高通量測(cè)序技術(shù)及其在腫瘤研究中的應(yīng)用

1、高通量測(cè)序技術(shù)及其在腫瘤研究中的應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)及其在腫瘤研究中的應(yīng)用匯報(bào)人：匯報(bào)人：Company Logo 目錄目錄 背景介紹背景介紹1 測(cè)序的測(cè)序的流程流程2對(duì)腫瘤研究的方法對(duì)腫瘤研究的方法3 總結(jié)總結(jié)4Company Logo 一、背景介紹一、背景介紹u高通量測(cè)序技術(shù)（High-throughput sequencing）又稱(chēng)“下一代”測(cè)序技術(shù)（“Next-generation” sequencing technology），以能一次并行對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定和一般讀長(zhǎng)較短等為標(biāo)志。u高通量測(cè)序技術(shù)是對(duì)傳統(tǒng)測(cè)序一次革命性的改變，一次對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序

2、列測(cè)定，因此在有些文獻(xiàn)中稱(chēng)其為下一代測(cè)序技術(shù)(next generation sequencing)足見(jiàn)其劃時(shí)代的改變，同時(shí)高通量測(cè)序使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能，所以又被稱(chēng)為深度測(cè)序(deepsequencing)。 Company Logo 第二代測(cè)序第二代測(cè)序第三代測(cè)序第三代測(cè)序第一代測(cè)序第一代測(cè)序 傳統(tǒng)的化學(xué)降解法、雙脫氧鏈終止法以及在它們的基礎(chǔ)上發(fā)展來(lái)的測(cè)序技術(shù)統(tǒng)稱(chēng)為第一代測(cè)序。它在分子生物學(xué)研究中發(fā)揮過(guò)重要的作用，如人類(lèi)基因組計(jì)劃 主要包括羅氏454公司的454測(cè)序技術(shù) 、Illumina公司的Solexa測(cè)序技術(shù)和ABI公司的SOLiD測(cè)序技術(shù) 。第二

3、代測(cè)序技術(shù)最顯著的特征是高通量，一次能對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)序 第三代DNA測(cè)序技術(shù)是以單分子測(cè)序?yàn)樘攸c(diǎn)，如生物科學(xué)公司的單分子測(cè)序儀，以及正在研制的太平洋生物科學(xué)公司的單分子實(shí)時(shí)DNA測(cè)序技術(shù)和牛津納米孔技術(shù)公司的納米孔單分子測(cè)序技術(shù)等20052005年年開(kāi)始開(kāi)始 20世紀(jì)80年代中期正在研發(fā)Company Logo 目前常說(shuō)的高通量測(cè)序是指用第二代測(cè)序技術(shù)來(lái)進(jìn)行測(cè)序，第三代測(cè)序技術(shù)還不是很成熟，有的剛剛出現(xiàn)，有的則正在研制 第二代主要的測(cè)序平臺(tái)第二代主要的測(cè)序平臺(tái)Company Logo 數(shù)據(jù)分析 樣品的制備 文庫(kù)的構(gòu)建二、測(cè)序流程二、測(cè)序流程 測(cè)序的流程測(cè)序的流程上機(jī)測(cè)序

4、 Description of the companys products Description of the companys business Description of the companys technology Description of the companys contents 1. 對(duì)測(cè)序后生成的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析 2. 普通的分析：去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)，進(jìn)行序列組裝，評(píng)估測(cè)序質(zhì)量等 3. 高級(jí)分析：對(duì)基因進(jìn)行注釋?zhuān)治霰磉_(dá)情況、構(gòu)建互做網(wǎng)絡(luò)等 1. 在第二代測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序，設(shè)定程序 1. DNA序列打斷、RNA序列要反轉(zhuǎn)錄為DNA序列再打斷（超聲破碎）200-300bp 2.

5、加接頭，電泳選擇片段大小 3. PCR擴(kuò)增，轉(zhuǎn)到Flowcell上 4. 文庫(kù)質(zhì)檢（QPCR) 1. 組織樣品的培養(yǎng)或病理樣品的收集 2. 樣品總DAN、RNA的提取 3. 質(zhì)檢（總量、純度、完整性、有沒(méi)有降解等）Company Logo 三、三、對(duì)腫瘤研究的方法DNA 1.實(shí)體腫瘤基因組學(xué)研究2.血液腫瘤基因組學(xué)研究3.表觀遺傳學(xué)研究4.免疫組學(xué)研究高通量測(cè)序在腫瘤高通量測(cè)序在腫瘤研究的應(yīng)用研究的應(yīng)用RNA1.實(shí)體腫瘤轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究2.血液腫瘤轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究3.Exosome研究腫瘤細(xì)胞通訊、擴(kuò)散機(jī)制Company Logo DNADNA方向方向1.實(shí)體腫瘤基因組學(xué)研究一.研究目的和意義 尋找適

