茵陳提取黃酮工藝及不同地區(qū)黃酮含量分析

1、茵陳提取黃酮工藝及不同地區(qū)黃酮含量分析 摘要目的：建立茵陳提取黃酮類物質(zhì)最佳工藝和含量測定方法，為擴(kuò)大工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。并通過比較不同地區(qū)黃酮含量分析。方法：采用紫外分光光度法，以蘆丁為對照品，在511.5nm處測定吸光度。通過L9（34）正交試驗(yàn)確定了從茵陳中提取黃酮的最佳工藝條件，用紫外分光光度法測定吸光度，計算其黃酮類物質(zhì)含量。結(jié)果:本文研究茵陳中提取黃酮的工藝，其最佳提取工藝為乙醇濃度40%，提取時間30分鐘，固液比1:30，提取溫度為60，各因素影響大小的順序是：提取溫度固液比乙醇濃度提取時間。不同區(qū)域黃酮類物質(zhì)含量：陜西河北山西，但各個產(chǎn)地茵陳中黃酮物質(zhì)含量相差不大。結(jié)論：該

2、方法簡便、精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性好?？捎糜谝痍愄崛↑S酮工藝的研究。不同產(chǎn)地茵陳中黃酮含量有差別，但相差不大。關(guān)鍵詞茵陳；黃酮；提取工藝；紫外分光光度計；提取率Extraction and flavonoid of Herba artemisiae scopariae and analysis of flavonoids in different regionsSummary Objective: to establish a wormwood extract optimum process and determination of flavonoids, provide rationale f

3、or the expansion of industrial production. And through a comparative analysis of flavonoids in different parts. Methods: the use of UV spectrophotometry, with rutin as reference substances, measurement of absorbance at the 511.5nm. L9 (34) orthogonal test to determine the optimal technological condi

4、tions of extracting flavonoids from Herba artemisiae scopariae, UV-Spectrophotometric Determination of absorbance, calculate the content of flavonoids. Results: this study on extraction technology of flavonoids in wormwood, with extraction of ethanol concentration 40%, extraction time: 30 minutes, 1

5、:30 solid-liquid ratio, extraction temperature of 60 c, the factors affecting the size of the order is: extracting temperatures solid-liquid ratio ethanol extraction time. Contents of flavonoids in different regions: Shaanxi Hebei in Shanxi province, but the contents of flavone from Artemisia capill

6、aris matter not that far away. Conclusion: the method is simple, precision, reproducibility, stability is good. Study on flavonoids extraction for wormwood. Contents of flavone from Artemisia capillaris differentiated from different habitats, but not that far away. Keywords wormwood; flavonoids; ext

7、raction; ultraviolet spectrophotometer; extraction rate目 錄1.引 言11.1研究背景11.2國內(nèi)外研究狀況11.3研究的目的和意義22.實(shí)驗(yàn)材料、儀器設(shè)備與實(shí)驗(yàn)方法22.1材料22.2儀器設(shè)備22.3原料的預(yù)處理22.4黃酮含量的測定方法23結(jié)果與討論43.1乙醇濃度對提取效果的影響43.2提取時間對茵陳中黃酮類物質(zhì)提取效果的影響53.3提取溫度對茵陳中黃酮類物質(zhì)提取效果的影響63.4固液比對茵陳中黃酮類物質(zhì)提取效果的影響73.5試驗(yàn)因素對黃酮類物質(zhì)提取效果的影響83.6方差分析93.7驗(yàn)證試驗(yàn)103.8不同產(chǎn)地茵陳中黃酮類物質(zhì)含量的分

