細(xì)胞的破碎與分離學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1第一頁(yè)，共72頁(yè)。本章的主要(zhyo)內(nèi)容常見(jiàn)(chn jin)的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)細(xì)胞(xbo)破碎技術(shù)包涵體的純化方法第1頁(yè)/共72頁(yè)第二頁(yè)，共72頁(yè)。概述(i sh)破碎。破碎。第2頁(yè)/共72頁(yè)第三頁(yè)，共72頁(yè)。概述(i sh)在生物體中。在生物體中。第3頁(yè)/共72頁(yè)第四頁(yè)，共72頁(yè)。概述(i sh)第4頁(yè)/共72頁(yè)第五頁(yè)，共72頁(yè)。定義(dngy)第5頁(yè)/共72頁(yè)第六頁(yè)，共72頁(yè)。微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞外層均為細(xì)胞壁，細(xì)胞壁里面是細(xì)胞膜，動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞壁，僅有細(xì)胞膜。通常細(xì)胞壁較堅(jiān)韌，細(xì)胞膜脆弱，易受滲透壓沖擊而破碎，因此細(xì)胞破碎的阻力主要來(lái)自于細(xì)胞壁。不同細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)(jigu)和

2、組成不完全相同，故細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng)度不同，細(xì)胞破碎的難易程度也就不同。細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)(jigu)對(duì)破碎的影響第6頁(yè)/共72頁(yè)第七頁(yè)，共72頁(yè)。Z 幾乎(jh)所有細(xì)菌的細(xì)胞壁都是由肽聚糖組成，它是難溶性的聚糖鏈；Z 相鄰聚糖鏈上的短肽又交叉相聯(lián)，構(gòu)成了細(xì)胞壁的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，包圍在細(xì)胞周?chē)?；Z 使細(xì)胞具有一定的形狀和強(qiáng)度。第7頁(yè)/共72頁(yè)第八頁(yè)，共72頁(yè)。u破碎細(xì)菌的主要阻力是來(lái)自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其網(wǎng)結(jié)構(gòu)的致密程度和強(qiáng)度取決于聚糖鏈上所存在的肽鍵的數(shù)量和其交聯(lián)的程度。u革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與革蘭氏陽(yáng)性菌有很大不同。 u革蘭氏陰性菌典型的生物是大腸桿菌，通過(guò)這種細(xì)胞生產(chǎn)了很多細(xì)胞重組(zhn z

3、)的產(chǎn)物。藥物名稱(chēng)藥物名稱(chēng)宿主宿主用途用途胰島素胰島素大腸桿菌大腸桿菌治療糖尿病治療糖尿病人生長(zhǎng)激素人生長(zhǎng)激素大腸桿菌大腸桿菌治療侏儒病治療侏儒病- -干擾素干擾素大腸桿菌大腸桿菌治療毛狀細(xì)胞白血病等治療毛狀細(xì)胞白血病等第8頁(yè)/共72頁(yè)第九頁(yè)，共72頁(yè)。第9頁(yè)/共72頁(yè)第十頁(yè)，共72頁(yè)。酵母(jiom)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)示意圖u最里層是由葡聚糖的細(xì)纖維組成，它構(gòu)成了細(xì)胞壁的剛性骨架，使細(xì)胞具有一定的形狀，u上面的是一層糖蛋白，u最 外 層 是 甘 露 聚 糖 ， 由1,6-磷酸二酯鍵連接成網(wǎng)狀。在該層的內(nèi)部，有甘露聚糖-酶的復(fù)合物。u破碎酵母細(xì)胞壁的阻力主要決定(judng)于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和

4、它的厚度。第10頁(yè)/共72頁(yè)第十一頁(yè)，共72頁(yè)。第11頁(yè)/共72頁(yè)第十二頁(yè)，共72頁(yè)。細(xì)胞壁的組成(z chn)和結(jié)構(gòu)微生微生物物革蘭氏革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌陽(yáng)性細(xì)菌革蘭氏革蘭氏陰性細(xì)菌陰性細(xì)菌酵母菌酵母菌真菌真菌壁厚壁厚20-80 nm20-80 nm10-13 nm10-13 nm100-300nm100-300nm100-250nm100-250nm層次層次單層單層多層多層多層多層多層多層主要主要組成組成肽聚糖肽聚糖(40-90%)(40-90%)多糖多糖胞壁酸胞壁酸蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)脂多糖脂多糖(1-4%)(1-4%)肽聚糖肽聚糖 (5-10%)(5-10%)脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖(11-22%)

