第三章核酸的分離與檢測(cè)

1、chapter 3 separate and investigate target gene by nieguangjun e-mail:l從哪兒提?。◤哪膬禾崛。╳here）？）？l怎么提取（怎么提?。╤ow）？）？l提到什么程度（提到什么程度（what）？）？l會(huì)出現(xiàn)什么問題（會(huì)出現(xiàn)什么問題（questions）？）？如何解決（如何解決（solution）？）？主要內(nèi)容主要內(nèi)容核酸提取的原則和基本要求核酸提取的原則和基本要求principle and steps l principle principle 1.1.保持核酸的完整性；保持核酸的完整性；2.2.提高核酸的質(zhì)量（純度和濃度）。提

2、高核酸的質(zhì)量（純度和濃度）。l requirements for purificationrequirements for purification1.1.不存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金不存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子；屬離子；2.2.其他事物大分子（其他事物大分子（prpr、sugar and lipidsugar and lipid）3.3.其他核酸污染其他核酸污染核酸提取的一般過程核酸提取的一般過程principle and steps l steps steps1.1.樣品準(zhǔn)備（取材）樣品準(zhǔn)備（取材）2.2.破細(xì)胞（物理法、化學(xué)法、破細(xì)胞（物理法、化學(xué)法

3、、酶法）；酶法）；3.3.除雜質(zhì)（蛋白質(zhì)、脂類、糖除雜質(zhì)（蛋白質(zhì)、脂類、糖類和不需要的核酸）；類和不需要的核酸）；4.4.沉淀提純沉淀提純i. i.材料準(zhǔn)備材料準(zhǔn)備ii.ii.破碎細(xì)胞或包膜內(nèi)容物釋放破碎細(xì)胞或包膜內(nèi)容物釋放iii.iii.核酸分離、純化核酸分離、純化iv.iv.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì) v.v.核酸溶解在適量緩沖液或水中核酸溶解在適量緩沖液或水中破碎細(xì)胞破碎細(xì)胞- -方法方法1.1. 機(jī)械方法機(jī)械方法：超聲波處理法、研磨法、勻漿法；：超聲波處理法、研磨法、勻漿法；2.2. 化學(xué)試劑法化學(xué)試劑法：用：用sdssds或或ctabctab處理細(xì)胞；處理細(xì)

4、胞； 3.3. 酶解法酶解法：加入溶菌酶或蝸牛酶，都可使細(xì)胞壁：加入溶菌酶或蝸牛酶，都可使細(xì)胞壁破碎。破碎。 破碎細(xì)胞破碎細(xì)胞- -來(lái)源來(lái)源1.1. 動(dòng)物：動(dòng)物：小牛胸腺小牛胸腺?動(dòng)物肝臟、血液和肌肉組織等動(dòng)物肝臟、血液和肌肉組織等?魚類精子；魚類精子；2.2. 植物：植物：種子的胚中都含有豐富的種子的胚中都含有豐富的dnadna。3.3. 微生物：微生物：谷氨酸菌體含谷氨酸菌體含7%10%7%10%，面包酵母含，面包酵母含4%4%，啤酒酵母含啤酒酵母含6%6%，大腸肝菌含，大腸肝菌含9%10%9%10%（培養(yǎng)過夜）。（培養(yǎng)過夜）。 notenote： 從各種材料中提取從各種材料中提取dnad

5、na方法不同，分離提取的難易程度也不同。方法不同，分離提取的難易程度也不同。 對(duì)于低等生物。如從病毒中提取對(duì)于低等生物。如從病毒中提取dna dna 比較容易，多數(shù)病毒比較容易，多數(shù)病毒dna dna 分子量較小，分子量較小，提取時(shí)易保持其結(jié)構(gòu)完整性。提取時(shí)易保持其結(jié)構(gòu)完整性。 從高等動(dòng)植物中提取從高等動(dòng)植物中提取dnadna難度大一些。因分子量較大，易被機(jī)械張力剪斷。難度大一些。因分子量較大，易被機(jī)械張力剪斷。破碎細(xì)胞破碎細(xì)胞（來(lái)源（來(lái)源- -方法）方法）微生物：微生物：溶菌酶、溶菌酶、sdssds裂解。裂解。高等植物：高等植物：搗碎器破碎、液氮研磨。搗碎器破碎、液氮研磨。 酶法：蛋白酶，如

6、胰蛋白酶，酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶， 冰凍法：反復(fù)凍融或液氮凍后組織搗碎。冰凍法：反復(fù)凍融或液氮凍后組織搗碎。動(dòng)物動(dòng)物：液氮處理后用勻漿器破碎。：液氮處理后用勻漿器破碎。細(xì)胞器細(xì)胞器dnadna：首先純化細(xì)胞器。首先純化細(xì)胞器。 以上處理時(shí)均要同時(shí)加入核酸酶抑制劑以上處理時(shí)均要同時(shí)加入核酸酶抑制劑抽提核酸除去雜質(zhì)抽提核酸除去雜質(zhì) 1 1首先使脫氧核糖核蛋白、核糖體、病毒的核首先使脫氧核糖核蛋白、核糖體、病毒的核蛋白與其它成分分離蛋白與其它成分分離2 2使核酸與蛋白質(zhì)分離使核酸與蛋白質(zhì)分離3 3除去脂類除去脂類 4 4多糖的除去多糖的除去how to remove ？核酸的純化核酸的純化根據(jù)所需

7、核酸的性質(zhì)和特點(diǎn)除去其它核酸污根據(jù)所需核酸的性質(zhì)和特點(diǎn)除去其它核酸污染染, ,并除去提取過程中的系列試劑并除去提取過程中的系列試劑( (鹽、有機(jī)溶劑鹽、有機(jī)溶劑等）雜質(zhì)，最后得到均一的核酸樣品。等）雜質(zhì)，最后得到均一的核酸樣品。 how to do？核酸樣品的保存核酸樣品的保存核酸保存的主要條件是核酸保存的主要條件是溫度溫度和和介質(zhì)介質(zhì)溫度：溫度： 44（55）最佳和最簡(jiǎn)單）最佳和最簡(jiǎn)單 -70-70是長(zhǎng)期保存的良好溫度，為一次性保存是長(zhǎng)期保存的良好溫度，為一次性保存 -20-20保存保存保存介質(zhì)：保存介質(zhì)： tete緩沖溶液緩沖溶液( (最常用最常用) ) 10mmol/l tris-hcl

