葡枝根霉木聚糖酶酶學性質(zhì)的初步研究本科畢業(yè)設計(論文)開題報告

1、.安徽工程大學畢業(yè)設計（論文）畢業(yè)設計（論文）材料之二（2）本科畢業(yè)設計(論文)開題報告題目：葡枝根霉木聚糖酶酶學性質(zhì)的初步研究 課 題 類 型： 設計 實驗研究 論文 學 生 姓 名： 鄒軍 學 號： 3112106128 專 業(yè) 班 級： 生物工程2111學 院： 機電學院指 導 教 師： 張慶慶（教授）開 題 時 間： 2015年3月 日2015年 3月 日開題報告內(nèi)容與要求一、本課題的研究意義、研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢（文獻綜述）二、研究方案及工作計劃（含工作重點與難點及擬采用的途徑）三、閱讀的主要參考文獻（不少于10篇，期刊類文獻不少于7篇，應有一定數(shù)量的外文文獻，至少附一篇引用的外文文獻

2、（3個頁面以上）及其譯文）四、指導教師意見（簽名）2015年3月 日第1章 研究內(nèi)容及研究意義1.1 研究意義木聚糖（xylan）存在于各種陸生植物的幾乎所有部位，是植物細胞壁的主要成分之一，占植物碳水化合物總量的三分之一，在自然界中含量僅次于纖維素。木聚糖是一種雜合多聚分子，主鏈由多個吡喃木糖基通過-1，4-糖苷鍵相連，側鏈上連著多種不同的取代基：O-乙酞基、4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸殘基、L-阿拉伯糖殘基等。這些側鏈與植物細胞中其他幾種結構性多糖（如木質(zhì)素、纖維素、果膠、葡聚糖等）以共價或非共價鍵連接，組成細胞重要的結構-細胞壁。木聚糖主要存在于次生細胞壁中，處于木質(zhì)素及其他多聚糖之間，

3、起著連接作用。也正是由于這些側鏈的不同，使得木聚糖的結構變化范圍很大。自然界中的木聚糖多為異聚多糖，主鏈和側鏈糖基上有多種取代基團，主要是乙?；⑵咸烟侨；桶⒗酋；?，可進一步與香豆酸、阿魏酸等酚酸相連，使得木聚糖以共價鍵與木質(zhì)素相連。木聚糖同其他碳水化合物的結合除通過化學鍵連接之外，還可能通過其他相互作用如氫鍵等相互連接。同型木聚多糖分布很少，僅見于茅草、煙草和某些種子的外殼中。一般將木聚糖分為硬木（針葉）木聚糖和軟木（闊葉）木聚糖兩種。硬木木聚糖由O-乙酰-4-O-甲基葡萄糖醛縣木糖聚合而成，含70個以上的吡喃型木糖殘基，以-1，4-葡萄糖苷鍵相連，聚合度（degree of pol

4、ymerization,DP;多聚物中所含單體數(shù)）為150-200.每隔10個木糖殘基就有1個4-O-甲基葡萄糖酰酸基團位于C2位。硬木木聚糖高度乙?；?mol木糖殘基就含有1mol的乙?；阴；鶊F的存在與木聚糖的部分溶解性有關。通常情況下，乙酰化主要發(fā)生在木糖殘基的C3位上，在C2位取代的情況很少，也有兩個位置均被乙?；?，三者之間的比例為4:2:1:2:2:1或3：3：1。在提取木聚糖的過程中，乙酰基團能夠在C2位和C3位之間轉移，在堿性抽提條件下很容易被除去。木聚糖是半纖維素（地球上位居第二的可再生資源）的一種，主要存在于植物體內(nèi)，將木質(zhì)素和纖維素連接起來起到了穩(wěn)定植物組織結構的重

