基因組學知識點整理

1、AC/DS轉座 Ac/Ds系統(tǒng)是玉米轉座子系統(tǒng)之一。Ac是自主控制因子（autonomous element），或稱激活因子，長4563bp，含有一個轉座酶基因和一段與轉座酶的近末端重復區(qū)域鄰接的、短的不完整的反向重復序列。Ac缺失后能形成不同形式的Ds。Ds-a和Ac相似，只缺失了部分轉座酶基因。這點可解釋Ds自身不能發(fā)生轉座的原因。Ds-b的缺失片段較長，僅保留了轉座酶基因的一個小片段。Ds-c僅剩有Ac因子中反向重復序列和與轉座酶結合的近末端重復區(qū)域。這些區(qū)域和片段都是Ds-c在Ac指導下轉座所必須的靶位點。Ac能自主轉座，并形成不穩(wěn)定的基因突變，但不使染色體斷裂，它能使Ds因子活化、轉

2、座，并通過Ds控制結構基因的表達，有劑量效應，當Ac劑量增加時，相關的遺傳效應延遲發(fā)生。Ds是非自主因子（nonautonomous element），又稱解離因子，是與Ac屬于同一家族的控制因子，Ds是由Ac因子中間序列的缺失而形成的，從而失去轉座酶功能。當Ac因子存在時，能活化Ds，使其在基因組內(nèi)轉座或插入結構基因之內(nèi)，導致基因失活或改變結構基因的表達水平，也可使染色體特定部位斷裂，引起缺失或重組。玉米Ds的存在能抑制鄰近基因的表達。Ac-Ds的轉座通過非復制型機制發(fā)生，且總是轉移到鄰近的位置，當插入新靶位點后，原來位置上即失去Ds因子，結果可造成染色體斷裂或重排，由此可引起顯性基因丟失，

3、隱性基因表達。（小結）Ac是自主控制因子，Ds是非自主因子，Ac因子能自主轉座并形成不穩(wěn)定的基因突變，但不使染色體斷裂，它能使Ds因子活化、轉座，并通過Ds因子控制結構基因表達。Ac因子中間缺失后能形成不同形式的Ds因子，無轉座酶功能。Ac因子能活化Ds因子，使其在基因組內(nèi)轉座或插入結構基因內(nèi)導致基因失活或改變基因的表達水平，也可使染色體特定部位斷裂，引起缺失或重組。Ds因子必須由Ac提供轉座酶才能轉座，Ds因子或多或少缺失Ac因子中的部分片段。所有的Ds因子要實現(xiàn)轉座，必須由一對IR和與其比鄰的一段短的可被Ac轉座酶識別的序列。Ac-Ds的轉座通過非復制型機制發(fā)生，且總是轉移到鄰近的位置當插

4、入新靶位點后，原來位置上即失去Ds因子，結果可造成染色體斷裂或重排，由此可引起顯性基因丟失，隱性基因表達。非編碼RNA（siRNA和miRNA的產(chǎn)生過程、相同點、不同點）小的干涉RNA（small interfering RNA; siRNA） 和微小RNA（microRNA；miRNA）是兩種序列特異性地轉錄后基因表達的調(diào)節(jié)因子，是小RNA的最主要組成部分，它們的相關性密切，既具有相似性，又具有差異性。對小RNA的深入研究將使我們更深一步了解生命的奧秘。本文主要介紹這兩種小RNA分子及其作用機理。siRNA介紹 RNA干涉（RNAi）在實驗室中是一種強大的實驗工具，通過這種方式，利用具有同源

5、性的雙鏈RNA（dsRNA）誘導序列特異的目標基因的沉默，迅速阻斷基因活性。小的干涉RNA（siRNA）是在RNA干涉過程中人工體外合成的小片段RNA，由約20個堿基對組成，包括5個磷酸鹽，2個核苷和3個懸臂。SiRNA在RNA沉默通道中起中心作用，是對特定信使RNA（mRNA）進行降解的指導要素。1999年， Hamilton等在植物基因沉默的研究中首次發(fā)現(xiàn)2125nt 的dsRNA 的出現(xiàn)對轉基因?qū)е禄虺聊种匾谵D基因正確表達的植株中則未出現(xiàn)。隨后，Hammond 等進行的細胞提取物核酸酶活性實驗證明了小分子RNA在RNAi 中的作用，這些小分子RNA就是由dsRNA形成的siR

6、NA。siRNA 的3´-末端2-nt 的突出對靶點識別的特異性起一定的作用，可將其限定在第一個堿基對相鄰的不成對堿基的位置。兩個研究小組以數(shù)以千計的人類和老鼠基因為目標創(chuàng)建RNAi庫的進展，科學進展已清晰地表明：在哺乳動物中利用小的干涉RNA和短發(fā)夾RNA（short hairpin RNAs，shRNA）來進行RNA干涉以使基因沉默已經(jīng)成為強大而有力的生物工具。例如，在基因操作較困難的神經(jīng)元中，也有成功進行RNAi的報道。Krichevsky等將化學合成的21nt siRNA通過陽離子脂類轉染試劑導入原代培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)元，顯著抑制內(nèi)源靶基因和轉染基因的表達。抑制神經(jīng)元NO合成酶表

7、達能有效降低疼痛，在Korneev的實驗中設計的雙鏈RNA成功地抑制了中樞神經(jīng)系統(tǒng)NO合成酶表達，獲得RNA干擾的成功。RNAi能在極低濃度（nmol范圍）siRNA存在下顯示出特殊有效性。miRNA介紹miRNA的研究起始于時序調(diào)控小RNA（stRNAs）。1993年，Lee等在秀麗新小桿線蟲（Caenorhabditis elegan）中發(fā)現(xiàn)了第一個可時序調(diào)控胚胎后期發(fā)育的基因lin-4，2002年，Reinhart等又在線蟲C.elegan中發(fā)現(xiàn)第二個異時性開關基因let-7，2001年10月science報道了三個實驗室從線蟲、果蠅和人體克隆的幾十個類似C.elegan的lin-4的小