5、(11-22%)磷脂磷脂蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)葡聚糖葡聚糖(30-40%)(30-40%)甘露聚糖甘露聚糖(30%)(30%)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)(6-8%)(6-8%)脂類(lèi)脂類(lèi)(8.5-(8.5-13.5%)13.5%)多聚糖多聚糖(80-90%)(80-90%)脂類(lèi)脂類(lèi)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)第12頁(yè)/共72頁(yè)第十三頁(yè)，共72頁(yè)。細(xì)胞破碎(p su)技術(shù)第13頁(yè)/共72頁(yè)第十四頁(yè)，共72頁(yè)。細(xì)胞破碎(p su)技術(shù)第14頁(yè)/共72頁(yè)第十五頁(yè)，共72頁(yè)。細(xì)胞破碎(p su)技術(shù)第15頁(yè)/共72頁(yè)第十六頁(yè)，共72頁(yè)。細(xì)胞(xbo)破碎方法及其原理機(jī)械(jxi)破碎搗碎法研磨(ynm)法勻漿法超聲法 物理破碎溫度差破碎法壓力

6、差破碎法化學(xué)破碎有機(jī)溶劑：表面活性劑：酸堿酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過(guò)機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。通過(guò)各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎。通過(guò)各種化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎通過(guò)細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎第16頁(yè)/共72頁(yè)第十七頁(yè)，共72頁(yè)。機(jī)械(jxi)破碎法又可分為：高壓勻漿破碎法（homogenization）高速珠研磨破碎法（bead grinding）超聲波破碎法（ultrasonication）第17頁(yè)/共72頁(yè)第十八頁(yè)，共72頁(yè)。進(jìn)入珠磨機(jī)的細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁

7、等研磨劑（直徑小于1mm）一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子(zh zi)與細(xì)胞之間的互相剪切、碰撞，使細(xì)胞破碎，釋放出內(nèi)含物。在珠液分離器的協(xié)助下，珠子(zh zi)被滯留在破碎室內(nèi)，漿液流出從而實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作。破碎中產(chǎn)生的熱量一般采用夾套冷卻的方式帶走。1.珠磨法（Bead mill）原理(yunl)：第18頁(yè)/共72頁(yè)第十九頁(yè)，共72頁(yè)。Netzsch LM-20型珠磨機(jī)(m j)l 園盤(pán)以兩種位置交錯(cuò)地安裝在軸上，l 一種處于徑向，一種與軸傾斜，l 徑向盤(pán)使磨料沿徑向運(yùn)動(dòng)(yndng)，傾斜盤(pán)則產(chǎn)生軸向運(yùn)動(dòng)(yndng)。l 由于交錯(cuò)的運(yùn)動(dòng)(yndng)，提高了破碎效率。A-具有冷卻夾套的

8、圓筒形磨室B-具有冷卻裝置的攪拌(jiobn)軸和圓盤(pán)C-環(huán)形震動(dòng)俠縫分離器D-變速馬達(dá)1和2料液進(jìn)出口3和4 攪拌(jiobn)冷卻劑進(jìn)出口5和6磨室冷卻劑進(jìn)出口第19頁(yè)/共72頁(yè)第二十頁(yè)，共72頁(yè)。珠磨機(jī)(m j)破碎作用方程u 破碎(p su)作用是相對(duì)于時(shí)間的一級(jí)反應(yīng)速度過(guò)程，符合下列公式：u ln1/(1-x)=Kt u x 破碎(p su)率；K一 一級(jí)反應(yīng)速度常數(shù)；t一 時(shí)間。u K與攪拌轉(zhuǎn)速、細(xì)胞懸浮液濃度和循環(huán)速度、玻璃小珠裝量和珠體直徑，以及溫度等相關(guān)。珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、減少大分子目的產(chǎn)物的失活、減少由于高破碎率產(chǎn)生的細(xì)胞小碎片不易分離(fnl)