8、 ph8.0 10mmol/l tris-hcl ph8.0 1mmol/l edta ph8.0 1mmol/l edta ph8.0關(guān)鍵試劑的作用關(guān)鍵試劑的作用關(guān)鍵試劑的作用關(guān)鍵試劑的作用l核酸酶的抑制和抑制劑核酸酶的抑制和抑制劑 降低溫度，改變降低溫度，改變phph及鹽的濃度，都利于及鹽的濃度，都利于對(duì)核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑對(duì)核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制劑更有利，當(dāng)然，幾個(gè)條件并用更好。制劑更有利，當(dāng)然，幾個(gè)條件并用更好。 對(duì)于對(duì)于dnadna，抑制，抑制dnasednase活力很容易，但防活力很容易，但防止機(jī)械張力拉斷則更重要。止機(jī)械張力拉斷則更重要。 對(duì)于

9、對(duì)于rnarna，因分子較小，不易被機(jī)械張力，因分子較小，不易被機(jī)械張力拉斷，但抑制拉斷，但抑制rnasernase活力較難，故在活力較難，故在rnarna提取提取中設(shè)法抑制中設(shè)法抑制rnasernase更重要。更重要。關(guān)鍵試劑的作用關(guān)鍵試劑的作用l核酸酶的抑制和抑制劑核酸酶的抑制和抑制劑 rnasernase抑制抑制 操作要帶手套。操作要帶手套。 所有器皿要嚴(yán)格消毒，所有器皿要嚴(yán)格消毒， 試劑處理試劑處理 低溫操作低溫操作 在分離過程中要加入一定的在分離過程中要加入一定的rnasernase抑制劑。抑制劑。 關(guān)鍵試劑的作用關(guān)鍵試劑的作用l核酸制備中常用的去垢劑核酸制備中常用的去垢劑 核酸本身

10、帶負(fù)電荷，結(jié)合帶正電荷的蛋白質(zhì)。核酸本身帶負(fù)電荷，結(jié)合帶正電荷的蛋白質(zhì)。用于核酸提取的去垢劑，一般都是陰離子用于核酸提取的去垢劑，一般都是陰離子去垢劑，去垢劑的作用：去垢劑，去垢劑的作用： 1 1溶解膜蛋白及脂肪，使細(xì)胞膜破裂；溶解膜蛋白及脂肪，使細(xì)胞膜破裂； 2 2溶解核糖體上面的蛋白質(zhì)，使其解聚，溶解核糖體上面的蛋白質(zhì)，使其解聚，將核酸釋放出來(lái)；將核酸釋放出來(lái)； 3 3對(duì)對(duì)rnasernase、dnasednase有一定的抑制作用。有一定的抑制作用。關(guān)鍵試劑的作用關(guān)鍵試劑的作用l核酸制備中常用的蛋白質(zhì)變性劑核酸制備中常用的蛋白質(zhì)變性劑 蛋白質(zhì)變性劑的作用：蛋白質(zhì)變性劑的作用： 1. 1.使

11、蛋白質(zhì)變性、沉淀，從核酸提取液中分離除使蛋白質(zhì)變性、沉淀，從核酸提取液中分離除去，以防造成蛋白污染。去，以防造成蛋白污染。 2.2.使蛋白質(zhì)變性，故可使核糖體解聚釋放出核酸。使蛋白質(zhì)變性，故可使核糖體解聚釋放出核酸。 3.3.某些蛋白質(zhì)變性劑也有抑制某些蛋白質(zhì)變性劑也有抑制rnasernase活性和破裂活性和破裂細(xì)胞的作用。細(xì)胞的作用。如：苯酚、氯仿、鹽酸胍、如：苯酚、氯仿、鹽酸胍、depcdepc關(guān)鍵試劑的作用關(guān)鍵試劑的作用l核酸制備中常用的酶核酸制備中常用的酶 dnasednase rnase rnase 蛋白酶蛋白酶k k 溶菌酶溶菌酶 核酸的部分特征核酸的部分特征核酸的部分特征核酸的部

12、分特征1.1.存在形式存在形式2.2.phph值影響值影響3.3.鹽影響鹽影響4.4.溫度影響溫度影響1. 1.存在形式存在形式l rna rna和核苷酸的純品都呈和核苷酸的純品都呈白色粉末或結(jié)晶白色粉末或結(jié)晶，dnadna則為則為白色類似石棉樣白色類似石棉樣的纖維狀物。的纖維狀物。l dnadna、rnarna和核苷酸都是和核苷酸都是極性化合物極性化合物，一般都溶于水，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑，它們的鈉鹽比游離酸不溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑，它們的鈉鹽比游離酸易溶于水，易溶于水，rnarna鈉鹽在水中溶解度可達(dá)鈉鹽在水中溶解度可達(dá)40g/l40g/l。l 天然狀態(tài)的天然狀態(tài)的d

13、na dna 是以脫氧核糖核蛋白是以脫氧核糖核蛋白(dnp)(dnp)形式存形式存在于細(xì)胞核中。要從細(xì)胞中提取在于細(xì)胞核中。要從細(xì)胞中提取dna dna 時(shí)，先把時(shí)，先把dnpdnp抽抽提出來(lái)，再把提出來(lái)，再把p p除去，再除去細(xì)胞中的糖，除去，再除去細(xì)胞中的糖，rna rna 及無(wú)及無(wú)機(jī)離子等，從中分離機(jī)離子等，從中分離dna dna 。 removal of pr removal of pr2.ph2.ph值的影響值的影響 dnadna在水中為在水中為10g/l10g/l，呈黏性膠體溶液。在酸性，呈黏性膠體溶液。在酸性溶液中，溶液中，dnadna、rnarna易水解，在中性或弱堿性溶易水解

14、，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。液中較穩(wěn)定。 在在phph值高達(dá)值高達(dá)12.612.6的堿性條件下，雙螺旋結(jié)構(gòu)解的堿性條件下，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒開而變性。質(zhì)粒dnadna兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離，兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離，當(dāng)以當(dāng)以ph 4.8ph 4.8的的naacnaac高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其phph值至值至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒中性時(shí)，變性的質(zhì)粒dnadna完全復(fù)性，而染色體完全復(fù)性，而染色體dnadna不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)堿變性法（堿變性法（for plasmid dnafor plasmid dna）3. 3.鹽影響鹽影響ldnpdnp在

15、在低濃度鹽溶液低濃度鹽溶液中，幾乎不溶解，如在中，幾乎不溶解，如在0.14 0.14 mol/lmol/l的氯化鈉溶解度最低的氯化鈉溶解度最低，僅為在水中溶解度，僅為在水中溶解度的的1%1%，隨著鹽濃度的增加溶解度也增加，至，隨著鹽濃度的增加溶解度也增加，至1mol/l1mol/l氯化鈉中的溶解度很大，比純水高氯化鈉中的溶解度很大，比純水高2 2倍。倍。lrnprnp在鹽溶液中的溶解度受鹽濃度的影響較小，在鹽溶液中的溶解度受鹽濃度的影響較小，在在0.14mol/l0.14mol/l氯化鈉中溶解度較大氯化鈉中溶解度較大。因此，在提。因此，在提取時(shí)，常用此法分離這兩種核蛋白。鹽溶液中取時(shí)，常用此法