8、RNA基因，稱為microRNA。隨后多個研究小組在包括人類、果蠅、植物等多種生物物種中鑒別出數(shù)百個miRNAs。對一部分miRNAs的研究分析提示：miRNAs參與生命過程中一系列的重要進程，包括發(fā)育進程，造血過程，器官形成，凋亡，細胞增殖，甚至是腫瘤發(fā)生(Kim, 2005)。miRNAs是一種2125nt長的單鏈小分子RNA，其結構特征如下：廣泛存在于真核生物中，是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA，它本身不具有開放閱讀框（ORF）；成熟的miRNA，5端有一個磷酸基團，3端為羥基，是由具有發(fā)夾結構的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（雙鏈）但

9、是和siRNA密切相關。成熟的miRNA 5端的磷酸基團和3´端羥基則是它與相同長度的功能RNA降解片段的區(qū)分標志。miRNA獨有的特征是其5端第一個堿基對U有強烈的傾向性，而對G卻有抗性，但第二到第四個堿基缺乏U，一般來講，除第四個堿基外，其他位置堿基通常都缺乏C。MiRNAs具有高度的保守性、時序性和組織特異性。miRNAs的表達方式各不相同。線蟲和果蠅當中的部分miRNA在各個發(fā)育階段都有表達而且不分組織和細胞特性，而其他的miRNA則表現(xiàn)出更加嚴謹?shù)臅r空表達模式（a more restricted spatial and temporal expression pattern

10、）只有在特定的時間、組織才會表達。細胞特異性或組織特異性是miRNA的表達的主要特點，又如擬南芥中的miR-171僅在其花序中高水平表達，在某些組織低水平表達，在莖、葉等組織中卻無任何表達的跡象；20-24h的果蠅胚胎提取物中可發(fā)現(xiàn)miR-12，卻找不到miR3-miR6，在成年果蠅中表達的miR-1和let-7也無法在果蠅胚胎中表達，這同時體現(xiàn)了miRNA的又一特點基因表達時序性。MiRNA表達的時序性和組織特異性提示人們miRNA的分布可能決定組織和細胞的功能特異性，也可能參與了復雜的基因調(diào)控，對組織的發(fā)育起重要作用。在科研上，一個小RNA分子要成為miRNA，需要符合以下條件：a）表達需

11、要用Northern-blot來證實；b）小RNA分子必須是處在具發(fā)夾結構的前體RNA分子中遠離環(huán)或膨脹部分的一端才行；c）小RNA分子必須在系統(tǒng)發(fā)育上具備相當?shù)谋Ｊ匦?。d）前體RNA分子會在Dicer功能下降時積累起來（該項標準由于實踐較難，只做參考）。這些標準單獨一條不足以證明一個未知小RNA分子是否就是是miRNA，具體地，如果小RNA分子符合上面的a（表達）和b（結構）兩條標準；或者a（表達）和c（保守性）；如果表達量很低難以檢測，那么如果可以用cDNA克隆的方法得到目標分子，并符合c（保守性）；小RNA分子如果不是通過cDNA克隆的方法得到的，那么就必須符合a（表達）和前體RNA分子

12、結構和保守性的標準才行；如果小RNA分子被推測為miRNA，那么符合c（系統(tǒng)發(fā)育保守性）和d（累積性）標準也行；這樣我們就可以認為該小RNA分子就是miRNA分子。尋找miRNA的方法：這里我們簡單看一下分子信息學的方法：應用計算機的方法如MirScan來尋找miRNA分子已經(jīng)在線蟲及脊椎動物體內(nèi)取得了巨大的成功。2004年6月，吳政道在前述的計算機方法的基礎上提出一種可以進行高通量篩選miRNA靶位點的方法。用這種方法篩選miRNA的原理：該方法的出發(fā)點為前體的發(fā)夾狀結構及miRNA在物種間的保守性。miRNA基因可能定位于編碼蛋白基因的內(nèi)含子區(qū)域（有意義鏈或反意義鏈）及遠離任何已知基因的基

13、因間區(qū)域。一些時候，幾個發(fā)夾狀結構以多順反子的形式叢集在一起.Uwe Ohler, Chris Burge等人給出了一些可以提高尋找miRNA基因的準確性的一些附加條件：1）上游和下游保守序列的數(shù)量；2）候選發(fā)夾狀結構的上游高度保守的模序的存在。MIT的Bartel and Chris Burge報道了一種可以用來探測miRNA與其作用的靶基因之間的關系的新的計算機的方法TatgetScan。他們針對已知的每一個miRNA，掃描mRNA的數(shù)據(jù)庫DNA轉譯為蛋白的生化信息，搜索與miRNA匹配的片段，然后對miRNA與mRNA的匹配程度評分，推測在三個或以上物種中獲得高分的mRNA為該miRNA

14、的靶基因。RISC介紹RNA誘導的沉默復合物（RNA-induced silencing complex; RISC）的組裝是在RNAi和miRNA通路中最為復雜的過程。它涉及到小RNA的生產(chǎn)器（Dicer）；小RNA螺旋結構及相應的RLC組裝；解螺旋后對稱/不對稱的RNA螺旋結構及對應的特異性的AGO蛋白質(zhì)的招募活動。剛產(chǎn)生的siRNAs和miRNAs都是雙鏈結構，這種雙鏈結構需要解螺旋才能被組裝到RISC中發(fā)揮作用。組裝后的復合物分別稱為siRISC和miRISC。通過對鏈兩端的熱力學穩(wěn)定性分析，可以將siRNA分為兩大類：對稱性siRNAs和非對稱性siRNAs。對稱性siRNAs有著相

15、同穩(wěn)定性的末端；從而兩條鏈有著同等結合到RISC中的機會(Schwarz et al., 2003)。與之不同的是，非對稱性siRNAs的一端穩(wěn)定性會比另外一端差些。因為穩(wěn)定性較差的一端容易解螺旋，因此，偏向性地產(chǎn)生一條鏈結合到RISC復合物上，這個過程我們稱之為“RISCs的非對稱性組裝(Schwarz et al., 2003; Khvorova et al., 2003)”。不同的AGO蛋白質(zhì)使得RISCs有著不同的功能，這可能是由AGO蛋白質(zhì)上PIWI結構域決定的。根據(jù)AGO蛋白質(zhì)的不同，我們將RISCs分成兩種：切割型RISC和非切割型RISC。但具體到一個RISC是否切割一個目標m