9、而給后續(xù)操作帶來(lái)的困難。該式中t在間歇操作時(shí)為破碎操作時(shí)間，連續(xù)操作時(shí)為細(xì)胞懸浮液在破碎室內(nèi)的平均停留時(shí)間，即t=V/Q V為破碎室的有效體積（即為懸浮液的體積），Q為料液流量。第20頁(yè)/共72頁(yè)第二十一頁(yè)，共72頁(yè)。膠體磨德國(guó)進(jìn)口(jn ku)珠磨機(jī)第21頁(yè)/共72頁(yè)第二十二頁(yè)，共72頁(yè)。p甘蔗(gn zhe)葉片和莖總RNA的提取及mRNA的分離純化 圖2-1甘蔗葉片總RNA Fig.2-1Total RNA isolated from sugarcane leaf 圖2-2甘蔗莖總RNAFig.2-2 Total RNA isolated from sugarcane stem 1%瓊脂

10、糖凝膠電泳檢測(cè)，顯示28S、18S和5S rRNA特征條帶清晰，說(shuō)明得到(d do)的總RNA完整性好，沒(méi)有可見(jiàn)的降解，也無(wú)明顯的基因組DNA污染。結(jié)果與分析第22頁(yè)/共72頁(yè)第二十三頁(yè)，共72頁(yè)。甘蔗葉片和莖mRNA呈彌撒(m sa)分布，長(zhǎng)度都分布在0.53 kb范圍內(nèi)，完全符合建庫(kù)要求。 圖2-3 mRNA電泳檢測(cè)結(jié)果 Fig.2-3 Agarose gel analysis of mRNA M: 1kb marker; 1: 葉片mRNA; 2: 莖mRNAM: 1kb marker; 1: leaf,s mRNA; 2: stem,s mRNAp甘蔗葉片(ypin)和莖總RNA的提取

11、及mRNA的分離純化結(jié)果與分析第23頁(yè)/共72頁(yè)第二十四頁(yè)，共72頁(yè)。p雙鏈cDNA（dscDNA）的合成(hchng)及檢測(cè) 圖2-4甘蔗葉片雙鏈cDNAFig.2-4 The dscDNA of sugarcane leaf 圖2-5 甘蔗莖雙鏈cDNA Fig.2-5 The dscDNA of sugarcane stem甘蔗葉片和莖dscDNA都分布在0.53 kb之間。說(shuō)明所獲得(hud)的dscDNA是完整的。甘蔗葉片和莖dscDNA圖片差異較大，是用于電泳檢測(cè)的dscDNA用量差異造成。 結(jié)果與分析第24頁(yè)/共72頁(yè)第二十五頁(yè)，共72頁(yè)。2.高壓(goy)勻漿法（High-pr

12、essure homogenization）利用高壓使細(xì)胞(xbo)懸浮液通過(guò)針形閥，由于突然減壓和高速?zèng)_擊撞擊環(huán)使細(xì)胞(xbo)破碎，細(xì)胞(xbo)懸浮液自高壓室針形閥噴出時(shí)，每秒速度高達(dá)幾百米，高速?lài)姵龅臐{液又射到靜止的撞擊環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出。細(xì)胞(xbo)在這一系列高速運(yùn)動(dòng)過(guò)程中經(jīng)歷了剪切、碰撞及由高壓到常壓的變化，從而造成細(xì)胞(xbo)破碎。原理(yunl)：大規(guī)模細(xì)胞破碎的常用方法，在微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞的大規(guī)模處理中常采用第25頁(yè)/共72頁(yè)第二十六頁(yè)，共72頁(yè)。高壓勻漿(yn jin)器的排出閥第26頁(yè)/共72頁(yè)第二十七頁(yè)，共72頁(yè)。第27頁(yè)/共72頁(yè)第二十八頁(yè)，共72

13、頁(yè)。p易造成(zo chn)堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌p較小的革蘭氏陽(yáng)性菌p含有包含體的基因工程菌不宜采用(ciyng)高壓勻漿法的細(xì)胞類(lèi)型。 第28頁(yè)/共72頁(yè)第二十九頁(yè)，共72頁(yè)。大、中、小型高壓(goy)勻漿器第29頁(yè)/共72頁(yè)第三十頁(yè)，共72頁(yè)。u超聲波破碎法（Ultrasonication)利用超聲波振蕩器發(fā)射的15-25kHz的超聲波探頭處理細(xì)胞懸浮液。u超聲波振蕩器以可分為(fn wi)槽式和探頭直接插入介質(zhì)兩種型式，一般破碎效果后者比前者好。u超聲波的細(xì)胞破碎效率與細(xì)胞種類(lèi)、濃度和超聲波的聲頻、聲能有關(guān)。3.超聲破碎(p su)法（Ultrasonication）第30頁(yè)/共72頁(yè)第

