基因芯片技術(shù)概要

1、基因芯片技術(shù)概要 作者：張發(fā)寶 本文來源：生物谷 生物科學(xué)正迅速地演變?yōu)橐婚T信息科學(xué)。最明顯的一個(gè)例子就是目前正在進(jìn)行的HGP（human genome project），最終要搞清人類全部基因組的30億左右堿基對(duì)的序列。除了人的遺傳信息以外，還有其它生物尤其是模式生物 model organism）已經(jīng)或正在被大規(guī)模測(cè)序，如大腸桿菌、啤酒酵母、秀麗隱桿線蟲以及中國和日本科學(xué)家攻關(guān)的水稻基因組計(jì)劃。但單純知曉生物基因組序列一級(jí)結(jié)構(gòu)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，還必須了解其中基因是怎樣組織起來的，每個(gè)基因的功能是什么，又是怎樣隨發(fā)育調(diào)控和微環(huán)境因素的影響而在特定的時(shí)空域中展開其表達(dá)譜的，即我們正由結(jié)構(gòu)基因組時(shí)代邁

2、入功能基因組時(shí)代。隨著這個(gè)功能基因組學(xué)問題的提出（后基因組時(shí)代，蛋白組學(xué)）1 ，涌現(xiàn)出許多功能強(qiáng)大的研究方法和研究工具，最突出的就是細(xì)胞蛋白質(zhì)二維凝膠電泳（2-D-gel）（及相應(yīng)的質(zhì)譜法測(cè)蛋白分子量）和生物芯片（Biochip）技術(shù) 2 。 一什么是基因芯片生物芯片，簡(jiǎn)單地說就是在一塊指甲大小（1cm3）的有多聚賴氨酸包被的硅片上或其它固相支持物（如玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等，但需經(jīng)特殊處理。作原位合成的支持物在聚合反應(yīng)前要先使其表面衍生出羥基或氨基（視所要固定的分子為核酸或寡肽而定）并與保護(hù)基建立共價(jià)連接；作點(diǎn)樣用的支持物為使其表面帶上正電荷以吸附帶負(fù)電荷的探針分子，通

3、常需包被以氨基硅烷或多聚賴氨酸等）將生物分子探針（寡核苷酸片段或基因片段）以大規(guī)模陣列的形式排布，形成可與目的分子（如基因）相互作用，交行反應(yīng)的固相表面，在激光的順序激發(fā)下標(biāo)記熒光根據(jù)實(shí)際反應(yīng)情況分別呈現(xiàn)不同的熒光發(fā)射譜征， CCD 相機(jī)或激光共聚焦顯微鏡根據(jù)其波長及波幅特征收集信號(hào)，作出比較和檢測(cè)，從而迅速得出所要的信息。生物芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、組織芯片。而基因芯片中，最成功的是 DNA 芯片，即將無數(shù)預(yù)先設(shè)計(jì)好的寡核苷酸或 cDNA 在芯片上做成點(diǎn)陣，與樣品中同源核酸分子雜交 3 的芯片?；蛐酒幕驹硗酒夹g(shù)中雜交測(cè)序（ sequencing by hybridizati

4、on, SBH ）。即任何線狀的單鏈DNA或RNA序列均可被分解為一個(gè)序列固定、錯(cuò)落而重疊的寡核苷酸，又稱亞序列（ subsequence ）。例如可把寡核苷酸序列 TTAGCTCATATG 分解成5個(gè)8nt亞序列： (1) CTCATATG (2) GCTCATAT (3) AGCTCATA (4) TAGCTCAT (5) TTAGCTCA 這 5 個(gè)亞序列依次錯(cuò)開一個(gè)堿基而重疊7個(gè)堿基。亞序列中 A 、 T 、 C 、 G 4 個(gè)堿基自由組合而形成的所有可能的序列共有 65536 種。假如只考慮完全互補(bǔ)的雜交，那么 48 個(gè) 8 nt 亞序列探針中，僅有上述 5 個(gè)能同靶 DNA 雜交。

5、可以用人工合成的已知序列的所有可能的 n 體寡核苷酸探針與一個(gè)未知的熒光標(biāo)記 DNA/RNA 序列雜交，通過對(duì)雜交熒光信號(hào)檢測(cè)，檢出所有能與靶 DNA 雜交的寡核苷酸，從而推出靶 DNA 中的所有8nt亞序列，最后由計(jì)算機(jī)對(duì)大量熒光信號(hào)的譜型（pattern）數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，重構(gòu)靶 DNA 的互補(bǔ)寡核苷酸序列。 二芯片類型一般基因芯片按其材質(zhì)和功能，基本可分為以下幾類 4 ：( 一 ) 元件型微陣列芯片1 生物電子芯片2 凝膠元件微陣列芯片3 藥物控釋芯片 ( 二 ) 通道型微陣列芯片1 毛細(xì)管電泳芯片2 PCR 擴(kuò)增芯片3 集成 DNA 分析芯片4 毛細(xì)管電層析芯片 ( 三 ) 生物傳感芯片1