16、分離這兩種核蛋白。鹽溶液中的溶解度受鹽濃度的影響而不同。的溶解度受鹽濃度的影響而不同。濃鹽法濃鹽法4. 4.溫度影響溫度影響l高溫變性高溫變性l低溫復(fù)性低溫復(fù)性沸水浴法（沸水浴法（for plasmid dnafor plasmid dna）核酸的常用提取方法核酸的常用提取方法常用的常用的dnadna提取方法提取方法l濃鹽法濃鹽法l陰離子去污劑法陰離子去污劑法l苯酚抽提法苯酚抽提法l水抽提法水抽提法l沸水浴法沸水浴法l堿變性法堿變性法1. 1. 濃鹽法濃鹽法原理：原理： 利用利用rnprnp和和dnpdnp在電解溶液中溶解度不同，在電解溶液中溶解度不同，將二者分離；將二者分離；常用的方法：常用

17、的方法：用用1m 1m 氯化鈉氯化鈉提取氯化鈉抽提提取氯化鈉抽提, ,得到的得到的dnpdnp粘液與含有少量辛醇的氯仿一起搖蕩粘液與含有少量辛醇的氯仿一起搖蕩, ,使乳化使乳化, ,再再離心除去蛋白質(zhì)離心除去蛋白質(zhì), ,此時(shí)蛋白質(zhì)凝膠停留在水相及氯仿此時(shí)蛋白質(zhì)凝膠停留在水相及氯仿相中間相中間，而，而dnadna位于上層水相中位于上層水相中, ,用用2 2倍體積倍體積95%95%乙醇乙醇可將可將dna dna 鈉鹽沉淀出來(lái)（鈉鹽沉淀出來(lái)（ 也可用也可用0.15 mnacl0.15 mnacl液反復(fù)液反復(fù)洗滌細(xì)胞破碎液除去洗滌細(xì)胞破碎液除去rnp,rnp,再以再以1mnacl1mnacl提取脫氧核

18、糖提取脫氧核糖蛋白蛋白, ,再按氯仿再按氯仿-異醇法除去蛋白）。異醇法除去蛋白）。1. 1. 濃鹽法濃鹽法注意注意以稀鹽酸溶液提取以稀鹽酸溶液提取dna dna 時(shí)時(shí), ,加入適量加入適量去污劑去污劑, ,如如sdssds可有助于蛋白質(zhì)與可有助于蛋白質(zhì)與dna dna 的分離。的分離。在提取過程中為抑制組織中的在提取過程中為抑制組織中的dnasednase對(duì)對(duì)dna dna 的降的降解作用解作用, ,在氯化鈉溶液中加入在氯化鈉溶液中加入檸檬酸鈉檸檬酸鈉作為金屬離作為金屬離子的烙合劑子的烙合劑. .通常用通常用0.15mnacl,0.015m0.15mnacl,0.015m檸檬鈉檸檬鈉, ,并并

19、稱稱sscssc溶液溶液, ,提取提取dna. dna. 2. 2. 陰離子去污劑法陰離子去污劑法用用sdssds或二甲苯酸鈉等去污劑使蛋白質(zhì)變或二甲苯酸鈉等去污劑使蛋白質(zhì)變性性, ,可以直接從生物材料中提取可以直接從生物材料中提取dnadna。由于細(xì)由于細(xì)胞中胞中dnadna與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵結(jié)合結(jié)合, ,因?yàn)殛庪x子去污劑能夠破壞這種價(jià)鍵因?yàn)殛庪x子去污劑能夠破壞這種價(jià)鍵, ,所以常用陰離子去污劑提取所以常用陰離子去污劑提取dna. dna. 3. 3. 苯酚抽提法苯酚抽提法苯酚作為蛋白變性劑苯酚作為蛋白變性劑, ,同時(shí)抑制了同時(shí)抑制了dnased

20、nase的降解作用。的降解作用。用苯酚處理勻漿液時(shí)用苯酚處理勻漿液時(shí), ,由于蛋白與由于蛋白與dna dna 聯(lián)結(jié)鍵已斷聯(lián)結(jié)鍵已斷, ,蛋蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而蛋白分子溶于酚相，而dnadna溶于水相。離心分層后取溶于水相。離心分層后取出水層，多次重復(fù)操作，再合并含出水層，多次重復(fù)操作，再合并含dna dna 的水相。的水相。利用核酸不溶于醇的性質(zhì)，用乙醇沉淀利用核酸不溶于醇的性質(zhì)，用乙醇沉淀dna dna 。此時(shí)。此時(shí)dnadna是十分粘稠的物質(zhì)，可用玻璃漫漫繞成一團(tuán)，取是十分粘稠的物質(zhì)，可用玻璃漫漫繞成一

21、團(tuán)，取出。此法的特點(diǎn)是使提取的出。此法的特點(diǎn)是使提取的dnadna保持天然狀態(tài)。保持天然狀態(tài)。 4. 4. 水抽提法水抽提法利用核酸溶解于水的性質(zhì)利用核酸溶解于水的性質(zhì), ,將組織細(xì)胞破碎后將組織細(xì)胞破碎后, ,用用低鹽溶液除去低鹽溶液除去rnarna，然后將沉淀溶于水中，使，然后將沉淀溶于水中，使dnadna充分溶解于水中充分溶解于水中, ,離心后收集上清液；離心后收集上清液；在上清中加入在上清中加入固體氯化鈉固體氯化鈉調(diào)節(jié)至調(diào)節(jié)至2.6m2.6m。加入。加入2 2倍倍體積體積95%95%乙醇乙醇, ,立即用攪拌法攪出；立即用攪拌法攪出；然后分別用然后分別用66% 66% ?80%80%和和

22、95%95%乙醇以及丙酮洗滌；乙醇以及丙酮洗滌；最后在空氣中干燥最后在空氣中干燥, ,既得既得dnadna樣品。樣品。此法提取的此法提取的dnadna中蛋白質(zhì)含量較高中蛋白質(zhì)含量較高, ,故一般不用。故一般不用。5. 5. 沸水浴法（提取大腸沸水浴法（提取大腸桿菌質(zhì)粒桿菌質(zhì)粒dnadna）1. 1. 在在eppendorfeppendorf管中加入管中加入110 ml110 ml的的stetstet（使用前加（使用前加入溶菌酶至終濃度為入溶菌酶至終濃度為5 mg/ml5 mg/ml）（蔗糖）（蔗糖 8 8 ，triton x-100triton x-100 5 5，tris-hcl (ph8.