16、RNA分子，情況就更為復雜些，一般的以下五個方面決定(Tang, 2005)：a）必須是切割型RISC；b）小RNA分子和目標的mRNA的配對情況要達到一定的水平；c）特定生物/組織/細胞中的RISC的切割速率情況（就是說在不同的細胞中是那種形式占據(jù)主導地位，是切割還是抑制）；d）小RNA分子的來源背景；e）目標mRNA的特性（數(shù)量，更新速率，結構，翻譯能力）。siRNA的生成及作用機制dsRNA 引起的RNAi 大致可分為3個階段即啟動、剪切、倍增:1、啟動階段 研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)dsRNA 除外源性導入外，可能來源于病毒激活、轉座子活化及特異重復序列或其他未知途徑。研究證實dsRNA 在體內(nèi)通過

17、2123 個核苷酸(nt) 片段即小干擾RNA ( siRNA) 發(fā)揮其抑制作用。RNase 是為數(shù)不多的對長dsRNA 顯示特異性的核酸酶，依據(jù)區(qū)域結構可將其分為3 個類型，其中第3 類以果蠅的CG4792 和線蟲的K12H4. 8 為代表，二者在RNA 干擾過程中可以將dsRNA 加工成siRNA，現(xiàn)在稱此酶為Dicer 酶。人類Dicer 酶是一個接近普通RNase 的蛋白，能夠結合并剪切不同的dsRNA。其結構主要包括:N 端螺旋酶區(qū)、PAZ區(qū)、C 端RNase 區(qū)(由dsRNA 結合區(qū)和串聯(lián)核酸酶區(qū)組成) 以及ATP 結合區(qū)和DECH 盒。另外，在其他諸如小鼠等生物中也發(fā)現(xiàn)類似的Di

18、cer 酶。Dicer 酶在剪切長dsRNA 為siRNA 過程中起了關鍵性作用。在線蟲及其他生物中發(fā)現(xiàn)了lin24 和let27，這是2 個單鏈RNA 分子，其突變失活可影響發(fā)育，被稱為stRNA (small temporal RNA) 。二者是特異性蛋白編碼基因的負性調(diào)節(jié)因子，可在翻譯水平上調(diào)節(jié)基因表達。成熟stRNA可與mRNA的3端非編碼區(qū)結合而阻遏其翻譯，并不引起mRNA 降解。2、效應階段 Elbashir等在果蠅體外系統(tǒng)中加入合成2123nt 的siRNA， 使之能有效降解同源mRNA， 而當siRNA 濃度增加到一定閾值時，mRNA 降解程度不再繼續(xù)增加，提示在果蠅裂解液中含

19、有一定數(shù)量RNAi 所需蛋白因子。進一步研究得知RNAi 所需蛋白因子是一種復合物，被稱為RNA 誘導的沉默復合體(RNA-induced silencing complex，RISC) 。RISC 是一種核糖核蛋白，包含有RNA 和蛋白成分。其中的RNA 就是siRNA，其蛋白成分包括AGO22、VIG 和dFXR 以及Dmp68 等，實驗證實這些成分是RISC 的一部分且為RNAi 所必需。在剪切過程中siRNA 的結構起了重要作用，具有典型結構的siRNA 較平末端siRNA 更能有效引起RNAi 作用，尤其是3端外懸的第2 個核苷酸影響siRNA 對靶mRNA 的剪切作用。另外，siR

20、NA 對靶mRNA 剪切具有精確的序列特異性。3、倍增階段 以往實驗發(fā)現(xiàn)僅需少量siRNA 即可引起強烈同源基因表達抑制，因此眾多學者推測在RNAi 過程中存在倍增放大機制。有人認為在前述的mRNA剪切過程中產(chǎn)生的2123nt 片段可能會作為新的siRNA 而繼續(xù)參與RNAi 過程， 從而使干擾作用放大。這種擴增機制只是一種推測，是否存在尚需進一步的實驗研究確定。RNAi 的系統(tǒng)性作用也是其引起人們關注的重要原因，但機制不明。Spankuch Schmitt 等在乳腺癌細胞系、子宮頸癌細胞系、結腸癌細胞系等細胞中成功進行了RNAi 實驗，并觀察到癌細胞增殖明顯減少、凋亡顯著增加。Krichev

21、sky 等用合成的siRNA 導入有絲分裂后期的原代神經(jīng)元中，有效抑制了其內(nèi)源性基因表達，使應用RNAi 技術研究神經(jīng)發(fā)育及功能調(diào)控成為可能;不久前Song 等在小鼠體內(nèi)進行RNAi 實驗，有效抑制了Fas21 基因表達，從而延長了患自身免疫性肝炎小鼠的生命，為進行RNAi 的動物實驗奠定了實驗基礎。隨著RNAi 作用機制的進一步明確、應用技術的完善成熟，RNAi 技術必將為人類研究基因功能，以及對癌癥等疾病進行基因治療提供強大武器。RNAi干涉的關鍵步驟是組裝RISC和合成介導特異性反應的siRNA蛋白。SiRNA并入RISC中，然后與靶標基因編碼區(qū)或UTR區(qū)完全配對，降解靶標基因，因此說s

22、iRNA只降解與其序列互補配對的mRNA。其調(diào)控的機制是通過互補配對而沉默相應靶位基因的表達，所以是一種典型的負調(diào)控機制。siRNA識別靶序列是有高度特異性的，但這并不是說反義鏈上所有的堿基都對發(fā)揮這種特異性起到了相同的作用。因為降解首先在相對于siRNA來說的中央位置發(fā)生，所以這些中央的堿基位點就顯得極為重要，一旦發(fā)生錯配就會嚴重抑制RNAi的效應，相對而言，3´末端的核苷酸序列并不要求與靶mRNA完全匹配。miRNA的生成及作用機制與小分子siRNAs相比，盡管兩者在分子特性、生物起源等方面是相似的，但也存在不少的差異。siRNAs是由dsDNA在Dicer酶切割下產(chǎn)生，而成熟m