6、 光學(xué)纖維陣列芯片2 白光干涉譜傳感芯片 小鼠基因表達(dá)譜芯片 (MGEC)附 : 目前國內(nèi)基因芯片常見品種 .( 上海博星公司 )芯片品種 芯片點(diǎn)數(shù) MGEC-20S 2000 MGEC-40S 4000 MGEC-80S 8000 癌癥相關(guān)基因表達(dá)譜芯片 (CRGEC) 分類 芯片型號(hào) 芯片點(diǎn)數(shù) 肝癌相關(guān)基因表達(dá)譜芯片 LiverC-16S 1626 LiverC-16D 3252 LiverC-9.5NS 954 LiverC-9.5ND 1908 肺癌相關(guān)基因表達(dá)譜芯片 LungC-7.3S 737 LungC-7.3D 1474 人類基因表達(dá)譜芯片 (HGEC) 芯片品種 芯片點(diǎn)數(shù) H

7、GEC-10S 1024 HGEC-10D 2048 HGEC-20S 2048 HGEC-20D 4096 HGEC-40S 4096 HGEC-40D 8192 HGEC-80S 8192 HGEC-80D 16184 三基因芯片的制備芯片種類較多，制備方法也不盡相同，常見的芯片可分為兩大類：一類是原位合成；一種是直接點(diǎn)樣。原位合成適用于寡核苷酸；直接點(diǎn)樣多用于大片段 DNA ，有時(shí)也用于寡核苷酸，甚至 mRNA 。原位合成有兩種途徑。一是光蝕刻法；一是噴印法。光蝕刻法可以合成 30nt 左右，噴印法可以合成 40-50nt ，光蝕刻法每步縮合率較低，一般為 95% 左右，合成 30nt

8、產(chǎn)率僅 20% ；噴印法可達(dá) 99% 以上，合成 30nt 產(chǎn)率可達(dá) 74% ，從這個(gè)意義上說噴印法特異性應(yīng)比光刻法高。此外，噴印法不需特殊的合成試劑。與原位合成法比較點(diǎn)樣法較簡(jiǎn)單，只需將預(yù)先制備好的寡核苷酸或 cDNA 等樣品通過自動(dòng)點(diǎn)樣裝置點(diǎn)于經(jīng)特殊處理的玻璃片或其它材料上即可。1、原位光蝕刻合成 5-7寡聚核苷酸原位光蝕刻合成技術(shù)是由 Affymetrix 公司開發(fā)的，采用的技術(shù)原理是在合成堿基單體的 5' 羥基末端連上一個(gè)光敏保護(hù)基。合成的第一步是利用光照射使羥基端脫保護(hù)，然后一個(gè) 5' 端保護(hù)的核苷酸單體連接上去，這個(gè)過程反復(fù)進(jìn)行直至合成完畢。使用多種掩蓋物能以更少的

9、合成步驟生產(chǎn)出高密度的陣列，在合成循環(huán)中探針數(shù)目呈指數(shù)增長。某一含 n 個(gè)核苷酸的寡聚核苷酸，通過 4 × n 個(gè)化學(xué)步驟能合成出 4n 個(gè)可能結(jié)構(gòu)。例如：一個(gè)完整的十核苷酸通過 32 個(gè)化學(xué)步驟， 8 個(gè)小時(shí)可能合成 65,536 個(gè)探針。目前美國 Affymetrix 公司已有同時(shí)檢測(cè) 6,500 個(gè)已知人類基因的 DNA 芯片，并且正在制備含 500,000-1,000,000 個(gè)寡核苷酸探針的人類基因檢測(cè)芯片。該公司每月投入基因芯片研究的經(jīng)費(fèi)約 100 萬美元，目前產(chǎn)品尚未公開投放市場(chǎng)發(fā)揮經(jīng)濟(jì)效益，但已有許多公司及研究機(jī)構(gòu)與其簽約購買其產(chǎn)品。該產(chǎn)品不僅可用于基因表達(dá)分析和基因

10、診斷等，而且在大規(guī)模藥物開發(fā)方面也具有誘人的前景。 Affymetrix 的大部分產(chǎn)品將在 98 年底全面投放市場(chǎng)。屆時(shí)，在其產(chǎn)品被廣泛采用的同時(shí)，其所有的研究投入將變成巨大的利潤。其它公司產(chǎn)品也正在從實(shí)驗(yàn)室技術(shù)研究走向開發(fā)應(yīng)用。目前，用于分子診斷的 DNA 芯片不僅已可用于檢測(cè)愛滋病病毒基因還可用于囊性纖維化（ CF ）、乳腺癌、卵巢癌等疾病相關(guān)基因的基因診斷。鑒于光刻設(shè)備技術(shù)復(fù)雜，只能有專業(yè)化公司生產(chǎn)，加之成本高及合成效率不高的問題，因此有待進(jìn)行以下研究：對(duì)光刻技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，提高合成效率；開發(fā)新的原位合成技術(shù)，如噴印合成技術(shù)，該技術(shù)既能進(jìn)行原位合成又能進(jìn)行非原位合成。另一方法是光導(dǎo)原位合成