23、0)tris-hcl (ph8.0) 50 mm 50 mm， edta (ph8.0)edta (ph8.0) 50 mm 50 mm）溶液，挑入米粒大小的菌團(tuán)，）溶液，挑入米粒大小的菌團(tuán)，充分懸浮并混勻。充分懸浮并混勻。 2. 2. 上述菌體懸浮液上述菌體懸浮液沸水煮沸水煮3030秒秒。3. 3. 迅速放置于迅速放置于常溫常溫下下15000 rpm15000 rpm離心離心1515分鐘。分鐘。5. 5. 沸水浴法（提取大腸沸水浴法（提取大腸桿菌質(zhì)粒桿菌質(zhì)粒dnadna）4. 4. 用牙簽挑去菌體碎片（白色沉淀），在上清液用牙簽挑去菌體碎片（白色沉淀），在上清液中加入中加入100 ml100

24、 ml的的異丙醇異丙醇，充分混勻后，充分混勻后44，15000 15000 rpmrpm離心離心2020分鐘。分鐘。 5. 5. 棄上清液，加入棄上清液，加入70%70%冰乙醇冰乙醇400 ml400 ml，44，15000 rpm15000 rpm離心離心5 5分鐘。分鐘。 6. 6. 沉淀涼干后用沉淀涼干后用50 ml50 ml無(wú)菌重蒸水溶解。無(wú)菌重蒸水溶解。 7. 7. 取取5 ml5 ml電泳檢測(cè)。電泳檢測(cè)。 6. 6. 堿變性法堿變性法原理：原理：堿變性抽提質(zhì)粒堿變性抽提質(zhì)粒dnadna是基于染色體是基于染色體dnadna與質(zhì)粒與質(zhì)粒dnadna的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。的變

25、性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。在在高高phph值值條件下，染色體條件下，染色體dnadna的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒解開而變性。質(zhì)粒dnadna的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離；價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離；當(dāng)當(dāng)phph值調(diào)至至中性值調(diào)至至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒時(shí)，變性的質(zhì)粒dnadna又恢復(fù)原來(lái)的構(gòu)又恢復(fù)原來(lái)的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體型，保存在溶液中，而染色體dnadna不能復(fù)性而形成纏連的不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體dnadna與不穩(wěn)定的大分子與

26、不穩(wěn)定的大分子rnarna、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)sdssds復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)而被除去。復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)而被除去。 核酸提取的經(jīng)典案例核酸提取的經(jīng)典案例主要案例主要案例u 堿變性法制備大腸桿菌質(zhì)粒堿變性法制備大腸桿菌質(zhì)粒dna dna u 大腸桿菌染色體大腸桿菌染色體dnadna的抽提的抽提u ctabctab法提取植物基因組法提取植物基因組dna dna 6. 6. 堿變性法（制備大腸堿變性法（制備大腸桿菌質(zhì)粒桿菌質(zhì)粒dnadna） 1. 1.5 ml1. 1.5 ml培養(yǎng)物培養(yǎng)物6000 rpm6000 rpm，44離心離心1010分鐘，棄去分鐘，棄去上清液。上清液。2. 2. 加入加入10

27、0 ml100 ml溶液溶液i i懸浮菌體，室溫放置懸浮菌體，室溫放置5 5分鐘。分鐘。3. 3. 加入加入200 ml200 ml溶液溶液iiii，立即輕輕混勻，室溫放置至，立即輕輕混勻，室溫放置至溶液幾乎澄清。溶液幾乎澄清。4. 4. 加入加入150 ml150 ml溶液溶液iiiiii，輕輕混勻，冰浴，輕輕混勻，冰浴3030分鐘。分鐘。 5. 45. 4，15000 rpm15000 rpm離心離心2020分鐘，收集上清液。分鐘，收集上清液。 6. 6. 上清液中加入等體積的上清液中加入等體積的苯酚苯酚飽和溶液（飽和溶液（400 ml400 ml）氯仿氯仿，充分混勻，充分混勻，44，15

28、000 rpm15000 rpm離心離心2020分鐘，將分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管。上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管。6. 6. 堿變性法（制備大腸堿變性法（制備大腸桿菌質(zhì)粒桿菌質(zhì)粒dnadna） 7. 7. 在上清液中加入在上清液中加入400 ml400 ml氯仿氯仿溶液，混勻，溶液，混勻，10000 10000 rpmrpm離心離心1010分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管。分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管。 8. 8. 在上清液中加入在上清液中加入400 ml400 ml異丙醇異丙醇，2020放置放置3030分鐘，分鐘，44，15000 rpm15000 rpm離心離心2020分鐘。分鐘。 9. 9

29、. 用用400 ml 75%400 ml 75%的的冰乙醇冰乙醇洗滌一次，涼干。洗滌一次，涼干。 10. 10. 加入加入50 ml50 ml無(wú)菌重蒸水溶解質(zhì)粒無(wú)菌重蒸水溶解質(zhì)粒dnadna。 11. 11. 取取2 ml2 ml作酶切電泳檢查。作酶切電泳檢查。6. 6. 堿變性法堿變性法- -試劑試劑溶液溶液i i：d-glucosed-glucose 50 mmol/l 50 mmol/l，tris-hcltris-hcl（ph 8.0ph 8.0）50mmol/l50mmol/l ，edtaedta（ph 8.0ph 8.0） 10mmol/l10mmol/l 121121消毒消毒202

30、0分鐘，使用時(shí)加入溶菌酶，終分鐘，使用時(shí)加入溶菌酶，終濃為濃為 5mg/ml 5mg/ml 溶液溶液iiii ：sdssds 1%1% naoh naoh 0.2 mol/l0.2 mol/l 溶液溶液iiiiii：kackac（ph5.5ph5.5） 3 mol/l3 mol/l溶液溶液-溶菌液溶菌液1 1溶菌酶：溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌體細(xì)它是糖苷水解酶，能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的-1-1，4 4糖苷鍵，糖苷鍵，因而具有溶菌的作用。當(dāng)溶液中因而具有溶菌的作用。當(dāng)溶液中phph小于小于8 8時(shí)，溶菌時(shí)，溶菌酶作用受到抑制。（保持堿性和較低的離