6、用于腫瘤早期診斷、腫瘤分型、病程發(fā)展（惡化和轉(zhuǎn)移）和預(yù)后的基因組分子標(biāo)記，篩選藥物的靶標(biāo)。二.研究對(duì)象 實(shí)體腫瘤的鑒別，按照臨床病理分類(lèi)，例如：肺癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、宮頸癌、胰腺癌、膀胱癌、食道癌、腎癌等。三.測(cè)序方案 Exome capture seq（外顯組捕獲測(cè)序）描繪基因組外顯子區(qū)域的SNV（單核苷酸變異），Indel（插入缺失）、CNV（拷貝數(shù)變異），分析基因變異和癌癥的相關(guān)性。 Target capture seq（目標(biāo)捕獲測(cè)序）對(duì)一些功能富集的基因或研究人員感興趣的基因組的部分區(qū)域進(jìn)行捕獲，分析基因變異對(duì)癌癥的影響。例如：癌癥相關(guān)基因（508個(gè)）、免疫（883個(gè)）、凋

7、亡（1536個(gè)）、細(xì)胞周期（1005個(gè)）、p53通路（162個(gè)）等。 Whole genome seq （全基因組測(cè)序）對(duì)基因組上所有的基因進(jìn)行測(cè)序分析，找到大量的SNV、CNV、Indel、SV（結(jié)構(gòu)變異）等基因變異信息，更為全面的解析癌癥發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。四.案例解析1.外顯組測(cè)序鑒定體細(xì)胞突變2.外顯組測(cè)序分析拷貝數(shù)和基因融合3.全基因組重測(cè)序展示人類(lèi)首個(gè)癌基因組圖譜4.全基因組測(cè)序解析基因組拷貝數(shù)變異Company Logo DNADNA方向方向2.血液腫瘤基因組學(xué)研究一.研究目的和意義 尋找適用于白血病早期診斷、疾病分期或分級(jí)、預(yù)后的分子標(biāo)記，藥物篩選的靶標(biāo)，指導(dǎo)個(gè)體化用藥的分子依

8、據(jù)。二.研究對(duì)象 血液病類(lèi)型：骨髓增生異常綜合癥（MDS），多發(fā)性骨髓瘤，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，慢性淋巴細(xì)胞白血病，慢性髓細(xì)胞白血病，急性淋巴細(xì)胞白血病，急性髓細(xì)胞白血病（急性粒細(xì)胞白血?。?。三.測(cè)序方案 Exome capture seq（外顯組捕獲測(cè)序）描繪基因組外顯子區(qū)域的SNV（單核苷酸變異），Indel（插入缺失）、CNV（拷貝數(shù)變異），分析基因變異和癌癥的相關(guān)性。 Target capture seq（目標(biāo)捕獲測(cè)序）對(duì)一些功能富集的基因或研究人員感興趣的基因組的部分區(qū)域進(jìn)行捕獲，分析基因變異對(duì)癌癥的影響。例如：癌癥相關(guān)基因（508個(gè)）、免疫（883個(gè)）、凋亡（1536個(gè)）、

9、細(xì)胞周期（1005個(gè)）、p53通路（162個(gè)）等。 Whole genome seq （全基因組測(cè)序）對(duì)基因組上所有的基因進(jìn)行測(cè)序分析，找到大量的SNV、CNV、Indel、SV（結(jié)構(gòu)變異）等基因變異信息，更為全面的解析癌癥發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。四.案例解析1.對(duì)4個(gè)慢性淋巴細(xì)胞性白血?。–LL）進(jìn)行全基因組測(cè)序分析，在染色體13q14上有3位患者出現(xiàn)了基因組大片段的缺失。2.研究者選取22個(gè)FLT3-ITD突變陽(yáng)性患者及29個(gè)FLT3-ITD 陰性患者進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序研究，能夠檢測(cè)到FLT3不同位置的ITD，并在FLT3-ITD陰性患者基因組上發(fā)現(xiàn)了比較低頻的ITD，為白血病的分子診斷提供

10、了更為準(zhǔn)確的信息。Company Logo DNADNA方向方向3.表觀遺傳學(xué)研究一.研究目的和意義 DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)研究的重點(diǎn)，是基因調(diào)控的手段之一，在維持細(xì)胞正常功能、傳遞基因組印記、胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生等方面起著至關(guān)重要的作用。檢測(cè)表觀遺傳學(xué)變異尤其是基因組的甲基化，探討甲基化對(duì)于生物學(xué)功能的影響，并篩選可應(yīng)用作為疾病早期診斷、分級(jí)和分型的分子標(biāo)記。二.研究對(duì)象 研究對(duì)象：各類(lèi)腫瘤、發(fā)育、干細(xì)胞分化的不同階段。三.測(cè)序方案 RRBS（Reduced Representation Bisulfite Sequencing）基于Msp|酶切消化和bisulfite處理的高性?xún)r(jià)比方法，可