11、法。具體方法是在經(jīng)過處理的載玻片表面鋪上一層連接分子（ linker ），其羥基上加有光敏保護(hù)基團(tuán)，可用光照除去，用特制的光刻掩膜（ photolithographic mask ）保護(hù)不需要合成的部位，而暴露合成部位，在光作用下去除羥基上的保護(hù)基團(tuán)，游離羥基，利用化學(xué)反應(yīng)加上第一個(gè)核苷酸，所加核苷酸種類及在芯片上的部位預(yù)先設(shè)定，所引入的核苷酸帶有光敏保護(hù)基團(tuán)，以便下一步合成。然后按上述方法在其它位點(diǎn)加上另外三種核苷酸完成第一位核苷酸的合成，因而 N 個(gè)核苷酸長的芯片需要 4N 個(gè)步驟。每一個(gè)獨(dú)特序列的探針稱為一個(gè) “feature” ，這樣的芯片便具有 4N 個(gè) “feature” ，包含了

12、全部長度為 N 的核苷酸序列。這種原位直接合成的方法無須制備處理克隆和 PCR 產(chǎn)物，但是每輪反應(yīng)所需設(shè)計(jì)的光柵則是主要的經(jīng)費(fèi)消耗。運(yùn)用這種方法制作的芯片密度可高達(dá) 106 探針 / 平方厘米，即探針間隔為 5 10m ，但只能制作 II 型 DNA 芯片。見圖 1 。 2、原位噴印合成芯片原位噴印合成原理與噴墨打印類似，不過芯片噴印頭和墨盒有多個(gè)，墨盒中裝的是四種堿基等液體而不是碳粉。噴印頭可在整個(gè)芯片上移動(dòng)并根據(jù)芯片上不同位點(diǎn)探針的序列需要將特定的堿基噴印在芯片上特定位置。該技術(shù)采用的化學(xué)原理與傳統(tǒng)的 DNA 固相合成一致，因此不特殊制備的化學(xué)試劑。3、點(diǎn)樣法點(diǎn)樣法是將合成好的探針、 cN

13、DA 或基因組 DNA 通過特定的高速點(diǎn)樣機(jī)器人直接點(diǎn)在芯片上。點(diǎn)樣分子可以是核酸也可以是寡核酸。一些研究者采用人工點(diǎn)樣的方法將寡核苷酸分子點(diǎn)樣于化學(xué)處理后的載玻片上，經(jīng)一定的化學(xué)方法處理非干燥后，寡核苷酸分子即固定于載玻片上，制備好的 DNA 芯片可置于緩沖液中保存。由于方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適于大規(guī)模 DNA 芯片制作，因而實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化點(diǎn)樣就顯得尤為重要。有的研究者用多聚賴氨酸包被固相支待物玻片，經(jīng)過分區(qū)后用計(jì)算機(jī)控制的微陣列點(diǎn)樣機(jī)按照預(yù)先設(shè)計(jì)順序點(diǎn)上核酸分子，點(diǎn)樣量很小，約為 5nl 。大規(guī)模 CDNA 芯片多采用這種方法，與其寡核苷酸微芯片相比。 DNA 芯片的潛在優(yōu)越性是具有更強(qiáng)的親和勢(shì)和特

14、異性雜交，但是需要大量制備，純化，量化，分類 PCR 產(chǎn)物。有的研究者將玻片上覆蓋 20m 厚薄層聚丙烯酰胺凝膠作為支持物，采用機(jī)械刻寫或光刻的方法在其表面劃上網(wǎng)格，并用激光照射蒸發(fā)掉單元間隙的多余凝膠，以實(shí)現(xiàn) DNA 芯片分區(qū)，單元大小為 40×40m 或 100×100m 間隔分別為 50m 和 100m 。然后將化學(xué)方法合成的寡核苷酸探針自動(dòng)化點(diǎn)樣于各個(gè)單元內(nèi)而制成 DNA 芯片，點(diǎn)樣速度可達(dá) 2000 單元 / 秒。其裝置采用的機(jī)器人有一套計(jì)算機(jī)控制三維移動(dòng)裝置、多個(gè)打印 / 噴印針的打印 / 噴印頭；一個(gè)減震底座，上面可放內(nèi)盛探針的多孔板和多個(gè)芯片。根據(jù)需要還可以

15、有溫度和濕度控制裝置、針洗滌裝置。打印 / 噴印針將探針從多孔板取出直接打印或噴印于芯片上。直接打印時(shí)針頭與芯片接觸，而在噴印時(shí)針頭與芯片保持一定距離。打印法的優(yōu)點(diǎn)是探針密度高，通常 1 平方厘米可打印 2,500 個(gè)探針。缺點(diǎn)是定量準(zhǔn)確性及重現(xiàn)性不好，打印針易堵塞且使用壽命有限。噴印法的優(yōu)點(diǎn)是定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，使用壽命長。缺點(diǎn)是噴印的斑點(diǎn)大，因此探針密度低，通常 1 平方厘米只有 400 點(diǎn)。國外有多家實(shí)驗(yàn)室和公司研究開發(fā)打印 / 噴印設(shè)備，目前有一些已經(jīng)商品化。軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院和益生堂生物企業(yè)公司目前正在聯(lián)手利用打印 / 噴印技術(shù)進(jìn)行生物芯片的研究和開發(fā)，預(yù)計(jì) 2 年內(nèi)將有用于實(shí)驗(yàn)室研究或