8、析104結(jié) 論11參考文獻(xiàn)：12致 謝13附 錄A141.引 言1.1研究背景茵陳為菊科植物濱蒿Artemisia scoparia Waldst. et Kit.或茵陳蒿Artemisia capillaries的干燥地上部分。春季采收的習(xí)稱“棉茵陳”，秋季采收的稱“花茵陳”。茵陳分布較為集中，主要分布在陜西、河北和山西三省。味苦、辛，性微寒，歸脾、胃、肝、膽經(jīng)。具有清利濕熱、利膽退黃的作用。臨床用于黃疸尿少，濕溫暑濕，濕瘡瘙癢1。茵陳有效成分主要是香豆素類、苯環(huán)有機(jī)酸類、黃酮類、色酮類、醛酮類2。因?yàn)橐痍悆r格便宜、并且黃酮類物質(zhì)含量比較高，所以適合用來提取黃酮類物質(zhì)。1.2國內(nèi)外研究狀況1

9、952年以前黃酮類化合物主要是指基本母核為2-苯基色原酮類化合物，現(xiàn)在則泛指兩個苯環(huán)通過中央三碳原子相互連接而成的一類化合物（見圖1-1）3。廣泛存在于植物界的一大類多酚類化合物，多以苷類形式存在，也有一部分以游離形式存在。黃酮類化合物具有多種生物活性，具有抑菌4、消炎、抗癌、清熱解毒等作用，同時黃酮類化合物是一種很強(qiáng)的天然抗氧化劑，發(fā)揮抗氧化作用5，可以清除體內(nèi)的氧自由基6。除此之外還可以治療心腦血管疾病7。由于黃酮類化合物多種生物活性和生物黃酮的潛力8研究進(jìn)入了一個新的階段，掀起了黃酮類化合物研究、開發(fā)利用熱潮，促使其在化妝品、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。近年來，黃酮類化合物的研究越來越多，

10、其提取范圍也越來越廣泛,提取方法也是越來越多9。目前，國外對黃酮類化合物研究比較活躍，國內(nèi)尚處于起步階段，大多數(shù)研究都是集中在中藥提取黃酮類化合物。圖1-11.3研究的目的和意義黃酮類化合物的研究比較多，但是對于因茵陳中黃酮類化合物提取研究卻相對比較少，但因?yàn)橐蜿悆r格便宜，并且黃酮類化合物的含量比較高。本文對于茵陳中黃酮類化合物含量測定方法和不同地區(qū)茵陳中黃酮類化合物含量作了簡單的分析。希望為以后對于茵陳中黃酮類化合物的研究提供理論基礎(chǔ)參考。2.實(shí)驗(yàn)材料、儀器設(shè)備與實(shí)驗(yàn)方法2.1材料2.1.1原料 茵陳（產(chǎn)地：陜西、河北、山西）2.1.2試劑蘆丁：95%乙醇、蒸餾水硝酸鈉哦（A.R）、硝酸鋁（

11、A.R）、氫氧化鈉（A.R）、2.2儀器設(shè)備分析天平：FA2004超聲波清洗機(jī)紫外分光光度計：UV11022.3原料的預(yù)處理市售陜西產(chǎn)干燥茵陳，據(jù)鑒別為花茵陳，粉碎并過20目篩，保存在干燥的環(huán)境中，待實(shí)驗(yàn)時用。2.4黃酮含量的測定方法2.4.1紫外分光光的法：以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)測定茵陳中總黃酮的含量。2.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程建立及線性范圍準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)試劑0.0114g，用50%乙醇溶解并移入100mL容量瓶中。分別量取上述溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00ml于25mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉1mL，搖勻，靜置6min，加10%硝酸鋁1mL，搖勻，靜置6min，加4

12、%氫氧化鈉溶液10mL，再加50%乙醇稀釋到刻度，搖勻，靜置15min。以第一瓶試劑為空白參比，第二瓶在400800nm處進(jìn)行波長掃描，在511.5nm處有最大吸收值。所以在511.5nm處測定吸光度,具體結(jié)果見表2-1.蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2-1。標(biāo)準(zhǔn)液（ml）0.001.002.003.004.005.00吸光度（A）0.0000.0160.30.4680.6270.784濃度Y（mg/ml）0.0000.01160.02320.03480.04640.058表2-1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)吸光度與圖2-1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)表1結(jié)果用最小二乘法作線性回歸，得蘆丁濃度Y與吸光度A的關(guān)系曲線的回歸方程式：Y=0.0