14、三十一頁(yè)，共72頁(yè)。第31頁(yè)/共72頁(yè)第三十二頁(yè)，共72頁(yè)。第32頁(yè)/共72頁(yè)第三十三頁(yè)，共72頁(yè)。第33頁(yè)/共72頁(yè)第三十四頁(yè)，共72頁(yè)。機(jī)械(jxi)法的缺點(diǎn)（1）需要高的能量并且產(chǎn)生高溫和高的剪切力，容易使不穩(wěn)定產(chǎn)品變性失活；（2）就破碎的有機(jī)體或釋放的產(chǎn)物而論，它們是非專(zhuān)一的，并且產(chǎn)生碎片微粒尺寸的大范圍細(xì)分布(fnb)，大量細(xì)顆粒給分離帶來(lái)了困難。第34頁(yè)/共72頁(yè)第三十五頁(yè)，共72頁(yè)。第35頁(yè)/共72頁(yè)第三十六頁(yè)，共72頁(yè)。1.酶溶法（Enzymatic Lysis）（1）外加(wiji)酶法常用(chn yn)的溶酶溶菌酶-1，3-葡聚糖酶-1，6-葡聚糖酶蛋白酶甘露(gnl)糖

15、酶糖苷酶肽鍵內(nèi)切酶殼多糖酶等酶解是利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜。第36頁(yè)/共72頁(yè)第三十七頁(yè)，共72頁(yè)。（1）外加(wiji)酶法第37頁(yè)/共72頁(yè)第三十八頁(yè)，共72頁(yè)。（1）外加(wiji)酶法第38頁(yè)/共72頁(yè)第三十九頁(yè)，共72頁(yè)。u優(yōu)點(diǎn)：u產(chǎn)品(chnpn)釋放的選擇性高；抽提的速率和收率高；產(chǎn)品(chnpn)的破壞最少；條件溫和，對(duì)PH值和溫度等外界條件要求低；不殘留細(xì)胞碎片。u缺點(diǎn)(qudin)：u溶酶價(jià)格高，溶酶法通用性差，產(chǎn)物抑制的存在。酶溶法的優(yōu)缺點(diǎn)第39頁(yè)/共72頁(yè)第四十頁(yè)，共72頁(yè)。 （2）自溶法（Autolysis）

16、u 自溶作用是酶解的另一種方法，利用生物體自身產(chǎn)生的酶來(lái)溶胞，而不需外加其他的酶。u 在微生物代謝過(guò)程中，大多數(shù)都能產(chǎn)生一種能水解細(xì)胞壁上聚合物的酶，以便生長(zhǎng)過(guò)程繼續(xù)下去。u 自溶作用：改變其生長(zhǎng)環(huán)境（溫度、緩沖液），可以誘發(fā)產(chǎn)生過(guò)剩(gushng)的這種酶或激發(fā)產(chǎn)生其它的自溶酶，以達(dá)到自溶目的。u 缺點(diǎn)是：易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后細(xì)胞懸浮液粘度增大，過(guò)濾速度下降。第40頁(yè)/共72頁(yè)第四十一頁(yè)，共72頁(yè)。某些化學(xué)試劑，如有機(jī)溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯合劑等，可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性（滲透(shntu)性），從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透(shntu)出來(lái)。2.化學(xué)(huxu)