16、臨床診斷的基因芯片產(chǎn)品問世。見圖二。4、電子芯片 8-10電子芯片是由美國 anogen 公司開發(fā)的，目前國內(nèi)清華大學(xué)和復(fù)旦大學(xué)也在開發(fā)這一技術(shù)。這種芯片為帶有陽電荷的硅芯片、芯片經(jīng)熱氧化，制成 1mm × 1mm 的陣列、每個(gè)陣列含多個(gè)微電極，在每個(gè)電極上通過氧化硅沉積和蝕刻制備出樣品池。將連接鏈親和素的瓊脂糖覆蓋在電極上，在電場(chǎng)作用下生物素標(biāo)記的探針即可結(jié)合在特定電極上。電子芯片最大特點(diǎn)是雜交速度快，可大大縮短分析時(shí)間。制備復(fù)雜、成本高是其不足。5、三維芯片 11-12三維芯片是由美國的 Packard 、摩托羅拉、 Argonne 國家實(shí)驗(yàn)室三家機(jī)構(gòu)與俄羅斯 Engelhard

17、t 分子生物學(xué)研究所合作開發(fā)的一種芯片技術(shù)。三維生物芯片實(shí)質(zhì)上是一塊顯微鏡載玻片，其上有 10,000 個(gè)微小聚乙烯酰胺凝膠條，每個(gè)凝膠條可用于靶 DNA ， RNA 和蛋白質(zhì)的分析。先把乙知化合物加在凝膠條上，再用 3cm 長的微型玻璃毛細(xì)管將待測(cè)樣品加到凝膠條上。每個(gè)毛細(xì)管能把小到 0.2nl 的體積打到凝膠上。以上幾家機(jī)構(gòu)合作研究的生物芯片系統(tǒng)具有其它生物芯片系統(tǒng)不具有的幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。一是凝膠的三維化能加進(jìn)更多的已知物質(zhì)，增加了敏感性。二是可以在芯片上同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增與檢則。一般情況下，必須在微量多孔板上先進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，再把樣品加到芯片上，因此需要進(jìn)行許多額外操作。本芯片所用凝膠體積很小。

18、使 PCR 擴(kuò)增體系的體積減小 1,000 倍（總體積約納升級(jí)），從而節(jié)約了每個(gè)反應(yīng)所用的 PCR 酶（約減少 100 倍）。三是以三維構(gòu)象形式存在的蛋白和基因材料可以其天然狀態(tài)在凝膠條上分析，可以進(jìn)行免疫測(cè)定，受體 - 配體研究和蛋白組分析。6、流過式芯片（ flow-thru chip ） 13Cene Logic正在開發(fā)一種在芯片片基上制成格柵狀微通道，Cene Logic設(shè)計(jì)及合成特定的寡核苷酸探針，結(jié)合于微通道內(nèi)芯片的特定區(qū)域。從待測(cè)樣品中分離DNA或RNA并對(duì)其進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后，該樣品流過芯片，固定的寡核苷酸探針捕獲與之相互補(bǔ)的核酸，采用Cene Logic's 信號(hào)檢測(cè)

19、系統(tǒng)分析結(jié)果。流通式芯片用于高通量分析已知基因的變化，其特定在于敏感性高：由于寡核苷酸吸附表面的增大，流過式芯片可監(jiān)測(cè)稀有基因表達(dá)的變化；速度快：微通道加速了雜交反應(yīng)，減少了每次檢測(cè)所需時(shí)間；價(jià)格降低：由于采用了特殊的共價(jià)化學(xué)技術(shù)將寡核苷酸吸附于微通道內(nèi)，使每一種流過芯片可反復(fù)使用多次，從而使其成本降低。四基因芯片樣品制備一般說來應(yīng)用 DNA 芯片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)包括 5 個(gè)過程：生物學(xué)問題的提出和芯片設(shè)計(jì)；樣品制備；生物雜交反應(yīng)；結(jié)果探測(cè)；數(shù)據(jù)處理和建模。1、樣品制備。一般所需 mRNA 的量是以一張表達(dá)譜芯片需要 3g mRNA 計(jì)算的不同組織抽提 3 10g mRNA 所需組織量 器官 / 組織

20、 * 提取 3gmRNA 所需組織量 ( 克 ) 提取 10gmRNA 所需織量 ( 克 ) 總 RNA 得率 單位 : 毫克 RNA/ 克組織 mRNA 所占百分比 % 成人正常組織 肝 0.2083 0.6944 1.80 - 1.80 mg/g 0.80 成人正常組織 腦 缺數(shù)據(jù) 缺數(shù)據(jù) 1.30 - 1.30 mg/g 缺數(shù)據(jù) 成人正常組織 肺 0.3000 1.0000 1.00 - 1.00 mg/g 1.00 成人正常組織 心 0.5000 1.6667 0.60 - 0.60 mg/g 1.00 成人正常組織 胃 0.1852 0.6173 2.70 - 2.70 mg/g 0

21、.60 成人正常組織 喉 0.3125 1.0417 1.20 - 1.20 mg/g 0.80 病理組織 結(jié)腸癌 0.2521 0.8403 1.70 - 1.70 mg/g 0.70 病理組織 胃癌 0.4317 1.4388 0.50 - 0.50 mg/g 1.39 病理組織 空腸腺癌 0.3571 1.1905 1.40 - 1.40 mg/g 0.60 病理組織 直腸癌 0.1604 0.5348 1.70 - 1.70 mg/g 1.10 病理組織 肝癌 0.1116 0.3720 3.84 - 3.84 mg/g 0.70 病理組織 肺癌 0.1282 0.4274 2.00