23、iRNAs的產(chǎn)生要復雜一些，首先pri-miRNA在核內(nèi)由一種稱為Drosha酶處理后成為大約70nt的帶有莖環(huán)結構的Precursor miRNAs (pre-miRNAs)(Denli et al., 2004; Gregory et al., 2004; Han et al., 2004)；這些pre-miRNAs在Exportin-5幫助下轉運到細胞核外之后再由胞質(zhì)Dicer酶進行處理，酶切后成為成熟的miRNAs(Lund et al., 2004; Yi et al., 2003)。兩者的作用機制上也存在差別，成熟的miRNAs則是通過與miRNP核蛋白體復合物結合，識別靶mRNA

24、，并與之發(fā)生部分互補，從而阻遏靶mRNA的翻譯。在動物中，成熟的單鏈miRNAs與蛋白質(zhì)復合物miRNP結合，引導這種復合物通過部分互補結合到mRNA的3UTR（非編碼區(qū)域），從而阻遏翻譯。而在siRNA通路中，單鏈的siRNA結合到RISC復合物中，引導復合物與mRNA完全互補，通過其自身的解旋酶活性，解開siRNAs，通過反義siRNA鏈識別目的mRNA片段，通過內(nèi)切酶活性切割目的片段，接著再通過細胞外切酶進一步降解目的片段。除此之外，miRNA也可以切割完全互補的mRNA，而siRNA也可以阻遏3UTR具有短片斷互補的mRNA的翻譯。一般來說，一種miRNA它在mRNA上的識別位點有多個

25、，而這種多個識別位點對于miRNA發(fā)揮其轉錄后抑制作用是必要的。3非編碼區(qū)也是調(diào)控翻譯的一個重要組成部分。一個轉錄本的總體結構由5'非編碼區(qū)(5'Untranslated Region，5'UTR)，編碼區(qū)（Open Reading Frame，ORF）和3'非編碼區(qū)（3' Untranslated Region，3'UTR）組成?，F(xiàn)已了解3'UTR具轉錄本特異性，它在mRNA轉錄后修飾、細胞內(nèi)定位及轉運、維持mRNA穩(wěn)定性及保證翻譯的效率方面都具重要的調(diào)控功能。3'UTR是發(fā)生3'末端加工的區(qū)域，包含各種順式(cis-)

26、作用元件，能夠和特定的加工復合物互作以調(diào)控mRNA的3'末端加工。對哺乳動物的研究表明，真核生物中3'末端加工涉及3'UTR內(nèi)某個位點的剪切和末端添加多聚腺苷酸尾Poly(A+)兩個關鍵過程。應用缺失實驗和序列分析已確認了哺乳動物mRNA的3'UTR包含了核心順式作用元件。這類元件與加工復合物的相互作用是3'末端形成的核心機制，包括三部分：Poly(A+)位點，也可稱為剪切位點(cleavage site， CS)，保守序列為YA (Y代表T 或C)的二聚核苷酸，這種保守序列的單堿基比例為A > T > C > G；Poly（A+）位點

27、上游（5'端）10-30 nt 處存在著保守的Poly(A+)定位信號序列(以AATAAA為主)。Poly（A+）位點下游（3'端）存在著穩(wěn)定3'末端加工復合物作用的保守性稍差的T/GT豐富序列，稱為下游作用元件。miRNA基因是一類高度保守的基因家族，按其作用模式不同可分為三種：第一種以線蟲lin-4為代表，作用時與靶標基因不完全互補結合，進而阻遏翻譯而不影響mRNA的穩(wěn)定性，這種miRNA是目前發(fā)現(xiàn)最多的種類。第二種以擬南芥miR-171為代表，作用時與靶標基因完全互補結合，作用方式和功能與siRNA非常類似，最后切割靶mRNA，這說明某些miRNA和siRNA一樣

28、參與了機體內(nèi)一些特異性mRNA的剪切過程。第三種以let-7為代表，它具有以上兩種作用模式，當與靶標基因完全互補結合時，直接靶向切割mRNA，如果蠅和Hela細胞中l(wèi)et-7直接介導RISC分裂切割靶mRNA；當與靶標基因不完全互補結合時，起調(diào)節(jié)基因基因表達的作用，如線蟲中的let-7與靶mRNA3´端非翻譯區(qū)不完全配對結合后，阻遏調(diào)節(jié)基因的翻譯。對于miRNAs的研究已經(jīng)成為目前的一大熱點，而種種跡象表明miRNAs可能是一類與腫瘤發(fā)生有關的新的基因。像miRNA-15a和miRNA-16a與CLL有關，miRNA-142則與侵襲性的B細胞性白血病有關。研究發(fā)現(xiàn)，一些miRNAs能

29、夠在腫瘤形成中發(fā)揮作用，可以作為腫瘤抑制基因；另外一些miRNAs則是作為癌基因存在。植物miRNA從2002年起才有報道，編碼植物miRNAs的基因明顯不同于其他生物：植物編碼miRNA基因的轉錄產(chǎn)物可能更大，植物的miRNA與互補結構的錯配一般也少于動物，在進化上表現(xiàn)地更為保守。但和動物miRNA一樣，miRNA的轉錄產(chǎn)物也是發(fā)夾狀結構，在RNase酶切割后以雙鏈形式存在，最后釋放互補鏈，miRNA成熟。科學家們已發(fā)現(xiàn)miRNA在動植物早期發(fā)育中起的關鍵調(diào)節(jié)作用，包括植物葉、花的發(fā)生，動物胚胎及組織發(fā)育等。例如，在carpel factory (car) 突變株中3個miRNAs的表達水平

30、顯著下降。CARPEL FACTORY 是一個類似Dicer的酶，參與植物的發(fā)育，其缺失突變株表現(xiàn)為胚胎和葉片發(fā)育的缺陷。實驗結果提示這種缺陷是由于缺少miRNAs加工而造成的。多數(shù)的植物miRNAs在某些特定組織中高水平表達也提示他們可能參與了植物組織的發(fā)育過程。Brennecke等人利用電腦尋找靶標基因，證實了miRNA不完全結合3´UTR中存在細胞死亡誘導基因，這提示說明miRNA對生長發(fā)育進行更為重要的調(diào)控作用。盡管現(xiàn)在研究者們對于miRNAs的認識越來越深刻，仍然有很多的猜想需要證實，比如對miRNAs的潛在的生物學效應的猜測；miRNAs在高級真核生物體內(nèi)對基因表達的調(diào)控