13、739A+0.0002，相關(guān)系數(shù)r=0.9996，表明蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品在0.0116mg0.058mg/ml濃度內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。2.4.3茵陳總黃酮提取液的制備稱取2.0g茵陳粉末于150ml干燥容量瓶中，根據(jù)不同因素設(shè)計的提取工藝進(jìn)行超聲提取，抽濾提取液，準(zhǔn)確吸取1.00ml濾液于25ml容量瓶中，加5%亞硝酸鈉1mL，搖勻，靜置6min，加10%硝酸鋁1mL，搖勻，靜置6min，加4%氫氧化鈉溶液10mL，再加50%乙醇稀釋到刻度，搖勻，靜置15min 。在511.5nm處測定提取液的吸光度值。2.4.4精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品濾液1.00ml，加入25ml容量瓶中，依“2.4.2”項(xiàng)

14、下方法測定提取液的吸光度值，平行操作6次，吸光度分別為0.460、0.458、0.448、0.455、0.451、0.450結(jié)果吸光度的RSD%為0.89%。2.4.5穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品濾液1.00ml，加入到25ml容量瓶中，依“2.4.2”項(xiàng)下方法分別于0、15、30、45、60、75min時測定提取液的吸光度值分別為0.448、0.440、0.435、0.427、0.421、0.439，結(jié)果吸光度的RSD為0.84%。2.4.6重現(xiàn)性試驗(yàn) 稱取同一批茵陳粉末，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備6份提取液，按“2.4.2”項(xiàng)下方法測定其吸光度值，分別為0.595、0.609、0.59

15、2、0.597、0.599、0.591，結(jié)果RSD%為1.01%。3結(jié)果與討論3.1乙醇濃度對提取效果的影響黃酮易溶于丙酮、乙醇和甲醇等有機(jī)溶劑，其中乙醇價格便宜，對藥材細(xì)胞具有較強(qiáng)的穿透力，對多種成分溶解性能好，且能抑制藥材中酶的活性。故本實(shí)驗(yàn)采用乙醇作為溶劑提取茵陳中黃酮類物質(zhì)10。 稱取2.0g茵陳粉末于150ml干燥錐形瓶中，分別用30%、40%、50%、60%、70%乙醇溶液50ml，在60，功率為200w，超聲提取25min，。測定提取液吸光度度值結(jié)果見表3-1。乙醇濃度（%）3040506070吸光度0.4980.5520.6040.5700.500表3-1乙醇濃度對茵陳中黃酮類

16、物質(zhì)提取效果的影響圖3-1乙醇濃度對茵陳中黃酮類物質(zhì)提取效果的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：由圖3-1可知用乙醇提取茵陳中黃酮類化合物，當(dāng)乙醇濃度偏低時，黃酮類化合物提取率較低。其原因可能是由于水的極性比較大，當(dāng)乙醇中含水量較大時，會把水溶性較大的雜質(zhì)提取出來，從而影響到黃酮類化合物吸光度。隨著乙醇濃度的提高，提取率也隨著提高，在50%出現(xiàn)最高點(diǎn)。但是隨著乙醇濃度的繼續(xù)提高，吸光度反而降低，因?yàn)橐掖紳舛冗^高，會使茵陳中的綠原酸、葉綠素等雜質(zhì)溶出增多，干擾因素也隨之增大，干擾了黃酮類化合物的吸光度。3.2提取時間對茵陳中黃酮類物質(zhì)提取效果的影響稱取2.0g茵陳粉末于150ml干燥錐形瓶中，加入50ml50%