22、- 2.00 mg/g 1.17 考慮到個(gè)體差異以及樣品在研磨、勻漿等過程中的損失，客戶提供的樣品量應(yīng)在上述基礎(chǔ)上增加 1-2 倍。 2、樣本采集過程關(guān)鍵點(diǎn)組織標(biāo)本采集操作建議規(guī)程 ,( 取標(biāo)本所需關(guān)鍵器材和處理要求 ) 鋁箔 經(jīng) DEPC 水浸泡過夜， 78°C 烘干，高壓滅菌后烘干 1.5 ml 微離心管 15 ml 聚丙烯離心管 市場(chǎng)有售 RNAase-Free 的相應(yīng)規(guī)格離心管 標(biāo)簽紙 記號(hào)筆 樣品登記表 由客戶指定專人填寫 液氮罐 應(yīng)常備液氮罐，并保證液氮的來源 取材部位的病理切片 由客戶提供 1-2 張 注：以下步驟 1 5 應(yīng)在冰上進(jìn)行且不超過 15 分鐘，超過時(shí)間會(huì)導(dǎo)

23、致樣品的 RNA 降解。對(duì)腫瘤組織的取材，要求盡可能準(zhǔn)確地判定腫瘤和正常組織，例如對(duì)于手術(shù)切除的整個(gè)或部分前列腺，可能要根據(jù)冰凍切片報(bào)告的結(jié)果來判定要進(jìn)行研究的取材部位。1、離體新鮮組織，切成多個(gè) 1cm3 小塊，剔除結(jié)締組織和脂肪組織。胃、腸組織應(yīng)剪除外膜；肝、腎、脾應(yīng)剪除門部血管神經(jīng)，腫瘤組織應(yīng)將周圍的正常組織切除干凈（正常組織也應(yīng)將周圍的腫瘤組織切除干凈）。2、在 RNase-Free 0.9 生理鹽水中漂洗樣品，以去除血漬和污物。3、用鋁箔包裹組織，或用 5ml 凍存管裝載組織 ( 但最好統(tǒng)一采用鋁箔 ) 。用記號(hào)筆在鋁箔或凍存管外表寫明樣品編號(hào)，并貼上標(biāo)簽，迅速投入液氮冷卻。4、填寫

24、樣品登記表，寫明樣品名稱、種類、編號(hào)、取樣日期、樣品處理情況等將液氮冷卻的組織放入樣品袋（每個(gè)樣品袋只保存同樣的組織），袋口留一根編號(hào)繩，繩上粘一張標(biāo)簽紙（標(biāo)簽上注明：樣品名稱、編號(hào)、日期），迅速轉(zhuǎn)入便攜式液氮罐5、保留 1-2 張取材部位的病理切片。 五。生物芯片雜交待分析基因在與芯片結(jié)合探針雜交之前必需進(jìn)行分離、擴(kuò)增及標(biāo)記。根據(jù)樣品來源、基因含量及檢測(cè)方法和分析目的不同，采用的基因分離、擴(kuò)增及標(biāo)記方法各異。當(dāng)然，常規(guī)的基因分離、擴(kuò)增及標(biāo)記技術(shù)完全可以采用，但操作繁瑣且費(fèi)時(shí)。高度集成的微型樣品處理系統(tǒng)如細(xì)胞分離芯片及基因擴(kuò)增芯片等是實(shí)現(xiàn)上述目的的有效手段和發(fā)展方向。為了獲得基因的雜交信號(hào)必須

25、對(duì)目的基因進(jìn)行標(biāo)記，目前采用的最普遍的熒光標(biāo)記方法與傳統(tǒng)方法如體外轉(zhuǎn)錄、 PCR 、逆轉(zhuǎn)錄等原理上并無多大差異，只是采用的熒光素種類更多，這可以滿足不同來源樣品的平行分析。用計(jì)算機(jī)控制的高分辨熒光掃描儀可獲得結(jié)合于芯片上目的基因的熒光信號(hào)，通過計(jì)算機(jī)處理即可給出目的基因的結(jié)構(gòu)或表達(dá)信息。雜交條件的選擇與研究目的有關(guān)，多態(tài)性分析或者基因測(cè)序時(shí)，每個(gè)核苷酸或突變位點(diǎn)都必須檢測(cè)出來。通常設(shè)計(jì)出一套四種寡聚核苷酸，在靶序列上跨越每個(gè)位點(diǎn)，只在中央位點(diǎn)堿基有所不同，根據(jù)每套探針在某一特點(diǎn)位點(diǎn)的雜交嚴(yán)謹(jǐn)程度，即可測(cè)定出該堿基的種類。如果芯片僅用于檢測(cè)基因表達(dá)，只需設(shè)計(jì)出針對(duì)基因中的特定區(qū)域的幾套寡聚核苷酸