31、子強(qiáng)度酶作用受到抑制。（保持堿性和較低的離子強(qiáng)度環(huán)境）環(huán)境） 葡萄糖：葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止dnadna受機(jī)械切力作用降解。受機(jī)械切力作用降解。溶液溶液-溶菌液溶菌液2.edta的作用的作用：（1） 螯合螯合mg2、ca2等金屬離子，抑制脫氧核等金屬離子，抑制脫氧核酸酶對(duì)酸酶對(duì)dna的降解作用（的降解作用（dnase作用時(shí)一定的金作用時(shí)一定的金屬離子作輔基）。屬離子作輔基）。 （2）edta的存在，有利于溶菌酶的作用，因?yàn)榈拇嬖?，有利于溶菌酶的作用，因?yàn)槿芫傅姆磻?yīng)要求有較低的離子強(qiáng)度的環(huán)境。溶菌酶的反應(yīng)要求有較低的離子強(qiáng)度的環(huán)境。 溶液溶液-

32、naoh-sds液液 naoh：核酸在核酸在ph大于大于5，小于，小于9的溶液中，是穩(wěn)的溶液中，是穩(wěn)定的定的。但當(dāng)。但當(dāng)ph12或或ph3時(shí)，就會(huì)引起雙鏈之間時(shí)，就會(huì)引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液氫鍵的解離而變性。在溶液中的中的naoh濃度為濃度為0.2mol/l,加抽提液時(shí)，該系統(tǒng)的加抽提液時(shí)，該系統(tǒng)的ph就高達(dá)就高達(dá)12.6,因因而促使染色體而促使染色體dna與質(zhì)粒與質(zhì)粒dna的變性的變性. 溶液溶液-naoh-sds液液 sds：sdssds是離子型表面活性劑。它主要功能有：是離子型表面活性劑。它主要功能有：（1 1）溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因而溶解膜蛋）溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白

33、，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜。白而破壞細(xì)胞膜。（2 2）解聚細(xì)胞中的核蛋白。）解聚細(xì)胞中的核蛋白。（3 3）sdssds能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為r-o-so3r+-r-o-so3r+-蛋白蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來(lái)。但是質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來(lái)。但是sdssds能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中（用（用rnasernase去除去除rnarna時(shí)）受到干擾。時(shí)）受到干擾。 溶液溶液-3mol/l naac(ph4.8)溶液溶液na

34、ac的水溶液呈堿性，為了調(diào)節(jié)的水溶液呈堿性，為了調(diào)節(jié)ph至至4.8,必必須加入大量的冰醋酸。所以該溶液實(shí)際上是須加入大量的冰醋酸。所以該溶液實(shí)際上是naac-hac的緩沖液。用的緩沖液。用ph4.8的的naac溶液溶液是是為為了將了將ph12.6的抽提液調(diào)回的抽提液調(diào)回ph至中性至中性,使變性的質(zhì)使變性的質(zhì)粒粒dna能夠復(fù)性能夠復(fù)性,并能穩(wěn)定存在。而高鹽的并能穩(wěn)定存在。而高鹽的3mol/l naac有利于變性的大分子染色體有利于變性的大分子染色體dna, rna,以及以及sds-蛋白復(fù)合物凝聚而沉淀之。前者蛋白復(fù)合物凝聚而沉淀之。前者是因?yàn)橹泻秃怂嵘系碾姾墒且驗(yàn)橹泻秃怂嵘系碾姾?減少相斥力而互

35、相聚合減少相斥力而互相聚合,后者是因?yàn)殁c鹽與后者是因?yàn)殁c鹽與sds-蛋白復(fù)合物作用后蛋白復(fù)合物作用后,能形能形成較小的鈉鹽形式復(fù)合物成較小的鈉鹽形式復(fù)合物,使沉淀更完全。使沉淀更完全。 大腸桿菌染色體大腸桿菌染色體dnadna的抽提的抽提 大腸桿菌傳一代后大腸桿菌傳一代后30ml液體液體lb培養(yǎng)基以培養(yǎng)基以10%接種量接種量培養(yǎng)培養(yǎng)6小小時(shí)時(shí)，6000rpm，4，離心，離心10分鐘收獲菌體沉淀。分鐘收獲菌體沉淀。 沉淀中加入沉淀中加入3.6 ml buffer a（含溶菌酶（含溶菌酶5 mg/ml），旋渦振），旋渦振蕩混勻，蕩混勻，37保溫保溫30分鐘。分鐘。 加入加入400 ml 10% s

36、ds使最終濃度為使最終濃度為1%，混勻，混勻，37保溫保溫30分鐘或澄清即可。分鐘或澄清即可。 加入加入10 ml 20 mg/ml的的prok至最終濃度為至最終濃度為1 mg/ml，60保保溫溫60分鐘。分鐘。 加入加入1 ml預(yù)先冷凍的預(yù)先冷凍的5 mol/l nacl至最終濃度為至最終濃度為1 mol/l，充，充分混勻后冰浴分混勻后冰浴30分鐘。分鐘。 4，15 000 rpm，離心，離心30min。大腸桿菌染色體大腸桿菌染色體dnadna的抽提的抽提 取上清加入等體積（取上清加入等體積（5 ml）的）的苯酚苯酚飽和溶液，充分混勻后飽和溶液，充分混勻后4，15000 rpm，離心，離心3

37、0分鐘。分鐘。 取上清加入等體積的取上清加入等體積的氯仿氯仿充分混勻后充分混勻后13000 rpm，4，離心，離心10分鐘。分鐘。 取上清加入取上清加入0.8 v（4 ml）異丙醇異丙醇充分混勻后充分混勻后 -20放置放置30分分鐘以上，鐘以上，4，15000 rpm，離心，離心30分鐘。分鐘。 棄上清，沉淀用棄上清，沉淀用3ml 70%的的冰乙醇冰乙醇洗滌，洗滌，4，15000 rpm，離心離心5分鐘。分鐘。 棄上清，沉淀于棄上清，沉淀于37涼干后，用涼干后，用1 ml ddh2o 溶解并移入溶解并移入eppendorf管中。管中。 取取5 ml電泳。電泳。ctab法提取植物法提取植物基因組

38、基因組dna ctab(十六烷基三乙基溴化銨十六烷基三乙基溴化銨)是一種去污是一種去污劑，可溶解細(xì)胞膜，它能與核酸形成復(fù)合物，劑，可溶解細(xì)胞膜，它能與核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液中（在高鹽溶液中（0.7 mol/l nacl）是可溶的，當(dāng)）是可溶的，當(dāng)降低溶液鹽濃度到一定程度（降低溶液鹽濃度到一定程度（0.3 mol/l nacl）時(shí)，從溶液中沉淀，通過離心就可將時(shí)，從溶液中沉淀，通過離心就可將ctab-核核酸的復(fù)合物與蛋白，多糖類物質(zhì)分開。酸的復(fù)合物與蛋白，多糖類物質(zhì)分開。最后通過乙醇或異丙醇沉淀最后通過乙醇或異丙醇沉淀dna，而，而ctab溶于乙醇或異丙醇而除去。溶于乙醇或異丙醇而除去。實(shí)驗(yàn)