5、要作用!同時，木聚糖也是除纖維素以外的自然界中最為豐富的多糖，結構十分復雜，單體為ZU木糖，主鏈和側鏈上都連接有大小不同的取代基團!在化石能源越來越緊缺"環(huán)境污染越來越嚴重的。當代，科研工作者們廣泛關注可再生資源的合理利用，因此，木聚糖的充分利用吸引了很多眼球，但因為木聚糖化學結構的復雜性，要想完全將木聚糖降解必須借助于一套復雜的,具有不同功能和作用方式的水解酶系!這一套負載的木聚糖降解酶系主要有ß-1.4-內(nèi)切木聚糖酶,ß-1.4-木 糖苷酶,麹呋喃阿拉伯糖苷酶,葡萄糖醛酸酶和乙酰木聚糖酯酶等，研究表明這些完整的酶系在微生物中廣泛存在ß-1.4-內(nèi)切木

6、聚糖酶是木聚糖水解過程中最要的一種酶類，其特異性作用于木聚糖主鏈上的ß-1.4-D-木糖苷鍵的糖苷鍵，將木聚糖徹底水解為木糖,木二糖及木二糖以上的木寡糖。第2章 研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢2.1匍枝根霉概述匍枝根霉（拉丁名：Rhizopus stolonifer）亦稱黑面包霉，是一種常見的霉菌，由土壤或空氣中都很容易分離得到，是接合菌綱、毛霉目、毛霉科、匍枝根霉屬。它即是根霉屬中具代表性的種類。這屬真菌的特征是具有細長菌絲，不分隔，呈多核狀態(tài)。無性生殖藉形成孢子繁殖，有性生殖則形成厚壁之接合孢子。分布很廣，全世界均可見，長在各種有機物上，除面包、饅頭、米飯等淀粉質(zhì)外，也常長在甜熟的水果上。最

7、常見的是匍枝根霉(R. stolonifer (Ehrenb.ex Fr.)Vuill)，又稱黑根霉、面包霉。 多生于面包、饅頭和富含淀粉質(zhì)的食物上，使食物腐爛變質(zhì)。黑根霉由分枝、不具橫隔的白色菌絲組成。在基質(zhì)表面橫生的菌絲叫匍匐菌絲，匍匐菌絲膨大的地方向下生出假根，伸入基質(zhì)中以吸取營養(yǎng)；向上生出數(shù)條直立的孢子囊梗，其頂端膨大形成孢子囊。孢子囊內(nèi)形成具多核的孢囊孢子。孢子囊成熟后破裂，黑色的孢子散出落于基質(zhì)上，在適宜的條件下，即可萌發(fā)成新的菌絲體。本菌種之生長適溫可由2030，而以2530為最佳。菌叢于25下，在PDA（馬鈴薯培養(yǎng)基）上生長快速，3天即長滿整個培養(yǎng)皿，起先白色，后變灰白色，一個

8、月以后則呈黑褐色。反面起先白色，后變灰白色。匍匐莖起先白色，后變褐色。假根分枝多，發(fā)育良好。孢子囊柄直立，不分枝，起初白色，后變褐色，1-5枝叢生成一簇，長在假根對側，9002700微米（m）長，直徑2232微米，無分隔，細胞壁平滑。孢子囊圓形，直徑173-235微米，未成熟時白色，成熟后黑色，孢子囊壁平滑，成熟時溶解。中軸圓形，直徑153-163微米，當孢子散出后，中軸多數(shù)下陷成半圓形。孢子多數(shù)橄欖型或有稜角，表面有溝紋，灰色，7.5-9.6×4.3-7.5微米。雌雄異株，其接合孢子，為黑色而有厚壁，亞球形，直徑140-180微米，成熟時黑色，上有疣狀突起。木聚糖水解酶系(xyla