26、即可。表達(dá)檢測(cè)需要長的雜交時(shí)間，更高的嚴(yán)謹(jǐn)性，更高的樣品濃度和低溫度，這有利于增加檢測(cè)的特異性和低拷貝基因檢測(cè)的靈敏度。突變檢測(cè)，要鑒別出單堿基錯(cuò)配，需要更高的雜交嚴(yán)謹(jǐn)性和更短的時(shí)間。此外，雜交反應(yīng)還必須考慮雜交反應(yīng)體系中鹽濃度、探針 GC 含量和所帶電荷、探針與芯片之間連接臂的長度及種類、檢測(cè)基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。有資料顯示探針和芯片之間適當(dāng)長度的連接臂可使雜交效率提高 150 倍 9 。連接臂上任何正或負(fù)電荷都將減少雜交效率。由于探針和檢測(cè)基因均帶負(fù)電荷，因此影響他們之間的雜交結(jié)合，為此有人提出用不帶電荷的肽核酸（ PNA ）做探針 9 。雖然 PNA 的制備比較復(fù)雜，但與 DNA 探針比

27、較有許多特點(diǎn)，如不需要鹽離子，因此可防止檢測(cè)基因二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成及自身復(fù)性。由于 PNA-DNA 結(jié)合更加穩(wěn)定和特異，因此更有利于單堿基錯(cuò)配基因的檢測(cè)。六?；蛐酒瑱z測(cè)原理雜交信號(hào)的檢測(cè)是 DNA 芯片技術(shù)中的重要組成部分。以往的研究中已形成許多種探測(cè)分子雜交的方法，如熒光顯微鏡、隱逝波傳感器、光散射表面共振、電化傳感器、化學(xué)發(fā)光、熒光各向異性等等，但并非每種方法都適用于 DNA 芯片。由于 DNA 芯片本身的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)，需要確定雜交信號(hào)在芯片上的位置，尤其是大規(guī)模 DNA 芯片由于其面積小，密度大，點(diǎn)樣量很少，所以雜交信號(hào)較弱，需要使用光電倍增管或冷卻的電荷偶連照相機(jī) (charged-cou

28、pled device camera ， CCD) 攝像機(jī)等弱光信號(hào)探測(cè)裝置。此外，大多數(shù) DNA 芯片雜交信號(hào)譜型除了分布位點(diǎn)以外還需要確定每一點(diǎn)上的信號(hào)強(qiáng)度，以確定是完全雜交還是不完全雜交，因而探測(cè)方法的靈敏度及線性響應(yīng)也是非常重要的。雜交信號(hào)探測(cè)系統(tǒng)主要包括雜交信號(hào)產(chǎn)生、信號(hào)收集及傳輸和信號(hào)處理及成像三個(gè)部分組成。由于所使用的標(biāo)記物不同，因而相應(yīng)的探測(cè)方法也各具特色。大多數(shù)研究者使用熒光標(biāo)記物，也有一些研究者使用生物素標(biāo)記，聯(lián)合抗生物素結(jié)合物檢測(cè) DNA 化學(xué)發(fā)光。通過檢測(cè)標(biāo)記信號(hào)來確定DNA芯片雜交譜型。1熒光標(biāo)記雜交信號(hào)的檢測(cè)方法使用熒光標(biāo)記物的研究者最多，因而相應(yīng)的探測(cè)方法也就最多

29、、最成熟。由于熒光顯微鏡可以選擇性地激發(fā)和探測(cè)樣品中的混合熒光標(biāo)記物，并具有很好的空間分辨率和熱分辨率，特別是當(dāng)熒光顯微鏡中使用了共焦激光掃描時(shí)，分辨能力在實(shí)際應(yīng)用中可接近由數(shù)值孔徑和光波長決定的空間分辨率，而在傳統(tǒng)的顯微鏡是很難做到的，這便為DNA芯片進(jìn)一步微型化提供了重要的檢測(cè)方法的基礎(chǔ)。大多數(shù)方法都是在人射照明式熒光顯微鏡（epifluoescence microscope）基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，包括激光掃描熒光顯微鏡、激光共焦掃描顯微鏡、使用了 CCD 相機(jī)的改進(jìn)的熒光顯微鏡以及將 DNA 芯片直接制作在光纖維束切面上并結(jié)合熒光顯微鏡的光纖傳感器微陣列。這些方法基本上都是將待雜交對(duì)象 以熒

30、光物質(zhì)標(biāo)記，如熒光素或麗絲膠（lissamine）等，雜交后經(jīng)過 SSC 和 SDS 的混合溶液或 SSPE 等緩沖液清洗。（1）激光掃描熒光顯微鏡探測(cè)裝置比較典型。方法是將雜交后的芯片經(jīng)處理后固定在計(jì)算機(jī)控制的二維傳動(dòng)平臺(tái)上，并將一物鏡置于其上方，由氬離子激光器產(chǎn)生激發(fā)光經(jīng)濾波后通過物鏡聚焦到芯片表面，激發(fā)熒光標(biāo)記物產(chǎn)生熒光，光斑半徑約為 5 10m 。同時(shí)通過同一物鏡收集熒光信號(hào)經(jīng)另一濾波片濾波后，由冷卻的光電倍增管探測(cè)，經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換板轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)。通過計(jì)算機(jī)控制傳動(dòng)平臺(tái) X Y 方向上步進(jìn)平移， DNA 芯片被逐點(diǎn)照射，所采集熒光信號(hào)構(gòu)成雜交信號(hào)譜型，送計(jì)算機(jī)分析處理，最后形成 20m