39、程序?qū)嶒?yàn)程序1.在在2ml離心管中，加入離心管中，加入500l的的2ctab和和20 l-巰基乙醇巰基乙醇, 65預(yù)熱。預(yù)熱。2嫩的組織材料嫩的組織材料1-2g,用蒸餾水沖洗干凈，再用滅菌用蒸餾水沖洗干凈，再用滅菌ddh2o沖洗沖洗2次，放入經(jīng)液氮預(yù)冷的研缽中，加入次，放入經(jīng)液氮預(yù)冷的研缽中，加入液氮研磨液氮研磨至粉末狀，用干凈的滅菌不銹鋼勺轉(zhuǎn)移粉至粉末狀，用干凈的滅菌不銹鋼勺轉(zhuǎn)移粉末到預(yù)熱的離心管中，總體積達(dá)到末到預(yù)熱的離心管中，總體積達(dá)到1ml混勻后置混勻后置65水浴中保溫水浴中保溫45-60min，并不時(shí)輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)試管。，并不時(shí)輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)試管。注：注：凍存材料直接研磨，絕對(duì)不能化凍。而且粉末

40、凍存材料直接研磨，絕對(duì)不能化凍。而且粉末應(yīng)在化凍前轉(zhuǎn)移否則內(nèi)源性應(yīng)在化凍前轉(zhuǎn)移否則內(nèi)源性dnase有可能降解有可能降解基因組基因組dna。實(shí)驗(yàn)程序?qū)嶒?yàn)程序3加等體積的加等體積的氯仿氯仿/異戊醇異戊醇，輕輕地顛倒混勻，室溫，輕輕地顛倒混勻，室溫下下10 000rpm離心離心10 min，移上清至另一新管中。，移上清至另一新管中。4向管中加入向管中加入1/100體積的體積的rnase a溶液，置溶液，置3720-30min。5加入加入2倍體積的倍體積的100%乙醇乙醇或或0.7倍體積異丙醇，會(huì)倍體積異丙醇，會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，出現(xiàn)絮狀沉淀，-20放置放置30 min或或-80放置放置10min，12

41、000rpm離心離心10-15min回收回收dna沉淀。沉淀。6 用用70%乙醇乙醇清洗沉淀兩次，吹干后溶于適量的滅清洗沉淀兩次，吹干后溶于適量的滅菌菌ddh2o中。中。7 0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組基因組dna的完整性。的完整性。 核酸提取的注意事項(xiàng)核酸提取的注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融要反復(fù)凍融 提取血液基因組提取血液基因組dnadna時(shí)，要選擇有核細(xì)胞時(shí)，要選擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞）（白細(xì)胞） 組培細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間不能過長(zhǎng)，否則會(huì)造成組培細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間不能過長(zhǎng)，否則會(huì)造成dnadna降解降解

42、 含病毒的液體材料含病毒的液體材料dnadna含量較少，提取前先含量較少，提取前先富集富集注意事項(xiàng)（細(xì)胞破碎）注意事項(xiàng)（細(xì)胞破碎） 材料應(yīng)適量材料應(yīng)適量，過多會(huì)影響裂解，導(dǎo)致，過多會(huì)影響裂解，導(dǎo)致dnadna量量少，純度低少，純度低 針對(duì)不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式針對(duì)不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨動(dòng)物組織勻漿或液氮研磨動(dòng)物組織勻漿或液氮研磨組培細(xì)胞蛋白酶組培細(xì)胞蛋白酶k k細(xì)菌溶菌酶破壁細(xì)菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠 高溫溫浴時(shí)，定時(shí)輕柔振蕩高溫溫浴時(shí)，定時(shí)輕柔振蕩注意事項(xiàng)（分離與純化）注意事項(xiàng)（分離與純化） 采用吸附材料吸附的

43、方式分離采用吸附材料吸附的方式分離dnadna時(shí)，應(yīng)提時(shí)，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系供相應(yīng)的緩沖體系 采用有機(jī)（酚采用有機(jī)（酚/ /氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，但氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，但動(dòng)作要輕柔動(dòng)作要輕柔 離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間 針對(duì)不同材料的特點(diǎn)，在提取過程中輔以相針對(duì)不同材料的特點(diǎn)，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法應(yīng)的去雜質(zhì)的方法注意事項(xiàng)（沉淀、溶解）注意事項(xiàng)（沉淀、溶解） 當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會(huì)更充分淀會(huì)更充分 沉淀時(shí)加入沉淀時(shí)加入1/10體積的體積的naac（ph

44、5.2，3m），有利于），有利于充分沉淀充分沉淀 沉淀后應(yīng)用沉淀后應(yīng)用70的乙醇洗滌，以除去鹽離子等的乙醇洗滌，以除去鹽離子等 晾干晾干dna，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥），讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥） 若長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議使用若長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議使用te緩沖液溶解緩沖液溶解te中的中的edta能螯和能螯和mg2+或或mn2+離子，抑制離子，抑制dnaseph值為值為8.0，可防止，可防止dna發(fā)生酸解發(fā)生酸解 核酸提取的常見問題與對(duì)策核酸提取的常見問題與對(duì)策常見問題與對(duì)策常見問題與對(duì)策1. 1.dnadna中含有蛋白、中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)多糖、多酚類雜質(zhì)2.2.dnadna在溶解前，有在溶解

45、前，有酒精殘留，酒精抑酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)制后續(xù)酶解反應(yīng)3.3.dnadna中殘留有金屬中殘留有金屬離子離子1. 1.重新純化重新純化dnadna，去，去除蛋白、多糖、多酚除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)等雜質(zhì)2.2.重新沉淀重新沉淀dnadna，讓，讓酒精充分揮發(fā)酒精充分揮發(fā)3.3.增加增加7070乙醇洗滌乙醇洗滌的次數(shù)（的次數(shù)（2-32-3次）次）q問題一：?jiǎn)栴}一：dnadna樣品不純，抑制后續(xù)酶解和樣品不純，抑制后續(xù)酶解和pcrpcr反應(yīng)。反應(yīng)。 原原因因?qū)?duì)策策問題與對(duì)策問題與對(duì)策1. 1.材料不新鮮或反復(fù)凍材料不新鮮或反復(fù)凍融融2.2.未很好抑制內(nèi)源核酸未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性酶

46、的活性3.3.提取過程操作過于劇提取過程操作過于劇烈，烈，dnadna被機(jī)械打斷被機(jī)械打斷4.4.外源核酸酶污染外源核酸酶污染5.5.反復(fù)凍融反復(fù)凍融1. 1.盡量取新鮮材料，低溫保存材料避盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融免反復(fù)凍融2.2.液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液前加入裂解緩沖液3.3.在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的的dnadna時(shí)，可增加裂解液中螯合劑時(shí)，可增加裂解液中螯合劑的含量的含量4.4.細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔5.5.所有試劑用無(wú)菌水配制，耗材經(jīng)高所有試劑用