31、作用可能和轉錄因子一樣重要；miRNAs可能代表一個新層次上的基因表達調(diào)控模式，等等。所以說，大多數(shù)miRNAs的功能仍然是個謎，有待于研究者們更深入的研究。siRNA和miRNA的相同點和不同點相同點：1、 二者的長度都約在22nt左右；2、 二者都依賴Dicer酶的加工，是Dicer的產(chǎn)物，所以具有Dicer產(chǎn)物的特點；3、 二者生成都需要Argonaute家族蛋白存在；4、 二者都是RISC組分，所以其功能界限變得不清晰，如二者在介導沉默機制上有重疊；5、 miRNA和siRNA合成都是由雙鏈的RNA或RNA前提形成。不同點：1、 根本區(qū)別是miRNA是內(nèi)源的，是生物體的固有因素；而si

32、RNA是人工體外合成的，通過轉染進入人體內(nèi)，是RNA干涉的中間產(chǎn)物。2、 結構上，miRNA是單鏈RNA，而siRNA是雙鏈RNA。3、 Dicer酶對二者的加工過程不同，miRNA是不對稱加工，miRNA僅是剪切pre-miRNA的一個側臂，其他部分降解；而siRNA對稱地來源于雙鏈RNA的前體的兩側臂。4、 在作用位置上，miRNA主要作用于靶標基因3-UTR區(qū)，而siRNA可作用于mRNA的任何部位。5、 在作用方式上，miRNA可抑制靶標基因的翻譯，也可以導致靶標基因降解，即在轉錄水平后和翻譯水平起作用，而siRNA只能導致靶標基因的降解，即為轉錄水平后調(diào)控。6、 miRNA主要在發(fā)育

33、過程中起作用，調(diào)節(jié)內(nèi)源基因表達，而siRNA不參與生物生長，是RNAi的產(chǎn)物，原始作用是抑制轉座子活性和病毒感染?；蛳葳澹℅ene Trap）1 . 基因陷阱的原理目前已發(fā)展了三種不同的陷阱系統(tǒng) 增強子陷阱,啟動子陷阱和基因陷阱 。它們之間最大的不同體現(xiàn)在報道基因重組體的組成和插入位置上。基因陷阱是這三種方法的統(tǒng)稱。1 . 1增強子陷阱(enhancer t rap) 將某報道基因與一個精巧的啟動子相連,組成一增強子陷阱重組體(見圖1B) ,它不會自主起始轉錄,而需由被插入的細胞基因組中的增強子幫助才可轉錄。若報道基因最終表達,則可推知插入位點附近有增強子,或有基因,即實現(xiàn)了以該增強子陷阱重

34、組體發(fā)現(xiàn)增強子的目的。1 . 2啟動子陷阱(p ro moter t rap) 通過將報道基因插入到細胞基因組的外顯子上(見圖 C) ,一旦發(fā)現(xiàn)它與細胞基因組基因被共同轉錄或表達,則可知該報道基因附近有啟動子,從而起到了以之為誘餌,發(fā)現(xiàn)啟動子的目的,這就是啟動子陷阱。1 . 3基因陷阱(gene t rap) 基因陷阱重組體由報道基因和接受體剪接部位(splice acceptor , SA)組成(接受體剪接部位在報道基因上游) ,該重組體需要插入到細胞基因組的內(nèi)含子中隨著基因轉錄和表達(見圖1D) ,故如能檢測到融合轉錄物或融合蛋白,則證明插入位置附近有基因存在 2 。啟動子陷阱和基因陷阱都

35、有位置限制,前者需插入到外顯子,后者則需插入到內(nèi)含子,增強子陷阱卻沒有此位置限制;由于增強子與基因的位置可近可遠,故增強子陷阱不易定位基因;此外,對啟動子陷阱和基因陷阱而言,插入可能導致基因失活。下面以帶SA的基因陷阱(即第三種基因陷阱)的一個成功例子具體闡明這一系統(tǒng)的工作原理。1998年Tate等以2半乳糖苷酶2新霉素磷酸轉移酶為報道基因,和上游的接受體剪接部位SA構成重組體, 只有以正確的方向整合到內(nèi)含子的表達基因才有可能被剪接成基因轉錄物或表達為融合蛋白,利用此基因陷阱“釣”出了一小批新的染色體蛋白和核蛋白 3 。2 . 基因陷阱的特點基因陷阱的優(yōu)勢在于它只在表達水平上定位基因,細胞基因

36、本身的轉錄和表達不受影響,所以可檢測功能上多余的基因,也可檢測在基因表達多個水平上都有作用的基因,或低水平表達的重要基因,而以前的功能基因組學的方法對這些基因都是無法確定的?；蛳葳宓牟蛔阒饕憩F(xiàn)在以下幾個方面:(1) 表達基因的確定較困難且耗時長 如何克隆和篩選融合轉錄物或融合蛋白是一件很費時費力的事。通常根據(jù)所插入的報道基因的DNA序列為引物,用PCR技術獲取兩側序列,再與ES T數(shù)據(jù)庫比較和確定基因功能。最近出現(xiàn)一些很好的解決方法,如在RACE的微透析和固相測序中采用自動化和熒光測序,可縮短時間;或只測一小段DNA序列即與ES T數(shù)據(jù)庫已有序列進行比較,若已有人研究過,則不用繼續(xù),若從沒

37、研究過,則應得到目的基因全長并分析其功能。(2) 突變的細胞的表型不明顯 主要原因是被捕獲的基因不一定有很明顯的表達方式,以及突變的ES細胞克隆不一定有明顯的表型。目前的解決方法是進行體外預先篩選我們需要的融合基因株系。(3) 報道基因表型可能會喪失 若報道基因沒按預期加以整合,或報道基因被剪接時整個被切除,都可能使報道基因表型喪失而無從著手。(4) 目前使用的基因陷阱系統(tǒng)對細胞的傷害大 畢竟基因陷阱是插入了一段外源DNA ,所以是一種劇烈的方法,會有致死效應(美國加州大學Berkeley分校的實驗室的細胞或胚胎致死頻率是1/ 3) 4 。在一些情況下應采用柔和一些的方法,如進行重組體的置換而