17、滲透法（Chemical permeation）該法取決于化學(xué)試劑的類(lèi)型以及細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)(jigu)與組成。 第41頁(yè)/共72頁(yè)第四十二頁(yè)，共72頁(yè)。（1）酸、堿處理(chl)法采用酸堿調(diào)節(jié)溶液的PH值，改變細(xì)胞所處的環(huán)境(hunjng)，從而改變兩性產(chǎn)物蛋白質(zhì)的電荷性質(zhì)，使蛋白質(zhì)之間或蛋白質(zhì)與其他物質(zhì)之間的作用力降低而易于溶解到液相中去，便于后面的提取。第42頁(yè)/共72頁(yè)第四十三頁(yè)，共72頁(yè)。（2）表面(biomin)活性劑無(wú)論表面活性劑是陰離子、陽(yáng)離子還是非離子型，都是兩性的，既能和水作用也能和脂作用，能與細(xì)胞壁上的脂蛋白結(jié)合，形成微泡，使膜的通透性增加(zngji)或溶解細(xì)胞破碎常用的

18、表面活性劑：十二烷基硫酸鈉（SDS，陰離子型）；非離子型如Triton X-100和吐溫（Tween）等對(duì)疏水性物質(zhì)具有很強(qiáng)的親和力，能結(jié)合并溶解磷脂，破壞(phui)內(nèi)膜的磷脂雙分子層，使某些胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來(lái)。第43頁(yè)/共72頁(yè)第四十四頁(yè)，共72頁(yè)。u能被細(xì)胞壁脂質(zhì)層吸收后，使胞壁膜溶脹，細(xì)胞破裂(pli)，胞內(nèi)物質(zhì)被釋放出來(lái)。u乙醇、異丙醇、甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高級(jí)醇等。（3）有機(jī)溶劑u與水中氫鍵作用，削弱溶質(zhì)分子間的疏水作用，從而(cng r)使疏水性化合物溶于水溶液。u鹽酸胍和脲是常用的變性劑。第44頁(yè)/共72頁(yè)第四十五頁(yè)，共72頁(yè)。u通用性差；u時(shí)間長(zhǎng)，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)釋放(

19、shfng)率不超過(guò)50% ；u有些化學(xué)試劑有毒 。u化學(xué)試劑的加入常會(huì)給隨后產(chǎn)物的純化帶來(lái)困難，并影響 最終產(chǎn)物純度?；瘜W(xué)(huxu)滲透法優(yōu)缺點(diǎn)：缺點(diǎn)(qudin)：優(yōu)點(diǎn)：l對(duì)產(chǎn)物釋放有一定的選擇性，可使一些較小分子量的溶質(zhì)如多肽和小分子的酶蛋白透過(guò)，而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留在胞內(nèi)；l細(xì)胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進(jìn)一步提取。第45頁(yè)/共72頁(yè)第四十六頁(yè)，共72頁(yè)。2.物理(wl)法（Physical permeation）第46頁(yè)/共72頁(yè)第四十七頁(yè)，共72頁(yè)。第47頁(yè)/共72頁(yè)第四十八頁(yè)，共72頁(yè)。u將細(xì)胞放在低溫下突然冷凍而在室溫下緩慢融化，反復(fù)多次而達(dá)到(d

20、do)破壁作用。u一方面使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，使細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度變化，引起細(xì)胞膨脹而破裂。u適用于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需反復(fù)多次。 第48頁(yè)/共72頁(yè)第四十九頁(yè)，共72頁(yè)。3）干燥(gnzo)法氣流干燥真空干燥噴霧干燥冷凍干燥使細(xì)胞結(jié)合水分喪失，從而改變細(xì)胞的滲透性。當(dāng)采用丙酮、丁醇或緩沖液等對(duì)干燥細(xì)胞進(jìn)行處理時(shí)，胞內(nèi)物質(zhì)就容易被抽提出來(lái)(ch li)。氣流干燥主要適用于酵母菌，一般在25-30的氣流中吹干；真空干燥多用于細(xì)菌。冷凍干燥適用于不穩(wěn)定的生化物質(zhì)第49頁(yè)/共72頁(yè)第五十頁(yè)，共72頁(yè)。第50頁(yè)/共72頁(yè)第五十一頁(yè)，共72頁(yè)。選擇破碎方法(fngf)