11、對(duì)基因組promoter區(qū)及CpG島區(qū)域的DNA甲基化狀態(tài)進(jìn)行樣品之間的比較分析。 MBD-Seq（Methylated DNA Binding Domain Sequencing）由于在哺乳動(dòng)物中甲基化一般發(fā)生在CpG的胞嘧啶5位碳原子上，所以可通過(guò)特異性結(jié)合甲基化DNA的蛋白MBD2b富集高甲基化的DNA片段，并結(jié)合第二代高通量測(cè)序，對(duì)富集到的DNA片段進(jìn)行測(cè)序，從而檢測(cè)全基因組范圍內(nèi)的甲基化位點(diǎn)。 MeDIP-Seq（Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing ）通過(guò)使用5 -甲基胞嘧啶抗體富集高甲基化的DNA片段，然后將富集后的DNA進(jìn)行

12、高通量測(cè)序。 BS（Bisulfite Sequsencing）Bisulfite處理能夠?qū)⒒蚪M中未甲基化的C堿基與甲基化的C堿基區(qū)分開(kāi)來(lái)，因此成為表觀遺傳學(xué)研究的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法。將Bisulfite處理與高通量測(cè)序技術(shù)的結(jié)合的Bisulfite Sequencing能夠繪制單堿基分辨率的DNA甲基化圖譜，可用于研究特定DNA區(qū)域甲基化與特定表型之間的關(guān)聯(lián)。Company Logo DNADNA方向方向4.免疫組學(xué)研究一.研究的背景 T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）是T細(xì)胞表面特異性識(shí)別抗原和介導(dǎo)免疫應(yīng)答的分子，是人類(lèi)基因組中多態(tài)性最高的區(qū)域之一，決定著人的免疫系統(tǒng)如何適應(yīng)

13、環(huán)境的變化。T細(xì)胞受體庫(kù)的多樣性（包括基因重組以及選擇性表達(dá)）直接反映了機(jī)體免疫應(yīng)答的狀態(tài)。二.適用范圍 腫瘤免疫、自身免疫性疾病、器官移植免疫監(jiān)測(cè)、疫苗注射免監(jiān)測(cè)三.案例解析目的 ： 目的：干細(xì)胞移植（HSCT）后，通過(guò)對(duì)TCR（T細(xì)胞受體）的CDR3（VDJ基因重組區(qū)域）區(qū)域進(jìn)行重組分析獲得移植后病人的CD4+和CD8+T細(xì)胞的多樣性，從而檢測(cè)移植受體免疫重建的結(jié)果。通過(guò)比較不同來(lái)源的干細(xì)胞（造血干細(xì)胞、去除T細(xì)胞的造血干細(xì)胞、臍血干細(xì)胞）移植后的TCR的多樣性進(jìn)行移植效果的判斷，并闡述TCR多樣性與細(xì)菌感染的關(guān)系。 方法：選取干細(xì)胞移植的病人作為研究對(duì)象，時(shí)間點(diǎn)為移植后6個(gè)月和12個(gè)月，

14、以健康人作為對(duì)照。從8ml外周血中分理CD4+和CD8+T細(xì)胞處利用高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析檢測(cè)TCR的CDR3區(qū)域重組的多樣性。結(jié)果：1.對(duì)去除T細(xì)胞（TCD）的干細(xì)胞移植病人的測(cè)序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)移植病人的TCR的多樣性比健康人要低。 2. 對(duì)不同來(lái)源的干細(xì)胞進(jìn)行TCR多樣性分析，發(fā)現(xiàn)臍血干細(xì)胞移植后，TCR的多樣性最高，且CD4+來(lái)源的TCR比CD8+來(lái)源的TCR多樣性高。 3.年齡和供體對(duì)干細(xì)胞移植后TCR的多樣性影響不大，但是出現(xiàn)急性移植物抗宿主病及全身類(lèi)固醇治療的病人有著較高的TCR多樣性，相反，出現(xiàn)巨細(xì)胞病毒（CMV）皰疹病毒（EBV）感染的病人TCR多樣性比較低。Compa

