本 檢測結(jié)核檢測結(jié)核 匯總的未經(jīng)校正的敏感性匯總的未經(jīng)校正的敏感性 92% 匯總的未經(jīng)校正的特異性匯總的未經(jīng)校正的特異性 98% 檢測利福平耐藥檢測利福平耐藥 匯總的未經(jīng)校正的敏感性匯總的未經(jīng)校正的敏感性 98% 匯總的未經(jīng)校正的特異性匯總的未經(jīng)校正的特異性 99% 肺結(jié)核的新診

13、斷技術(shù)23 操作方面操作方面 廢棄物管理廢棄物管理 如痰標(biāo)本容器如痰標(biāo)本容器 儲存和供應(yīng)儲存和供應(yīng) 反應(yīng)盒龐大反應(yīng)盒龐大, 2 - 28C, 有效期有效期12個(gè)月個(gè)月 電力供應(yīng)電力供應(yīng) UPS (400 VA) 或電池組或電池組 培訓(xùn)培訓(xùn) 需求不高需求不高 (使用計(jì)算機(jī)、預(yù)防污染使用計(jì)算機(jī)、預(yù)防污染) 生物安全生物安全 與涂片鏡檢相同與涂片鏡檢相同 每年校正每年校正 模塊更換模塊更換 安全安全 防盜防盜 (計(jì)算機(jī)計(jì)算機(jī)) 肺結(jié)核的新診斷技術(shù)24 世界衛(wèi)生組織 快速開展快速開展Xpert MTB/RIF診斷試驗(yàn)診斷試驗(yàn) 技術(shù)和實(shí)施方面的考慮技術(shù)和實(shí)施方面的考慮 2011年3月 肺結(jié)核的新診斷技術(shù)

14、25 WHO對對Xpert MTB/RIF的建議摘要：的建議摘要： 高度推薦用于懷疑高度推薦用于懷疑MDR-TB以及合并以及合并HIV感染的結(jié)核感染的結(jié)核 病病人的初診診斷病病人的初診診斷 對于對于MDRTB、HIV不嚴(yán)重的地區(qū)，可以在涂片之后不嚴(yán)重的地區(qū)，可以在涂片之后 考慮使用考慮使用Xpert MTB/RIF，特別是用于診斷涂陰病人，特別是用于診斷涂陰病人 （取決于費(fèi)用）（取決于費(fèi)用） 肺外標(biāo)本的有關(guān)證據(jù)尚有限肺外標(biāo)本的有關(guān)證據(jù)尚有限 增加檢測次數(shù)可能增加敏感性，但需考慮費(fèi)用增加增加檢測次數(shù)可能增加敏感性，但需考慮費(fèi)用增加 適用于兒童適用于兒童 不能替代傳統(tǒng)涂片、培養(yǎng)、藥敏試驗(yàn)不能替代傳

15、統(tǒng)涂片、培養(yǎng)、藥敏試驗(yàn) 肺結(jié)核的新診斷技術(shù)26 步驟 1: 特異抗原激發(fā)淋巴細(xì)胞 IFN- 釋放 陰性對照 ESAT-6 或 CFP-10 孵育 孵 育 顯影 步驟 2: 用ELISA 檢測 IFN- Y Y Y YYY Y Y Y Y Y Y 洗滌 Y Y Y Y Y Y 洗滌 Y Y Y QuantiFERON TB Gold實(shí)驗(yàn) 肺結(jié)核的新診斷技術(shù)27 T-SPOT TB (ELISPOT)技術(shù) 單核細(xì)胞分離TB抗原刺激，IFN- 釋放 一抗捕獲IFN- 與標(biāo)記的二抗結(jié)合 酶作用標(biāo)記物顯色每一斑點(diǎn)代表釋放IFN-的 一個(gè)細(xì)胞 Y Y Y YY Y Y Y Y Y Y Y YYYY Y Y

16、 Y Y YYYY IFN- 抗原 肺結(jié)核的新診斷技術(shù)28 小小 結(jié)結(jié) 用途用途操作操作 生物安生物安 全要求全要求 費(fèi)用費(fèi)用 液體培養(yǎng)液體培養(yǎng)更敏感、快速的培養(yǎng)更敏感、快速的培養(yǎng) LPA/基因基因 芯片芯片 快速診斷快速診斷M/XDR LED涂陽病人發(fā)現(xiàn)涂陽病人發(fā)現(xiàn) Xpert快速診斷快速診斷 NTP中如何應(yīng)用中如何應(yīng)用 給誰用？哪里做？怎么用？給誰用？哪里做？怎么用？ 肺結(jié)核的新診斷技術(shù)29 國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室推薦建議國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室推薦建議 液體培養(yǎng)用于液體培養(yǎng)用于: 結(jié)核病可疑癥狀者檢查, 可以作為結(jié)核?。退帲┑脑\ 斷依據(jù)和結(jié)核病患者治療效果判斷, 液體培養(yǎng)可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)可以代替