17、的乙醇，在60，超聲功率為200w，分別提取15、20、25、30、35min，測定提取液的吸光度值，結(jié)果見表3-2。表3-2提取時間對茵陳中黃酮類物質(zhì)提取效果的影提取時間（min）1520253035吸光度0.4010.4950.5620.5500.446圖3-2提取時間對茵陳中黃酮類物質(zhì)提取效果的影響由圖3-2可以知道：隨著時間的增加，黃酮類化合物提取率也隨著提高，當(dāng)超聲時間為25min的時候，提取效果最好，當(dāng)時間延長時吸光度反而降低。這可能是提取時間太長，有部分乙醇被揮發(fā)而導(dǎo)致沸點(diǎn)逐漸增大，從而破壞某些黃酮類化合物11。3.3提取溫度對茵陳中黃酮類物質(zhì)提取效果的影響稱取2.0g茵陳粉末于

18、150ml干燥錐形瓶中，加入50ml50%的乙醇，在60，超聲功率為200w，分別提取15、20、25、30、35min，測定提取液的吸光度值，結(jié)果見表3-3。提取溫度（）4050607080吸光度0.4010.4950.5620.5500.446表3-3提取時間對茵陳中黃酮類物質(zhì)提取效果的影響圖3-3提取溫度對茵陳中黃酮類物質(zhì)提取效果的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，隨著溫度的升高，黃酮的提取效果也跟著升高，當(dāng)溫度達(dá)到60時，提取效果最好。當(dāng)溫度繼續(xù)升高時，吸光度反而降低，這可能是因?yàn)椋狐S酮在乙醇中的溶解度隨著溫度升高而增大，同時由于溫度的而升高，提取液粘度減小，擴(kuò)散系數(shù)增大，促進(jìn)提取速度加快，但是溫度過

19、高，一方面活性成分容易被破壞，雜志的溶出量增加，另一方面造成溶劑損失12。3.4固液比對茵陳中黃酮類物質(zhì)提取效果的影響稱取2.0g茵陳粉末于150ml干燥錐形瓶中，加入50ml50%的乙醇，分別在40、50、60、70、80超聲25min，功率為200w，測定提取液吸光度值，結(jié)果見表3-4。固液比1:151:201:251:301:35提取量（%）2.3152.7623.0092.9122.647表3-4固液比對茵陳中黃酮類物質(zhì)提取效果的影響圖3-4不同固液比對茵陳中黃酮類物質(zhì)提取率的影響由圖3-4可知：隨著固液比的變大，黃酮類化合物的提取量也增加，在1:25時出現(xiàn)了最大值。當(dāng)固液比超過1:2

20、5時，提取率反而降低。因此從提取實(shí)驗(yàn)最佳角度來考慮，我們選擇1:25的固液比最為最佳提取條件。3.5試驗(yàn)因素對黃酮類物質(zhì)提取效果的影響以上討論了乙醇濃度、提取時間、提取溫度、固液比對提取茵陳中黃酮類物質(zhì)的影響，但在實(shí)際操作過程中，是受它們之間相互交叉影響，因此為了全面考察影響因素，設(shè)計了正交實(shí)驗(yàn)因素水平表3-5，各實(shí)驗(yàn)處理及黃酮類物質(zhì)提取量見表3-6。表3-5正交實(shí)驗(yàn)因素水平表因素水平A乙醇濃度（%）B提取時間（min）C提取溫度（）D固液比1234050602025305060701:201:251:30從表3-6分析得到：根據(jù)極差R大小可知，各因素影響大小的順序是：CDAB，即提取溫度固液

21、比乙醇濃度提取時間。由表3-6可以推導(dǎo)出最佳提取工藝為：A1B3C2D3，即最佳的提取條件為：乙醇濃度為40%，提取時間為30min，提取溫度為60，固液比為1：30。表3-6正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果L9（34）因素實(shí)驗(yàn)A乙醇濃度（%） B提取時間（min） C提取溫度（）D固液比總黃酮含量（%）1A1B1C1D11.902A1B2C2D23.123A1B3C3D33.704A2B2C3D12.475A2B3C1D22.176A2B1C2D33.377A3B3C2D12.928A3B1C3D22.879A3B2C1D32.58K18.728.146.657.25K28.018.179.418.16K38.