15、ny Logo RNARNA方向方向1.實(shí)體腫瘤轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究一.研究目的和意義 尋找適用于腫瘤早期診斷、腫瘤分型（在分子水平對(duì)疾病能夠準(zhǔn)確分型）、病程發(fā)展（惡化和轉(zhuǎn)移）和預(yù)后的轉(zhuǎn)錄組分子標(biāo)記，篩選藥物的靶標(biāo)，用藥的分子依據(jù)。二.研究對(duì)象 實(shí)體腫瘤的鑒別，按照臨床病理分類(lèi)，例如：肺癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、宮頸癌、胰腺癌、膀胱癌、食管癌、鼻咽癌、腎癌、淋巴瘤等。三.測(cè)序方案 RNA-seq（PolyA法mRNA測(cè)序）發(fā)現(xiàn)癌癥發(fā)生或轉(zhuǎn)移相關(guān)的mRNA的變異（幾乎所有基因的表達(dá)量差異、基因融合和選擇性剪切等事件）。 SmallRNA-seq（小RNA測(cè)序）分析miRNA的表達(dá)量差異，預(yù)測(cè)miR

16、NA作用的靶基因，篩選可用于疾病診斷和預(yù)后的分子標(biāo)記。 lncRNA-seq（長(zhǎng)鏈非編碼RNA測(cè)序）通過(guò)PolyA尾抓取或核糖體RNA去除的方法，富集mRNA和lncRNA，可以發(fā)現(xiàn)樣品中的新lncRNA，并同時(shí)檢測(cè)樣本中的mRNA和lncRNA，進(jìn)行共表達(dá)分析，以mRNA的功能富集分析挖掘lncRNA的功能和潛在作用機(jī)制，探討lncRNA和疾病的關(guān)系。四.案例解析Company Logo RNARNA方向方向2.血液腫瘤轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究一.研究目的和意義 尋找適用于白血病早期診斷、疾病分期或分級(jí)、預(yù)后的分子標(biāo)記，藥物篩選的靶標(biāo)，指導(dǎo)個(gè)體化用藥的分子依據(jù)。二.研究對(duì)象 血液病類(lèi)型：骨髓增生異常綜合

17、癥（MDS），多發(fā)性骨髓瘤，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，慢性淋巴細(xì)胞白血病，慢性髓細(xì)胞白血病，急性淋巴細(xì)胞白血病，急性髓細(xì)胞白血病（急性粒細(xì)胞白血?。?。三.測(cè)序方案 RNA-seq（PolyA法mRNA測(cè)序）發(fā)現(xiàn)癌癥發(fā)生或轉(zhuǎn)移相關(guān)的mRNA的變異（幾乎所有基因的表達(dá)量差異、基因融合和選擇性剪切等事件）。 SmallRNA-seq（小RNA測(cè)序）分析miRNA的表達(dá)量差異，預(yù)測(cè)miRNA作用的靶基因，篩選可用于疾病診斷和預(yù)后的分子標(biāo)記。 lncRNA-seq（長(zhǎng)鏈非編碼RNA測(cè)序）通過(guò)PolyA尾抓取或核糖體RNA去除的方法，富集mRNA和lncRNA，可以發(fā)現(xiàn)樣品中的新lncRNA，并同時(shí)檢

18、測(cè)樣本中的mRNA和lncRNA，進(jìn)行共表達(dá)分析，以mRNA的功能富集分析挖掘lncRNA的功能和潛在作用機(jī)制，探討lncRNA和疾病的關(guān)系。四.案例解析Company Logo RNARNA方向方向3.Exosome研究腫瘤細(xì)胞通訊、擴(kuò)散機(jī)制一.研究背景 Exosome來(lái)源于晚期核內(nèi)體(也稱(chēng)為多囊泡體)的囊泡，是由活細(xì)胞分泌的而來(lái)，是一類(lèi)大小介于30-100nm的含有RNA和蛋白質(zhì)的微囊，幾乎所有類(lèi)型的細(xì)胞都能分泌，廣泛存在于各種體液中。Exosome參與調(diào)控重要的細(xì)胞生理活動(dòng)，在免疫應(yīng)答、凋亡、血管生成、炎癥反應(yīng)、凝結(jié)過(guò)程中的作用均有報(bào)道，可以成為多種疾病的早期診斷標(biāo)記物，也能作為靶向藥物的載體進(jìn)行疾病治療。 2013年10月7號(hào)，蘭迪.謝克曼等三位科學(xué)家獲得2013年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，他們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中囊泡像船隊(duì)一樣運(yùn)送貨物至精準(zhǔn)目的地的作用方式，這對(duì)大腦溝通方式、激素釋放和免疫系統(tǒng)至關(guān)重要。二.Exosome成分 蛋白質(zhì)：如微管蛋白、肌動(dòng)蛋白、肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白、熱休克蛋白、三聚體蛋白