47、無(wú)菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌溫滅菌6.6.將將dnadna分裝保存于緩沖液中，避免分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融反復(fù)凍融q問題二：?jiǎn)栴}二：dnadna降解降解對(duì)對(duì)策策 原原因因問題與對(duì)策問題與對(duì)策1. 1.實(shí)驗(yàn)材料不佳或量少實(shí)驗(yàn)材料不佳或量少2.2.破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分3.3.沉淀不完全沉淀不完全4.4.洗滌時(shí)洗滌時(shí)dnadna丟失丟失1. 1.盡量選用新鮮（幼嫩）的材盡量選用新鮮（幼嫩）的材料料2.2.動(dòng)植物要?jiǎng)驖{研磨充分；動(dòng)植物要?jiǎng)驖{研磨充分；g g菌、酵母裂解前先用生物酶菌、酵母裂解前先用生物酶或機(jī)械方式破壁或機(jī)械方式破壁3.3.高溫裂解時(shí)，時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)高溫裂解時(shí)，時(shí)間適當(dāng)延

48、長(zhǎng)（對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌可增（對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌可增加加pkpk的用量）的用量）4.4.低溫沉淀，延長(zhǎng)沉淀時(shí)間低溫沉淀，延長(zhǎng)沉淀時(shí)間5.5.加輔助物，促進(jìn)沉淀加輔助物，促進(jìn)沉淀6.6.洗滌時(shí)，最好用槍頭將洗滌洗滌時(shí)，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒液吸出，勿傾倒q問題三：?jiǎn)栴}三：dnadna提取量少提取量少對(duì)對(duì)策策 原因原因核酸提取的相關(guān)說明核酸提取的相關(guān)說明為什么用無(wú)水乙醇沉淀為什么用無(wú)水乙醇沉淀dna?在用無(wú)水乙醇沉淀在用無(wú)水乙醇沉淀dna時(shí)，為什么加時(shí)，為什么加naac或或nacl?加核糖核酸酶降解核糖核酸后加核糖核酸酶降解核糖核酸后,為什么再用為什么再用sds與與kac來(lái)處理來(lái)處理?為什么

49、在保存或抽提為什么在保存或抽提dna過程中，一般采用過程中，一般采用te緩沖緩沖液？液？如何選擇聚乙二醇如何選擇聚乙二醇(6000)的濃度來(lái)沉淀的濃度來(lái)沉淀dna?抽提抽提dna去除蛋白質(zhì)時(shí)去除蛋白質(zhì)時(shí),怎樣使用酚與氯仿較好怎樣使用酚與氯仿較好?為什么用酚與氯仿抽提為什么用酚與氯仿抽提dna時(shí)時(shí),還要加少量的異戌醇還要加少量的異戌醇?為什么要用為什么要用ph8的的tris水溶液飽和酚水溶液飽和酚?呈粉紅色的酚可呈粉紅色的酚可否使用否使用?如何保存酚不被空氣氧化如何保存酚不被空氣氧化?為什么用無(wú)水乙為什么用無(wú)水乙醇沉淀醇沉淀dna?dna?乙醇的優(yōu)點(diǎn)乙醇的優(yōu)點(diǎn)：可以任意比和水相混溶：可以任意比和

50、水相混溶, ,乙醇與核乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng)酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng), ,對(duì)對(duì)dnadna很安全很安全, ,因此是理因此是理想的沉淀劑。想的沉淀劑。原理：原理：dnadna溶液是溶液是dnadna以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在, ,當(dāng)加當(dāng)加入乙醇時(shí)入乙醇時(shí), ,乙醇會(huì)奪乙醇會(huì)奪dnadna周圍的水分子周圍的水分子, ,使使dnadna失水失水而易于聚合。而易于聚合。在用無(wú)水乙醇沉淀在用無(wú)水乙醇沉淀dna時(shí)，時(shí)，為什么要加為什么要加naac或或nacl在在ph為為8左右的左右的dna溶液中溶液中,dna分子是帶分子是帶負(fù)電荷的負(fù)電荷的,加一定濃度的加一定濃度的naac或或nacl,使使n

51、a+中中和和dna分子上的負(fù)電荷分子上的負(fù)電荷,減少減少dna分子之間的同分子之間的同性電荷相斥力性電荷相斥力,易于互相聚合而形成易于互相聚合而形成dna鈉鹽沉鈉鹽沉淀淀,當(dāng)加入的鹽溶液濃度太低時(shí)當(dāng)加入的鹽溶液濃度太低時(shí),只有部分只有部分dna形成形成dna鈉鹽而聚合鈉鹽而聚合,這樣就造成這樣就造成dna沉淀不完沉淀不完全全,當(dāng)加入的鹽溶液濃度太高時(shí)當(dāng)加入的鹽溶液濃度太高時(shí),其效果也不好其效果也不好.在沉淀的在沉淀的dna中中,由于過多的鹽雜質(zhì)存在由于過多的鹽雜質(zhì)存在,影響影響dna的酶切等反應(yīng)的酶切等反應(yīng),必須要進(jìn)行洗滌或重沉淀必須要進(jìn)行洗滌或重沉淀. 加核糖核酸酶降解核糖核酸后加核糖核酸酶

52、降解核糖核酸后,為什么再要用為什么再要用sds與與kac來(lái)處理來(lái)處理? 加進(jìn)去的加進(jìn)去的rnase本身是一種蛋白質(zhì)本身是一種蛋白質(zhì),為了純?yōu)榱思兓痙na,又必須去除之又必須去除之,加加sds可使它們成為可使它們成為sds-蛋白復(fù)合物沉淀蛋白復(fù)合物沉淀,再加再加kac使這些復(fù)合物使這些復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}形式的轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}形式的sds-蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)復(fù)合物復(fù)合物,使沉淀更加完全。也可用飽和酚，氯使沉淀更加完全。也可用飽和酚，氯仿抽提再沉淀，去除仿抽提再沉淀，去除rnase。在溶液中，有人。在溶液中，有人以以kac代替代替naac，也可以收到較好的效果。，也可以收到較好的效果。為

53、什么在保存或抽提為什么在保存或抽提dnadna過過程中，一般采用程中，一般采用tete緩沖液？緩沖液？在基因操作實(shí)驗(yàn)中，選擇緩沖液的主要原在基因操作實(shí)驗(yàn)中，選擇緩沖液的主要原則是考慮則是考慮dnadna的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用擾作用。在在dnadna反應(yīng)時(shí)反應(yīng)時(shí), ,不同的酶對(duì)輔助因子的種類不同的酶對(duì)輔助因子的種類及數(shù)量要求不同及數(shù)量要求不同, ,有的要求高離子濃度有的要求高離子濃度, ,有的有的則要求低鹽濃度則要求低鹽濃度, ,采用采用tris-hcl(pka=8.0)tris-hcl(pka=8.0)的的緩沖系統(tǒng)緩沖系統(tǒng), ,由于緩沖液是由于緩沖液是t