38、不是插入,用點突變,選擇性地采用表型突變 5 。3 . 基因陷阱的應用 基因陷阱的應用主要集中在醫(yī)療和制藥上,而目前小鼠是探討人類生理過程最好的模型,因此許多應用性的工作都以小鼠作為研究對象。一般在小鼠中不使用增強子陷阱,其基因組很大但基因頻率很低,故很難定位增強子;報道基因一般是lac2Z ,它的上游有一個或多個受體剪接部位,由逆轉錄病毒引入全能胚胎干細胞,再移入小鼠種系中。1988年就已有人在小鼠細胞中使用基因陷阱 6 。最近美國國立衛(wèi)生院(N IH)的科研人員報道以小鼠為材料,利用H IV21慢病毒來研究哺乳動物的細胞分化和發(fā)現(xiàn)新的基因,而慢病毒作為基因陷阱載體,是因為他們可隨機插入動物

39、細胞的基因組并可長期表達 7 。法國和日本的科學家利用乙肝病毒(HBV)的DNA幫助基因陷阱的插入整合,來確定未知的肝癌相關基因。這說明可通過研究病毒基因的整合位點來確定人類疾病相關基因,同時證明這些由HBV構成的基因陷阱附近的基因?qū)毎鲋澈蜕L有重要調(diào)控作用8 。近些年來,許多著名的大學和研究所已建立自己的基因陷阱實驗室,如英國牛津大學,美國冷泉港實驗室等。此外,許多生物制藥公司和研究團體都看好基因陷阱在生物醫(yī)療和制藥方面的DNA分子標記可對特定淋巴細胞的發(fā)生及遷移進行跟蹤,從而為人們進一步探索淋巴細胞的成熟、歸巢等提供了良好的研究平臺。4 .展望盡管目前斑馬魚作為免疫學模式生物還只是剛剛

40、起步,但由于其具有發(fā)育生物學研究方法成熟、進化地位特殊、遺傳突變篩選簡便等特點,在未來的研究,特別是免疫系統(tǒng)的發(fā)生、發(fā)育及特異性免疫系統(tǒng)進化起源等研究領域中必將發(fā)揮日趨重要的作用。平衡化cDNA文庫 平衡化cDNA文庫三種平衡化理論 （PDF里的英文翻譯）飽和雜交到基因組DNA基因頻率在DNA水平上是相等的基于關聯(lián)動力學罕見的物種二次動力學cDNA的再次退火將退火較慢寡核苷酸指紋 基于一系列短的寡聚核苷酸探針對于高密度序列的單個的cDNA克隆經(jīng)特定雜交纏身特征型的cDNA序列即為指紋 分子標記顯性和共顯性問題有關分子標記共顯性 分子標記中，顯性和共顯性，指allele而言，即指所擴增的PCR產(chǎn)

41、物(DNA片斷)。象RAPD、ISSR等顯性標記，PCR產(chǎn)物無法確切確定，因而無法區(qū)分雜合體（heterozygosity），只能按有帶無帶進行分析，記錄為0/1；而SSR等共顯性標記，則能區(qū)分雜合體，即二倍體及多倍體染色體DNA上的不同變異都能顯現(xiàn)出來，而且不僅可采用0/1記錄也可按擴增產(chǎn)物的長度（bp）進行記錄和分析，是一種能區(qū)分雜合體的共顯性標記，即如果同源染色體上相同的locus上，存在插入、缺失等變異，即便是單個堿基對上的差異也能同時顯示并加以分辨。所以，共顯性標記，在揭示遺傳多樣性方面要比顯性標記具有更大的優(yōu)勢。更為重要的是，SSR引物是以外顯子保守序列為引物結合點，即以已知DNA

42、序列為基礎所開發(fā)的引物，在基因組上具有特定的位置，所以在QTL等分析上，應用極為廣泛。共顯性：說白了就是可以分辨出純和的跟雜合的這個有圖示比較好理解。首先, RAPD是隨機引物，(可以理解只有正向引物，沒有反向引物。)因此，它擴增出來的為引物結合位點到終點的長度。當然一條練上會有很多該引物結合位點，也就出現(xiàn)了很多片段。對于一個特定位點，我們可以理解只有一條正練可被擴增。因此，在該練上只有兩種情況，有和沒有。對于SSR，有一對(正向引物和反向引物)。對于一個特定位點，兩條練都可被擴增，因此.T - D NA導入植物基因組的分子機理農(nóng)桿菌介導的T - DNA的轉移和整合是細菌與植物細胞相互作用發(fā)生

43、生物學效應的過程,兼具原核生物中的細菌接合轉移及真核細胞加工修飾的特點。其整個過程大致包括:(1)農(nóng)桿菌對受體的識別與附著; (2)農(nóng)桿菌對特異的植物信號分子的感應;(3) v i r G介導的信號傳導及毒性基因的活化;(4)毒性蛋白作用產(chǎn)生T - DNA單鏈; (5)毒性蛋白轉移復合體的形成及T - DNA和毒性蛋白進入宿主胞質(zhì); (6)成熟T - DNA復合體的形成; (7) T -DNA復合體在植物及細菌作用下被攝入細胞核;(8) T - DNA整合進入植物基因組。2 . 1農(nóng)桿菌對受體的識別與附著單個農(nóng)桿菌以極性方式通過細胞表面的乙?；嵝郧v膜多糖介導附著在植物細胞表面(此過程稱為接觸

44、) 9 ,受傷的植物組織分泌一系列的酚類、糖類、氨基酸類等趨化性物質(zhì) 10 吸引農(nóng)桿菌向受傷組織集中。據(jù)研究,植物細胞表面的農(nóng)桿菌附著位點是有限的,根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌的附著位點不同,每個植物細胞可以同時附著多種不同的農(nóng)桿菌菌株,但只能被1個或少數(shù)幾個菌株所轉化。且只有在創(chuàng)傷部位生存了816 h之后的菌株才能誘發(fā)腫瘤 11 ,這段時間稱為細胞調(diào)節(jié)期。在調(diào)節(jié)期內(nèi),農(nóng)桿菌會產(chǎn)生大量纖維素和一些糖類化合物將自身束縛在植物細胞壁表面并將細胞包裹形成一個囊狀結構(此過程稱為成囊 12 ) 。在農(nóng)桿菌識別及附著過程中,有許多基因和蛋白質(zhì)的參與。在農(nóng)桿菌體內(nèi)有一些染色體基因是農(nóng)桿菌植物互作所必需的,稱為染