21、的依據(jù)第51頁(yè)/共72頁(yè)第五十二頁(yè)，共72頁(yè)。選擇性釋放(shfng)目標(biāo)產(chǎn)物的一般原則僅破壞或破碎存在目標(biāo)產(chǎn)物的位置周?chē)?dāng)目標(biāo)產(chǎn)物存在于細(xì)胞膜附近時(shí)，可采用較混和的方法，如酶溶法、滲透壓沖擊法和凍結(jié)融化法等。當(dāng)目標(biāo)產(chǎn)物存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)時(shí)，則需采用強(qiáng)烈的機(jī)械破碎法當(dāng)目標(biāo)產(chǎn)物處于與細(xì)胞膜或細(xì)胞壁結(jié)合的狀態(tài)時(shí)，調(diào)節(jié)溶液PH值，離子強(qiáng)度或添加與目標(biāo)產(chǎn)物具有親和性的試劑如：螯合劑、表面活性劑等，使目標(biāo)產(chǎn)物容易溶解釋放。(2)機(jī)械破碎法和化學(xué)法并用(bn yn)可使操作條件更加溫和，在相同的目標(biāo)產(chǎn)物釋放率條件下，降低細(xì)胞的破碎程度。第52頁(yè)/共72頁(yè)第五十三頁(yè)，共72頁(yè)。破碎率的測(cè)定與破碎技術(shù)的研究(yn

22、ji)方向 1. 破碎率的測(cè)定(cdng)1) 直接測(cè)定法2) 目的(md)產(chǎn)物測(cè)定法3) 導(dǎo)電率測(cè)定法采用染色法把破碎的細(xì)胞與未破碎的細(xì)胞區(qū)別開(kāi)來(lái)。如破碎的革蘭氏陽(yáng)性菌可染成革蘭氏陰性菌的顏色；采用革蘭氏染色法染色酵母破碎液，完整的細(xì)胞呈紫色，而受損害的細(xì)胞呈亮紅色。將破碎后的細(xì)胞懸浮液離心，測(cè)定上清液中目的產(chǎn)物含量或活性，并與100%破碎率的標(biāo)準(zhǔn)值比較，計(jì)算其破碎率。細(xì)胞破碎后，大量帶電荷的內(nèi)含物被釋放到水相，使導(dǎo)電率上升。 第53頁(yè)/共72頁(yè)第五十四頁(yè)，共72頁(yè)。2.破碎(p su)技術(shù)的研究方向1) 多種破碎方法相結(jié)合2) 與上游過(guò)程(guchng)相結(jié)合3) 與下游工程相結(jié)合第54頁(yè)

23、/共72頁(yè)第五十五頁(yè)，共72頁(yè)?；蚬こ?jyn gngchng)表達(dá)產(chǎn)物后處理的特殊性基因工程菌培養(yǎng)液不同表達(dá)形式的前處理胞外分泌型表達(dá)：離心,收集液相濃縮純化。胞內(nèi)表達(dá)：胞內(nèi)可溶性表達(dá)：離心,收集菌體細(xì)胞破碎離心，收集上清純化胞內(nèi)周質(zhì)表達(dá)：離心,收集菌體低濃度溶菌酶或滲透壓沖擊等溶解目標(biāo)物離心,收集上清液純化。不溶性包涵體：離心,收集菌體細(xì)胞破碎離心,收集沉淀包涵體洗滌目標(biāo)蛋白(dnbi)變性溶解復(fù)性純化。第55頁(yè)/共72頁(yè)第五十六頁(yè)，共72頁(yè)。蛋白蛋白產(chǎn)物占菌體總蛋白產(chǎn)物占菌體總蛋白外源蛋白的積累外源蛋白的積累人胰島素人胰島素50%50%形成包涵體形成包涵體 - -丙酰胺酶丙酰胺酶20%

24、20%在細(xì)胞間區(qū)在細(xì)胞間區(qū)- -人體干擾素人體干擾素25%25%形成包涵體形成包涵體凝乳酶原凝乳酶原形成包涵體形成包涵體牛生長(zhǎng)激素牛生長(zhǎng)激素30%30%形成包涵體形成包涵體 - -內(nèi)酰胺酶內(nèi)酰胺酶形成間區(qū)包涵體形成間區(qū)包涵體人胰島素原人胰島素原5%26%5%26%形成包涵體形成包涵體第56頁(yè)/共72頁(yè)第五十七頁(yè)，共72頁(yè)。包含(bohn)體的形成Z 包涵體：一種蛋白質(zhì)不溶性聚集體，包括目標(biāo)蛋白、菌體蛋白等。目標(biāo)蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)是正確的，但立體結(jié)構(gòu)是錯(cuò)誤的，所以沒(méi)有生物活性。Z 包涵體的形成：大腸桿菌中目標(biāo)產(chǎn)物的表達(dá)水平過(guò)高，超過(guò)正常代謝水平，過(guò)多表達(dá)產(chǎn)物聚集在細(xì)胞內(nèi)，形成不溶性的包涵體。Z 高表達(dá)