31、象素的圖像。這種方法分辨率高、圖像質(zhì)量較好，適用于各種主要類型的 DNA 芯片及大規(guī)模 DNA 芯片雜交信號(hào)檢測(cè)，廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)、基因診斷等方面研究。（2） 激光掃描共焦顯微鏡激光掃描共焦顯微鏡與激光掃描熒光顯微鏡結(jié)構(gòu)非常相似，但是由于采用了共焦技術(shù)因而更具優(yōu)越性。這種方法可以在熒光標(biāo)記分子與 DNA 芯片雜交的同時(shí)進(jìn)行雜交信號(hào)的探測(cè)，而無須清洗掉未雜交分子，從而簡(jiǎn)化了操作步驟大大提高了工作效率。 Affymetrix 公司的 S P A Forder 等人設(shè)計(jì)的 DNA 芯片即利用此方法。其方法是將靶 DNA 分子溶液放在樣品地中，芯片上合成寡核苷酸陣列的一面向下，與樣品池溶液直接接觸，

32、并與 DNA 樣品雜交。當(dāng)用激發(fā)光照射使熒光標(biāo)記物產(chǎn)生熒光時(shí)，既有芯片上雜交的 DNA 樣品所發(fā)出的熒光，也有樣品地中 DNA 所發(fā)出的熒光，如何將兩者分離開來是一個(gè)非常重要的問題。而共焦顯微鏡具有非常好的縱向分辨率，可以在接受芯片表面熒光信號(hào)的同時(shí)，避開樣品池中熒光信號(hào)的影響。一般采用氬離子激光器（ 488nm ）作為激發(fā)光源，經(jīng)物鏡聚焦，從芯片背面入射，聚集于芯片與靶分子溶液接觸面。雜交分子所發(fā)的熒光再經(jīng)同一物鏡收集，并經(jīng)濾波片濾波，被冷卻的光電倍增管在光子計(jì)數(shù)的模式下接收。經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換反轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)送微機(jī)處理，成像分析。在光電信增管前放置一共焦小孔，用于阻擋大部分激發(fā)光焦平面以外的來自樣

33、品池的未雜交分子熒光信號(hào)，避免其對(duì)探測(cè)結(jié)果的影響。激光器前也放置一個(gè)小孔光闌以盡量縮小聚焦點(diǎn)處光斑半徑，使之能夠只照射在單個(gè)探針上。通過計(jì)算機(jī)控制激光束或樣品池的移動(dòng)，便可實(shí)現(xiàn)對(duì)芯片的二維掃描，移動(dòng)步長與芯片上寡核苷酸的間距匹配，在幾分鐘至幾十分鐘內(nèi)即可獲得熒光標(biāo)記雜交信號(hào)圖譜。其特點(diǎn)是靈敏度和分辨率較高，掃描時(shí)間長，比較適合研究用?，F(xiàn)在 Affymetrix 公司已推出商業(yè)化樣機(jī)，整套系統(tǒng)約 12 萬美元。（3）采用了 CCD 相機(jī)的熒光顯微鏡 這種探測(cè)裝置與以上的掃描方法都是基于熒光顯微鏡，但是以 CCD 相機(jī)作為信號(hào)接收器而不是光電倍增管，因而無須掃描傳動(dòng)平臺(tái)。由于不是逐點(diǎn)激發(fā)探測(cè)，因而

34、激發(fā)光照射光場(chǎng)為整個(gè)芯片區(qū)域，由 CCD 相機(jī)獲得整個(gè) DNA 芯片的雜交譜型。這種方法一般不采用激光器作為激發(fā)光源，由于激光束光強(qiáng)的高斯分布，會(huì)使得光場(chǎng)光強(qiáng)度分布不均，而熒光信號(hào)的強(qiáng)度與激發(fā)光的強(qiáng)度密切相關(guān)，因而不利于信號(hào)采集的線性響應(yīng)。為保證激發(fā)光勻場(chǎng)照射，有的學(xué)者使用高壓汞燈經(jīng)濾波片濾波，通過傳統(tǒng)的光學(xué)物鏡將激發(fā)光投射到芯片上，照明面積可通過更換物鏡來調(diào)整；也有的研究者使用大功率弧形探照燈作為光源，使用光纖維束與透鏡結(jié)合傳輸激發(fā)光，并與芯片表面呈 50o 角入射。由于采用了 CCD 相機(jī)，因而大大提高了獲取熒光圖像的速度，曝光時(shí)間可縮短至零點(diǎn)幾秒至十幾秒。其特點(diǎn)是掃描時(shí)間短，靈敏度和分辨