54、rish+/tris,trish+/tris,不存在不存在金屬離子的干擾作用金屬離子的干擾作用, ,故在提取或保存故在提取或保存dnadna時(shí)時(shí), ,大都采用大都采用tris-hcltris-hcl系統(tǒng)系統(tǒng), ,而而tete緩沖液中的緩沖液中的edtaedta更能穩(wěn)定更能穩(wěn)定dnadna的活性的活性. . 如何選擇聚乙二醇如何選擇聚乙二醇(6000)的的濃度來(lái)沉淀濃度來(lái)沉淀dna?采用采用peg(6000)沉淀沉淀dna，大小不同的，大小不同的dna分子所用的分子所用的peg的濃度也不同的濃度也不同,peg的濃度低的濃度低,選擇選擇性沉淀性沉淀dna分子量大分子量大,大分子所需大分子所需peg

55、的濃度只需的濃度只需1%左右左右,小分子所需小分子所需peg濃度高達(dá)濃度高達(dá)20%. 選擇性沉淀選擇性沉淀4.3kb的的pbr322質(zhì)粒質(zhì)粒dna,每毫升每毫升加入加入0.4毫升的毫升的30%peg,其最終其最終peg濃度為濃度為12%.peg選擇性沉淀選擇性沉淀dna的分辯率大約的分辯率大約100bp. 抽提抽提dnadna去除蛋白質(zhì)時(shí)去除蛋白質(zhì)時(shí), ,怎怎樣使用酚與氯仿較好樣使用酚與氯仿較好? ?苯酚：苯酚：使蛋白質(zhì)變性，同時(shí)抑制了使蛋白質(zhì)變性，同時(shí)抑制了dnasednase的降解作的降解作用。用苯酚處理勻漿液時(shí)，由于蛋白與用。用苯酚處理勻漿液時(shí)，由于蛋白與dna dna 聯(lián)結(jié)聯(lián)結(jié)鍵已斷，

56、蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而dnadna溶于水相。溶于水相。氯仿：氯仿：克服酚的缺點(diǎn)；加速有機(jī)相與水相分層?？朔拥娜秉c(diǎn)；加速有機(jī)相與水相分層。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的痕量酚。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的痕量酚。（酚易溶于氯仿中）（酚易溶于氯仿中）經(jīng)過離心經(jīng)過離心, ,變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度為大變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度為大, ,因因而與水相分離而與水相分離, ,沉淀在水相下面沉淀在水相下面, ,從而與溶解在水從而與溶解在水相中的相中的dnadna分開。而酚與氯仿有機(jī)

57、溶劑比重更大分開。而酚與氯仿有機(jī)溶劑比重更大, ,保留在最下層保留在最下層。 在去除蛋白質(zhì)的作用中在去除蛋白質(zhì)的作用中, ,各有利弊各有利弊, ,酚的變性作酚的變性作用大用大, ,但酚與水相有一定程度的互溶但酚與水相有一定程度的互溶, ,大約大約10%-15%10%-15%的水溶解在酚相中的水溶解在酚相中, ,因而損失了這部分水相中的因而損失了這部分水相中的dna,dna,而氯仿的變性作用不如酚效果好而氯仿的變性作用不如酚效果好, ,但氯仿與水但氯仿與水不相混溶不相混溶, ,不會(huì)帶走不會(huì)帶走dnadna。所以在抽提過程中。所以在抽提過程中, ,混合混合使用酚與氯仿效果最好。經(jīng)酚第一次抽提后的水

58、使用酚與氯仿效果最好。經(jīng)酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚相中有殘留的酚, ,由于酚與氯仿是互溶的由于酚與氯仿是互溶的, ,可用氯可用氯仿第二次變性蛋白質(zhì)仿第二次變性蛋白質(zhì), ,此時(shí)一起將酚帶走。也可以此時(shí)一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時(shí)在第二次抽提時(shí), ,將酚與氯仿混合將酚與氯仿混合(1:1)(1:1)使用。使用。（利用氯仿除酚）（利用氯仿除酚）為什么用酚與氯仿抽提為什么用酚與氯仿抽提dnadna時(shí)時(shí), ,還要加少量的異戌醇還要加少量的異戌醇? ?在抽提在抽提dnadna時(shí)時(shí), ,為了混合均勻?yàn)榱嘶旌暇鶆? ,必須劇烈振蕩數(shù)必須劇烈振蕩數(shù)次次, ,這時(shí)在混合液內(nèi)易產(chǎn)生氣泡這時(shí)在混合液內(nèi)易產(chǎn)生

59、氣泡, ,氣泡會(huì)阻止氣泡會(huì)阻止相互間的充分作用。相互間的充分作用。加入異戌醇能降低分子表面張力加入異戌醇能降低分子表面張力, ,所以能減少所以能減少抽提過程中的泡沫產(chǎn)生抽提過程中的泡沫產(chǎn)生。一般采用氯仿與異戌醇為一般采用氯仿與異戌醇為24:124:1之比。也可以之比。也可以采用酚采用酚, ,氯仿與異戌醇之比為氯仿與異戌醇之比為25:24:1(25:24:1(不必先不必先配制配制, ,可在臨用前把一份酚加入一份可在臨用前把一份酚加入一份24:124:1的氯的氯仿互異戌醇即成仿互異戌醇即成,),)，同時(shí)異戌醇有助于分相，同時(shí)異戌醇有助于分相, ,使離心后的上層水相使離心后的上層水相, ,中層變性蛋

60、白相以及下中層變性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。 為什么要用為什么要用ph8ph8的的tristris水溶液水溶液飽和酚飽和酚? ?呈粉紅色的酚可否呈粉紅色的酚可否使用使用? ?如何保存酚不被空氣如何保存酚不被空氣氧化氧化? ?因?yàn)榉优c水有一定的互溶。苯酚用水飽和的目的是使其因?yàn)榉优c水有一定的互溶。苯酚用水飽和的目的是使其抽提抽提dnadna過程中過程中, ,不致吸收樣品中含有不致吸收樣品中含有dnadna的水分的水分, ,減少減少dnadna的損失。的損失。用用tristris調(diào)節(jié)至調(diào)節(jié)至phph為為8 8是因?yàn)槭且驗(yàn)閐nadna在此條件下比較穩(wěn)定在此條件下比較穩(wěn)定