45、色體毒性基因(Chro moso mal virulence ,chv) 。已發(fā)現(xiàn)10個這樣的基因, 它們是chvA,chvB, pscA (ex oC) , chvD, chv E, chv G, chv I,acv以及at t R和cel。在農(nóng)桿菌附著過程中,其染色體上的at t R, ch rA, chvB, pscA和cel 等基因所編碼的蛋白質(zhì)可能參與此過程13,14。其中at t R基因與大腸桿菌的一些膜蛋白或A TP結合蛋白基因具有同源性,但其產(chǎn)物尚不清楚。at t R只與細菌的附著有關,并不參與T - DNA的轉移。chvA 和chvB缺失時,細菌將不能合成1 . 2 -環(huán)葡聚

46、糖,表明其編碼是與1 . 2 - 環(huán)葡聚糖合成有關的蛋白質(zhì),并推測1 . 2 - 環(huán)葡聚糖可能是農(nóng)桿菌附著到植物細胞所必需的。chvB定位在細胞質(zhì)膜上。chvA 和chvB 與at t R不同, 其缺失會影響細胞遺傳物質(zhì)的轉移。chvA 和chvB缺失突變體無論用共培養(yǎng)還是真空滲入法都不能轉化擬南芥15。pscA 基因可能編碼磷酸葡糖異構酶,與胞外多糖合成有關。ChvD蛋白含有保守A TP/ GTP結合的區(qū)域,其功能尚不清楚。Chv G、chv I蛋白可能對農(nóng)桿菌在植物傷口組織酸性環(huán)境下的存活有關。ceL 是與纖維素合成有關的基因,可能參與附著過程中細菌表面的成囊過程。2 . 2農(nóng)桿菌對特異的

47、植物信號分子的感應最近的研究資料證實,額外的植物細胞表面分子可能對農(nóng)桿菌的結合起重要作用。例如,對2種擬南芥生態(tài)型B1 - 1和Petergof ,以及2個WS生態(tài)型的T - DNA插入突變型rat1和rat3(Resistant to Agrobacterium t ransformatio n)的研究表明:農(nóng)桿菌不能結合到它的根外植體上 16 ,17 。雖然在B1 -1和Petergof 中影響農(nóng)桿菌結合的基因還不得而知,但rat1和rat3突變已經(jīng)知道是它們分別影響了一種為arabinogalactan的蛋白(A GP)和一種細胞壁蛋白。然而,雖然rat1 和rat2、B1 - T和Pe

48、tergof對農(nóng)桿菌感染屬難以轉化物種(recalcit rantspecies) ,但它們的雌配子仍然保持可轉化性 18 。這一結果表明,農(nóng)桿菌不同植物組織的附著與植物細胞表面不同蛋白有關。植物滲出物對農(nóng)桿菌毒性基因的轉錄激活及農(nóng)桿菌的附著是必需的。特別是從植物傷口滲出的單糖及小的酚類化合物可被農(nóng)桿菌的“雙組分”(two2co mpo nent)信號傳導系統(tǒng)所識別。象乙酰丁香酮(Acetosyringo ne ,As) 、- 羥基乙酰丁香酮等酚類化合物與植物中合成次生代謝產(chǎn)物(如木質(zhì)素、黃酮類物質(zhì)等)的苯丙烷途徑的產(chǎn)物非常類似。這些酚類小分子化合物被稱為信號分子,能夠誘導Ti質(zhì)粒上的毒性基因

49、(v i r)的表達。2 . 3v i r G介導的信號傳導及v i r 區(qū)基因的表達(v i r基因活化)v i r區(qū)基因在接受植物細胞產(chǎn)生的創(chuàng)傷信號分子后,首先是virA編碼一種結合在膜上的化學受體蛋白(virA) 。按照細胞感受刺激并對此作出反應的“雙組分系統(tǒng)”學說,virA 可能是一種整合在膜上的傳感蛋白。virA直接與植物滲出物相互作用 19 。當酚類物質(zhì)(如AS)與感應位點結合后,會使整個virA蛋白構想發(fā)生變化,其C端活化。C端有激酶的功能,使蛋白質(zhì)上的組氨酸殘基發(fā)生自磷酸化作用,從而激活virA蛋白。被激活的virA蛋白可以轉移其磷酸基因至vir G蛋白。作為一種轉錄調(diào)控因子活

50、化v i r 啟動子啟動v i r 基因表達。因此, vir G在此過程中起反應調(diào)節(jié)器的作用。chv E可大大增強v i r基因被AS誘導的效果,其產(chǎn)物chv E可結合一些單糖,也可直接與v i rA 的周質(zhì)區(qū)相互作用,以加強AS對vir基因的誘導。除此之外, v i r G蛋白也可能參與此過程。一種誘導v i r基因表達的酚類化合物阿魏酸(Ferulic acid)對vir H2 突變體的作用比野生型更有效,利用質(zhì)譜等方法發(fā)現(xiàn)野生型菌株的上清液中含有大量阿魏酸的去甲基化合物咖啡酸(Caffeic acid) 。因而vir H2 蛋白可能起到負調(diào)控作用 20 。2 . 4毒性蛋白作用產(chǎn)生T -

51、 DNA單鏈(T - DNA加工)v i rC、v i rD 和v i rD2 參與T - DNA單鏈的形成。v i rD1和v i rD2是v i rD基因編碼的2個產(chǎn)物,它們相互作用并具有單鏈或特異位點核酸內(nèi)切酶功能。virD1 蛋白是一種拓撲異構酶,可將超螺旋DNA轉變成松馳型DNA ,并起到輔助virD2 作用。virD1識別并結合到Ti質(zhì)粒- 25bp正向重復序列(T - DNA邊界)上促進virD2 的酶解作用。體外純化的重組virD2 可單獨起作用切割單鏈的T -DNA ,但無論在體內(nèi)還是體外,切割雙鏈的T -DNA必須virD1 和virD2共同作用。virD2直接參與T -