17、傳統(tǒng) 培養(yǎng)培養(yǎng) 推薦理由推薦理由: 液體培養(yǎng)在已經(jīng)在我國注冊；液體培養(yǎng)在已經(jīng)在我國注冊； 國內(nèi)外研究顯示其敏感性和國內(nèi)外研究顯示其敏感性和TAT優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)；優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)； 1.數(shù)據(jù)顯示在我國具有可行性數(shù)據(jù)顯示在我國具有可行性,符合成本效果；符合成本效果； 推薦使用層級推薦使用層級: 區(qū)縣、地市和省級（區(qū)縣、地市和省級（醫(yī)療機(jī)構(gòu)和疾病預(yù)防機(jī)構(gòu)）醫(yī)療機(jī)構(gòu)和疾病預(yù)防機(jī)構(gòu)） 肺結(jié)核的新診斷技術(shù)30 國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室推薦建議國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室推薦建議 GenXpert 即將可以用于即將可以用于: 結(jié)核病可疑癥狀者檢查, 可以作為結(jié)核病的輔助診斷方法 和結(jié)核病患者治療效果判斷, 它有望代替?zhèn)鹘y(tǒng)的培

18、養(yǎng)和利福平代替?zhèn)鹘y(tǒng)的培養(yǎng)和利福平 的藥敏試驗(yàn)（可疑耐藥結(jié)核病患者）的藥敏試驗(yàn)（可疑耐藥結(jié)核病患者） 推薦理由推薦理由: 即將在我國獲得注冊證書；即將在我國獲得注冊證書； 國內(nèi)外研究顯示其敏感性和特異性，陽性結(jié)果報(bào)告時(shí)間優(yōu)于傳統(tǒng)國內(nèi)外研究顯示其敏感性和特異性，陽性結(jié)果報(bào)告時(shí)間優(yōu)于傳統(tǒng) 方法；方法； WHO 在全球推薦在全球推薦 1.數(shù)據(jù)顯示在我國具有可行性數(shù)據(jù)顯示在我國具有可行性,符合成本效果；符合成本效果； 可能使用層級可能使用層級: 區(qū)縣（？）、地市和省級區(qū)縣（？）、地市和省級（醫(yī)療機(jī)構(gòu)和疾病預(yù)防機(jī)構(gòu)）（醫(yī)療機(jī)構(gòu)和疾病預(yù)防機(jī)構(gòu)） 肺結(jié)核的新診斷技術(shù)31 國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室推薦建議國家結(jié)核病

19、參比實(shí)驗(yàn)室推薦建議 LPA可以用于可以用于: 可疑耐藥結(jié)核病患者可疑耐藥結(jié)核病患者查,它有望代替利福平和異煙肼的傳統(tǒng)代替利福平和異煙肼的傳統(tǒng) 藥敏試驗(yàn)藥敏試驗(yàn) 推薦理由推薦理由: 在我國獲得注冊證書；在我國獲得注冊證書； 國內(nèi)外研究顯示其敏感性和特異性（國內(nèi)外研究顯示其敏感性和特異性（TAT)較好；較好； WHO 在全球推薦在全球推薦 1.數(shù)據(jù)顯示在我國具有可行性數(shù)據(jù)顯示在我國具有可行性,符合成本效果；符合成本效果； 可能使用層級可能使用層級: 地市和省級地市和省級（醫(yī)療機(jī)構(gòu)和疾病預(yù)防機(jī)構(gòu)）（醫(yī)療機(jī)構(gòu)和疾病預(yù)防機(jī)構(gòu)） 肺結(jié)核的新診斷技術(shù)32 國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室推薦建議國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室推薦建議 基因芯片可以用于基因芯片可以用于: 可疑耐藥結(jié)核病患者可疑耐藥結(jié)核病患者查,它有望代替利福平和異煙肼的傳統(tǒng)代替利福平和異煙肼的傳統(tǒng) 藥敏試驗(yàn)藥敏試驗(yàn) 推薦理由推薦理由: 在我國獲得注冊證書；在我國獲得注冊證書； 國內(nèi)研究顯示其敏感性和特異性和國內(nèi)研究顯示其敏感性和特異性和