9、nolyticenzymesystems)是一類降解木聚糖的酶系，包括-1,4-內(nèi)切木聚糖酶、-木糖苷酶、-L-阿拉伯糖苷酶、-D-葡糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酶和酚酸酯酶，可降解自然界中大量存在的木聚糖類半纖維素。在木聚糖水解酶系中，-1,4-內(nèi)切木聚糖酶是最關鍵的水解酶，它通過水解木聚糖分子的-1,4-糖苷鍵，將木聚糖水解為小寡糖和木二糖等低聚木糖，以及少量的木糖和阿拉伯糖。-木糖苷酶通過水解低聚木糖的末端來催化釋放木糖殘基。另外，參與徹底降解木聚糖的還有-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、-葡萄糖醛酸苷酶、乙酰木聚糖酯酶，以及能降解木聚糖中阿拉伯糖側鏈殘基與酚酸(如阿魏酸或香豆酸)形成的酯鍵的酚酸酯酶等

10、側鏈水解酶，它們作用于木糖與側鏈取代基之問的糖苷鍵，協(xié)同主鏈水解酶的作用，最終將木聚糖轉化為它的組成單糖 。2.2 研究現(xiàn)狀飼料工業(yè)是較早應用木聚糖酶的領域。小麥、大麥、黑麥、燕麥等麥類飼料中含有大量的木聚糖,木聚糖具有較強的持水性、小分子吸附活性和表面活性,造成麥類基礎飼料對單胃或無胃動物具有強烈的抗營養(yǎng)作用。木聚糖酶作為飼料添加劑使用,可以有效解除木聚糖的抗營養(yǎng)作用。  木聚糖酶可以破碎植物細胞壁,提高養(yǎng)分利用率。飼料中添加木聚糖酶可以把聚合度較高的木聚糖降解為聚合度較低的小分子片段,破壞細胞壁的結構,將細胞壁束縛的營養(yǎng)物質(zhì)釋放出來,和動物消化道內(nèi)的消化酶充分

11、接觸,從而提高各種養(yǎng)分的消化率。木聚糖酶可以降低食糜粘度,提高表觀代謝能。澳大利亞和歐美的動物營養(yǎng)學家指出,木聚糖酶的主要作用機制是降低消化道食糜粘度。木聚糖在降解時需要多種酶協(xié)同作用才能完成，主要包括以下幾種類型的酶：1) 內(nèi)切-1，4-D-木聚糖酶（endo-1，4-D-xylanase）EC 3.2.1.8，又稱木聚糖酶，降解木聚糖后生成木二糖和木三糖等寡糖，主要水解產(chǎn)物為低聚木糖和少量木糖。內(nèi)切-1，4-D-木聚糖酶作為木聚糖酶系中最重要的酶，主要用來降解木聚糖主鏈糖苷鍵，它也是目前木聚糖酶研究的重點；2) -D-木糖苷酶（-D-xylosidases）EC 3.2.1.37，是一種外

12、切酶，它主要對寡聚木糖的還原端起作用，降解并生成木糖；3) -L-呋喃阿拉伯糖苷酶-(L-arabinofuranosidases)，分為兩種類型，一種是外切型的-L-呋喃阿拉伯糖苷酶EC3.2.1.55，作用于-硝基酚-呋喃型阿拉伯糖苷或者分支阿拉伯聚糖；另一種是內(nèi)切-1,5-L-阿拉伯聚糖酶EC 3.2.1.99，只對阿拉伯聚糖側鏈有活性；4) -D-葡萄糖醛酸苷酶(-D-glucuronidases)EC3.2.239，主要作用于4-O-甲基葡萄糖醛酸與木糖之間的-1,2-糖苷鍵，在木聚糖降解過程中與木聚糖酶相互促進，促進低聚木糖的產(chǎn)生；5) 乙酰木聚糖酯酶(acetylxylan es

13、terases)EC 3.2.72，作用于木糖殘基的C-2和C-3位上的乙?；?) 酚酸酯酶(phenol aid esterases)主要包括阿魏酸酯酶(furulic acid esterases )EC 3.2.73和香豆酸酯酶(p-coumaric acid esterases) EC 3.2.-，前者可切除阿魏酸與阿拉伯糖殘基之間的酯鍵，后者則主要作用于香豆酸和阿拉伯糖殘基之間的酯鍵。 通常所說的木聚糖酶即內(nèi)切-1，4-D-木聚糖酶，它主要負責木聚糖主鏈骨架的降解，是木聚糖降解酶系中最關鍵的酶，也是當前木聚糖酶研究的重點。414近來，國內(nèi)外學者對木聚糖酶活力測定的主要研究為：1)