52、DNA的形成和加工,起內(nèi)切酶作用,在T -DNA右邊界處切開,隨后virD2 通過Tyr29與切斷的T - DNA 5末端共價連接,避免核酸外切酶降解T - 鏈。此過程需DNA解旋酸參與, virD2- T -DNA釋放需復制酶作用,以未切斷的頂鏈為模板,從右向左復制合成新的T - DNA。當復制到左邊時, T - DNA 釋放 21 。在Ti質(zhì)粒的T - DNA區(qū)留下的底鏈空缺隨后被細菌的DNA合成酶及其相關機制進行修復, Ti 質(zhì)粒復原。釋放的T - DNA在virD2連接下形成單鏈的DNA/蛋白質(zhì)復合體未成熟的T - 復合體(Immat ure T - co mplex) 。virD2C

53、 -末端保證切割反應的準確性和有效性,而virD2整體可能作為引導子引導T - DNA鏈從細菌轉移到植物細胞。virC(章魚堿Ti質(zhì)粒含virC1 和virC2)蛋白結合到T - DNA右邊界的驅(qū)動子序列上,促進virD2的酶解剪切作用,提高轉移效率。2 . 5毒性蛋白轉移復合體的形成及T - DNA和毒性蛋白進入宿主細胞質(zhì)(T - DNA轉移)vir E作為一種DNA結合蛋白,與單鏈T -DNA有很高的親合力,能與任何單鏈DNA序列結合。vir E2突變體的致病性顯著降低,由乙酰丁香酮誘導的農(nóng)桿菌細胞中vir E2 蛋白大量積累 22 ,因而vir E2在T - DNA轉移過程中可能起著重要

54、作用。有觀點認為T - DNA鏈形成后使全身被vir E2 蛋白包裹形成一種半剛性中空圓柱形的絲狀螺旋結構的T -復合體 23 。T -復合體這種結構有利于保護T- DNA鏈免受細胞中核酸酶的降解 24 ,并促進其進入宿主細胞核中。vir E能夠防止核酸外切酶降解T -鏈,而且vir E2的C -末端含有2個核定位信號(Nuclear - localizatio n Signal ,NL S)可以協(xié)助T -復合物到植物細胞核的運輸。但T鏈形成后的轉運形式目前還不清楚,vir E2的結合及作用位點也還存在爭議。T - DNA的轉移及vir E2 的結合可能發(fā)生在細菌細胞中 25 ,也可能發(fā)生在宿

55、主細胞質(zhì)中,即T - DNA轉移與vir E2 的轉移,是2個相對獨立的過程,vir E2 可能是在T - DNA轉化過程中由細菌產(chǎn)生后不與T - DNA鏈結合形成復合體,而是單獨地轉運至植物細胞內(nèi)發(fā)生作用 25 ,26 。vir E2 還可能與另外一種毒性蛋白vir E1 結合成復合體形式轉移到宿主細胞中。vir E1是一種特異的陪伴蛋白(分子伴侶) ,它可以幫助vir E2 以合適的形態(tài)運輸?shù)街参锛毎?。vir E1 能防止vir E2 與T - DNA鏈結合 27 ,當復合體轉移到細胞質(zhì)后,vir E2和vir E1才分離開。2 . 6成熟T -復合物的形成及其核輸入當T - DNA進入植

56、物細胞質(zhì)成為成熟的T -復合物后,細菌致病蛋白vir E2 和virD2 與植物蛋白相互作用,將T - DNA復合物轉運至細胞核。virD2和vir E2 在T -復合物和輸入中的作用可以通過以下的實驗得到證實。隨帶缺少核定位信號(NL S)的virD2突變體的農(nóng)桿菌株,其腫瘤發(fā)生和T - DNA的表達受到抑制。此外,也可被體外組裝的vir E2-ssDNA復合物(而不僅僅是ssDNA)注入到活的植物細胞 28 的這種核輸出所證實 29 ,30 。在宿主植物細胞中,virD2 和vi E2 可能與細胞內(nèi)因子相互作用介導T -復合物的核輸入并整合到宿主基因組。通過酵母雙雜交系統(tǒng)已鑒定出環(huán)親合素(

57、Cyclop hilin、2C絲氨酸/ 蘇氨酸蛋白磷酸酶(PP2C) 、輸入蛋白(Importin -,如At kap)等幾種與virD2和vir E2作用的植物蛋白。利用功能遺傳分析及共聚焦顯微鏡研究表明:V IP1在酵母和哺乳動物細胞中能促成vir E2的核輸入 31 。因為V IP1是含有保守的亮氨酸鋅結構域的蛋白質(zhì),與已知的動物或酵母蛋白質(zhì)沒有明顯的同源性,表明它是一種與植物特異的vir E2 的核輸入有關的細胞因子。V IP1如何促進vir E2的核輸入的詳細機制還不了解,但是,由于V IP1 本身定位在動物、酵母和植物細胞中的核中,它結合到vir E2 上并轉運到核中。在此過程中,

58、V IP1 可能與細胞的核蛋白- 如At kA P相互作用,促進vir E2 的核輸入。V IP1 在T -復合物的核輸入中的作用與所觀察的結果是一致的,即V IP1其本身不能與ssDNA聯(lián)系,但能與vir E相互作用,而vir E與ssDNA相結合,因此在體外形成一種V IP1 - vir E2 - ssDNA的三級復合體形式。最近, Tzfira 32 ,33 等證實V IP1 在轉基因煙草植株中的過量表達能明顯提高農(nóng)桿菌介導轉化的效率。除At kA P和V IP1外,在其他系統(tǒng)中的核輸入中要求一種小GTP酶- GTPase Ran 34 ,35 ,它很可能參與T -復合物的核輸入。2 . 7T - DNA整合到植物基因組T - DNA整合進宿主細胞基因組,是轉化過程中最重要也最關鍵的步驟。雖然已知T - DNA在宿主細胞核中是轉變成雙鏈DNA的,但T - DNA是以雙鏈還是單鏈分子的形式整合還存在爭論。有趣的是大多數(shù)侵入的T - DNA分子并不能整合到宿主基因組中。然而, T - DNA 的整合效率要遠遠高于通過非農(nóng)桿菌介導如基因槍等轉化方法的整合效率。這可能與T -復合物白組分virD2 和vir E2的活性有關。virD2 和vir E與宿主細胞核的輸入及DNA的修復機制有關,并促進T - DNA的核輸入及整合。virD2在整合過程中具有雙重作