25、產(chǎn)生的積聚物在細(xì)胞內(nèi)部形成不溶物原因？Z 蛋白過(guò)量積聚，超過(guò)溶解度，導(dǎo)致沉淀(chndin)；Z 蛋白生成太快，分子間疏水基團(tuán)相互作用而聚集沉淀(chndin)；Z 蛋白生成太快，分子內(nèi)部二硫鍵的錯(cuò)誤連接導(dǎo)致沉淀(chndin)；Z 表達(dá)蛋白過(guò)多，與其結(jié)合/誘導(dǎo)組分不足，不能形成溶解狀態(tài)Z 蛋白質(zhì)自身不穩(wěn)定。第57頁(yè)/共72頁(yè)第五十八頁(yè)，共72頁(yè)。收集(shuj)菌體細(xì)胞細(xì)胞(xbo)破碎包涵體的洗滌目標(biāo)蛋白的變性溶解目標(biāo)蛋白的復(fù)性包含體的出現(xiàn)不僅增加了生物分離設(shè)計(jì)的難度，也為蛋白質(zhì)折疊機(jī)理研究提出了新的課題。欲獲得天然活性態(tài)的目標(biāo)產(chǎn)物，必需分離包含體后，溶解包含體并使其中的目標(biāo)蛋白恢復(fù)應(yīng)有的

26、天然活性。第58頁(yè)/共72頁(yè)第五十九頁(yè)，共72頁(yè)。機(jī)械破碎(高壓勻漿(yn jin)、高速珠磨）離心(lxn)提取包含體加變性劑溶解除變性劑復(fù)性第59頁(yè)/共72頁(yè)第六十頁(yè)，共72頁(yè)。路線(lxin)1 的特點(diǎn)第60頁(yè)/共72頁(yè)第六十一頁(yè)，共72頁(yè)。機(jī)械(jxi)破碎膜分離獲得(hud)包涵體加變性劑溶解包含體除變性劑復(fù)性第61頁(yè)/共72頁(yè)第六十二頁(yè)，共72頁(yè)。的滯留。的滯留。路線(lxin)2 的特點(diǎn)第62頁(yè)/共72頁(yè)第六十三頁(yè)，共72頁(yè)?；瘜W(xué)(huxu)破碎（加變性劑）離心除細(xì)胞(xbo)碎片除變性劑復(fù)性第63頁(yè)/共72頁(yè)第六十四頁(yè)，共72頁(yè)。 路線(lxin)三：第64頁(yè)/共72頁(yè)第六十五

27、頁(yè)，共72頁(yè)。1）包涵體的洗滌細(xì)胞破碎后，包含體呈顆粒狀，致密。洗滌的重要性：收集的沉淀中，除包涵體外，還包括許多雜質(zhì)，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，復(fù)性時(shí)會(huì)與目標(biāo)蛋白一起復(fù)性形成雜交分子而聚集，給后步純化帶來(lái)困難(kn nn)。洗滌劑：溫和的表面活性劑、蔗糖、低濃度的弱變性劑（如尿素）或脫氧膽酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂質(zhì)類(lèi)雜質(zhì)。洗滌劑濃度以溶解雜質(zhì)，不溶解包涵體中表達(dá)產(chǎn)物為原則。第65頁(yè)/共72頁(yè)第六十六頁(yè)，共72頁(yè)。 2）包涵體的變性溶解 包涵體中不溶性的目標(biāo)蛋白必須溶解到液相中，才能進(jìn)一步純化(chn hu)。一般水溶液很難將其溶解，只有采用蛋白質(zhì)變性才能使其形成可溶性的形式。 常用變性劑： 5-8 mol/L鹽酸胍和6-8 mol/L尿素, 作用：破壞離子間相互作用； 表面活性劑如1-2 SDS，作用：破壞蛋白質(zhì)肽鏈間的疏水相互作用。 PH9.0的堿溶液