14、在傳統(tǒng)方法的基礎上，對木聚糖酶酶活測定方法進行改進，并在一定的條件下對各種方法進行比較；2) 研究木聚糖酶活測定條件；3) 研究測定木聚糖酶單一酶活力和總酶活力；4) 研究影響木聚糖酶活測定的因素及空白試驗對木聚糖酶活測定的影響；5) 研究測定不同酶源的木聚糖酶活力；通過基因工程和蛋白質(zhì)工程改良木聚糖酶的性質(zhì), 研制出符合不同應用領域要求的木聚糖酶產(chǎn)品。影響木聚糖酶活性因素的研究 王丹丹等10利用正交實驗法研究了Pichia pastoris G12（畢赤酵母）在搖瓶發(fā)酵條件下產(chǎn)木聚糖的表達規(guī)律，發(fā)現(xiàn)pH、接種時間、甲醇體積分數(shù)、誘導時間等因素對酶活力具有顯著的影響。研究表明在pH5.5時酶活

15、力隨pH的增大而增大且在pH=5.5時達到最大值，pH超過5.5時酶活力開始降低并趨于穩(wěn)定。將菌種接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中觀察時間對酶活的影響，發(fā)現(xiàn)酶活力從11h起開始升高并在19h時達到最高，之后又下降。在發(fā)酵培養(yǎng)基接種前分別按一定比例加入甲醇觀察甲醇體積分數(shù)的大小對酶活力的影響，得出在甲醇分數(shù)低于1.50%時酶活力隨體積分數(shù)增加而增加，并在1.50%時達到最高值，高于1.50%時酶活力逐漸下降。王丹丹等人還研究了甲醇誘導時間對產(chǎn)酶活力的影響得出在誘導前期酶活力呈現(xiàn)出對數(shù)上升趨勢，在120h后開始趨于平緩，在168h達到最高酶活力水平，之后開始出現(xiàn)下降的趨勢。2.3 發(fā)展趨勢 中國木聚糖酶

16、0;行業(yè)發(fā)展趨勢分析與預測報告依托多年對木聚糖酶 行業(yè)的研究，結合木聚糖酶 行業(yè)歷年供需關系變化規(guī)律，立足國內(nèi)市場，兼顧全球市場環(huán)境，對木聚糖酶 行業(yè)內(nèi)企業(yè)群體進行了深入的調(diào)查與研究。同時，中國木聚糖酶 行業(yè)發(fā)展趨勢分析與預測報告也針對木聚糖酶 行業(yè)及其上下游行業(yè)的特點，從不同角度切入行業(yè)，為木聚糖酶 行業(yè)企業(yè)提供了強大的數(shù)據(jù)支持與專業(yè)級的市場導向。并為企業(yè)制定發(fā)展戰(zhàn)略、進行投資決策和企業(yè)經(jīng)營管理提供權威、充分、可靠的決策參考。中國木聚糖酶 行業(yè)發(fā)展趨勢分析與預測報告?zhèn)戎毓俜浇y(tǒng)計數(shù)據(jù)，采用定量及定性的科學研究方法撰寫而成。因

17、此，在對木聚糖酶活力及性質(zhì)進行描述時，必須清楚注明測定條件中所有參數(shù)，不同研究所獲得的結果進行比較時，應避免與采用不同底物、不同條件或不同測定方法所得的結果進行比較。同時，還應在測定過程中對所用方法和測定條件進行嚴格限定，力求準確、全面地反映木聚糖酶的性質(zhì)及作用機制。 第3章 研究方案及工作計劃3.1. 試驗主要內(nèi)容 3.1.1 培養(yǎng)基的配置及各種試劑的配置配制PDA固體培養(yǎng)基，以及種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，并采用高壓蒸汽滅菌鍋進行滅菌（121，20min）。 3.1.2葡枝根霉的培養(yǎng)及其形態(tài)的觀察（1） 將葡枝根霉菌絲接種在液體培養(yǎng)基，待長出菌種后，取菌絲在顯微鏡下觀察葡枝根霉的形狀；（2）