22、378.799.049.65K12.912.712.222.42K22.672.723.142.72K32.792.933.013.22R0.240.220.920.803.6方差分析 表3-7方差分析變異原因偏差平方和自由度均方F值P值A(chǔ)乙醇濃度0.084020.04201.4p0.05B提取時間0.089820.04491.50p0.05C提取溫度1.496320.748124.94p0.05查表（見附錄A：）得：F0.05（2,2）=19.00，F(xiàn)0.01（2,2）=99.00。由表3-7可知，因素C，即提取溫度為顯著性影響(p0.05)，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果的直觀分析基本一致。3.7驗(yàn)證試驗(yàn)稱取

23、茵陳粉末2.0g，按上述最佳提取方案進(jìn)行提取，結(jié)果3份茵陳粉末黃酮類物質(zhì)含量為3.36%、3.41%、3.37%，RSD%=0.14%，含量均較高，差異無顯著性，證明此提取工藝可行。3.8不同產(chǎn)地茵陳中黃酮類物質(zhì)含量的分析分別從市場購買陜西、河北、山西三省出產(chǎn)的干燥花茵陳，粉碎，過20目篩。每個產(chǎn)地稱取三份2.0g茵陳粉末測定茵陳的黃酮類物質(zhì)含量（見表3-8）。表3-8不同產(chǎn)區(qū)茵陳中黃酮含量比較分析產(chǎn)地吸光度（A）黃酮類物質(zhì)含量（%）陜西陜西陜西河北河北河北山西山西山西0.6050.5990.6120.5640.5570.5610.4900.4950.5003.373.33 3.403.143

24、.103.122.732.762.79從表3-8可以看出，不同地區(qū)茵陳中黃酮類物質(zhì)含量均不同。陜西省茵陳的黃酮類物質(zhì)含量最高，達(dá)到了3.40%；其次是河北的，最高達(dá)到3.14%，黃酮類物質(zhì)含量最低的是山西的，最高達(dá)到2.79%。雖然三地區(qū)出產(chǎn)的黃酮類物質(zhì)含量均不同，但卻相差不大。4結(jié) 論茵陳中含有豐富的黃酮類物質(zhì)，各實(shí)驗(yàn)因素對茵陳中黃酮類物質(zhì)提取量影響依次為提取溫度、固液比、乙醇濃度、提取時間因素依次降低。提取溫度對黃酮類物質(zhì)提取量達(dá)到了極致顯著性水平（p0.05）。其最佳提取條件為：乙醇濃度為40%，提取時間為30min，提取溫度為60，固液比為1：30。通過研究表明：不同地區(qū)茵陳中黃酮類物

25、質(zhì)含量均不相同，但卻是相差不大。隨著深入研究黃酮類物質(zhì)與其生物活性，其不但在食品行業(yè)越來越受到青睞，更是在醫(yī)藥行業(yè)發(fā)揮著越來越重要的作用。尋找安全有效、低耗能、高提取效率、綠色環(huán)保從植物中大量提取黃酮類物質(zhì)的方法，將是以后研究的重點(diǎn)。參考文獻(xiàn)：1藥典委員會.中華人民共和國藥典M.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010（2）：223-2242王茜.茵陳的藥理作用及其主要化學(xué)成分藥物代謝動力學(xué)研究進(jìn)展J.安徽中醫(yī)學(xué)院報，2012，31（4）：879033春彥.近年來茶葉中總黃酮類化合物測定方法研究概況J.中國民族民間醫(yī)藥，2007,5:273-2744余龍江，敖明章等.甘草總黃酮的提取技術(shù)及其抑菌活性研究

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28、2008，18（3）：113-115附 錄AF界值表（方差分析用，上行：P=0.05，P=0.01）V2(較小均方的自由度)V1（較大均方的自由度）1234567812241161.4199.5215.7224.6230.2234.0236.8238.9243.9249.1254.340524999.5540356255764585959285982610662356366218.5119.0019.1619.2519.3019.3319.3519.3719.4119.4519.5098.5099.0099.1799.2599.3099.3399.3699.3799.4299.4699.50310.139.559.289.129.018.948.898.858.748.648.5334.1230.8229.4628.1728.2427.9127.