18、涂平板觀察菌落形態(tài)；（3） 接種斜面作為保藏用。 3.1.3 木聚糖酶活力的測定51） 配置DNS試劑及木糖標準曲線的繪制；2） 取匍枝根霉發(fā)酵培養(yǎng)后的固態(tài)培養(yǎng)物制備粗酶液；3） 采用DNS法測定木聚糖酶活力；4） 酶活力定義：在規(guī)定條件下，每分鐘分解木聚糖產(chǎn)生1umol木糖所需要的木聚糖酶量為1個單位酶活力（U）。3.2. 實驗重點與難點 （1）葡枝根霉極易染菌；防止染菌是本實驗的重點難點問題，在接種和倒平板的過程中要注意無菌操作，液體培養(yǎng)要講瓶口扎緊，接種后放到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（2） 配置適宜葡枝根霉發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的最佳培養(yǎng)基組成，并對條件進行優(yōu)化，并測定其酶活；3.3. 實驗結果 3.3

19、.1 做好實驗前期的準備工作（1）實驗之前查找、閱讀文獻，做好相關準備工作（2）培養(yǎng)基的配制及滅菌，實驗相關儀器及試劑的準備 3.3.2 實驗成果（1）實驗過程中相關實驗記錄及實驗之后的數(shù)據(jù)處理。（2）實驗之后，將相關數(shù)據(jù)轉化成圖表的形式記錄。 3.3.3 實驗總結（1）通過實驗，了解、熟悉培養(yǎng)基的配制及滅菌的流程。（2）學習實驗室中各種儀器設備的使用，達到熟練使用的目的。（3）熟練掌握微生物的接種、培養(yǎng)，以及通過染色觀察其形態(tài)（4）學習并掌握微葡枝根霉活性的最佳測定。 3.4 工作計劃第01周3月2日-3月8日查文獻并閱讀文獻，英文翻譯及準備工作第02-03周3月9日-3月22日翻譯外文文獻

20、及準備工作，熟悉實驗主要內(nèi)容。繪制木糖標準曲線第04周3月23日-3月29日完成開題報告第05周3月30日-4月5日完成實驗初期的準備工作，熟悉微生物培養(yǎng)的各個操作第06-07周4月6日-4月20日測定相應酶活曲線第08-09周4月21日-5月5日確定葡枝根霉木聚糖酶活最佳條件第10-11周5月6日-5月20日對酶活的酶促反應時間、酶促反應溫度、pH三個影響因素進行了研究第12-13周5月21日-5月25日底物酶活的酶促反應時間、酶促反應溫度、pH三個影響因素進行了研究第14-15周5月26日-6月08日整理數(shù)據(jù)，得出結論、查缺補漏，及撰寫畢業(yè)論文第16-17周6月09日-6月22日提交論文初稿，準備答辯主要參考文獻1方洛云，鄒曉庭，許梓榮木聚糖酶基岡的分子生物學與基因工程J中國飼料，2002, (7): 11-14.2 李雄彪，張金忠半纖維素的化學結構和生理功能植物學通報，1994, 1l(1): 27-33.3 木聚糖酶 1234 基因序列分析及表達載體構建。常桂英，王俊玲，徐亞維，楊 闖，劉盼想( 吉林農(nóng)業(yè)科技學院生物工程學院，吉林大學分子酶學工程教育部重點實驗室，吉林長春) 4 謝建華，李小明，羅文華。高溫酸性木聚糖酶的儲存穩(wěn)定性研。東莞泛