35、率較低，比較適合臨床診斷用 14 .（4）光纖傳感器有的研究者將 DNA 芯片直接做在光纖維束的切面上（遠(yuǎn)端），光纖維束的另一端（近端）經(jīng)特制的耦合裝置耦合到熒光顯微鏡中。光纖維束由 7 根單模光纖組成。每根光纖的直徑為 200m ，兩端均經(jīng)化學(xué)方法拋光清潔?；瘜W(xué)方法合成的寡核苷酸探針共價(jià)結(jié)合于每根光纖的遠(yuǎn)端組成寡核苷酸陣列。將光纖遠(yuǎn)端浸入到熒光標(biāo)記的靶分子溶液中與靶分子雜交，通過光纖維束傳導(dǎo)來自熒光顯微鏡的激光（ 490urn ），激發(fā)熒光標(biāo)記物產(chǎn)生熒光，仍用光纖維束傳導(dǎo)熒光信號(hào)返回到熒光顯微鏡，由 CCD 相機(jī)接收。每根光纖單獨(dú)作用互不干擾，而溶液中的熒光信號(hào)基本不會(huì)傳播到光纖中，雜交到光

36、纖遠(yuǎn)端的靶分子可在 90 的甲酸胺（ formamide ）和 TE 緩沖液中浸泡 10 秒鐘去除，進(jìn)而反復(fù)使用。這種方法快速、便捷，可實(shí)時(shí)檢測(cè) DNA 微陣列雜交情況而且具有較高的靈敏度，但由于光纖維束所含光纖數(shù)目有限，因而不便于制備大規(guī)模 DNA 芯片，有一定的應(yīng)用局限性。2. 生物素標(biāo)記方法中的雜交信號(hào)探測(cè)以生物素（ biotin ）標(biāo)記樣品的方法由來已久，通常都要聯(lián)合使用其它大分子與抗生物素的結(jié)合物（如結(jié)合化學(xué)發(fā)光底物酶、熒光素等），再利用所結(jié)合大分子的特殊性質(zhì)得到最初的雜交信號(hào)，由于所選用的與抗生物素結(jié)合的分子種類繁多，因而檢測(cè)方法也更趨多樣化。特別是如果采用尼龍膜作為固相支持物，直

37、接以熒光標(biāo)記的探針用于 DNA 芯片雜交將受到很大的限制，因?yàn)樵谀猃埬ど蠠晒鈽?biāo)記信號(hào)信噪比較低。因而使用尼龍膜作為固相支持物的這些研究者大多是采用生物素標(biāo)記的。目前應(yīng)用較多的是美國 General Scanning 公司開發(fā)的基因芯片專用檢測(cè)系統(tǒng) (ScanArray 3000) ，采用激光共聚焦掃描原理進(jìn)行熒光信號(hào)采集，由計(jì)算機(jī)處理熒光信號(hào)，并對(duì)每個(gè)點(diǎn)的熒光強(qiáng)度數(shù)字化后進(jìn)行分析。近期又開發(fā)出了 ScanArray 5000 ，其掃描精度和功能有較大的提高。 七 結(jié)果的分析樣品在被測(cè)定前，首先要經(jīng)過消化，使待測(cè)組織細(xì)胞中的DNA或RNA釋放出來，在經(jīng)過適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增后，以熒光標(biāo)記物標(biāo)記，放入基因芯

38、片自動(dòng)孵育裝置（Fluidics Station）中，由其自動(dòng)控制反應(yīng)的時(shí)間、溫度以及緩沖液的配比等反應(yīng)條件，進(jìn)行雜交，這一過程，僅需要數(shù)秒鐘。雜交完成后，要對(duì)基因芯片進(jìn)行“讀片”，即應(yīng)用激光共聚焦熒光掃描顯微鏡，對(duì)基因芯片表面的每個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。這種顯微鏡，將聚焦的平面設(shè)定為芯片的表面，因此可以檢測(cè)結(jié)合到芯片表面位點(diǎn)的樣品片斷的熒光標(biāo)記，而待測(cè)樣品中未與芯片上探針結(jié)合的熒光標(biāo)記物，則懸浮于溶液中，由于不在聚焦平面上，因而不被檢測(cè)。樣品與探針的錯(cuò)配是影響雜交反應(yīng)結(jié)果的重要因素，但由于樣品與芯片上的探針正確配對(duì)時(shí)產(chǎn)生的熒光信號(hào)要比錯(cuò)配時(shí)強(qiáng)的多，因此，通過對(duì)信號(hào)強(qiáng)度的分析，就可以區(qū)分正確與錯(cuò)誤的配

39、對(duì)。 為了使結(jié)果的檢驗(yàn)更加簡(jiǎn)便和快速，Affymetrix 的基因芯片的分析系統(tǒng)中采用了基因陣列掃描儀和專用的基因芯片工作站，對(duì)一幅包含數(shù)萬個(gè)探針位點(diǎn)的基因芯片圖樣的分析，僅需要數(shù)分鐘的時(shí)間。這樣在短短的幾十分鐘至數(shù)小時(shí)內(nèi)，就可以完成用傳統(tǒng)方法需要數(shù)月才能完成的幾萬乃至幾十萬次雜交分析試驗(yàn)。八?；蛐酒膽?yīng)用（一）基因表達(dá)分析基因芯片具有高度的敏感性和特異性，它可以監(jiān)測(cè)細(xì)胞中幾個(gè)至幾千個(gè) mRNA 拷貝的轉(zhuǎn)錄情況。與用單探針分析 mRNA 的點(diǎn)雜交技術(shù)不同，基因芯片表達(dá)探針陣列應(yīng)用了大約 20 對(duì)寡核苷酸探針來監(jiān)測(cè)每一個(gè) mRNA 的轉(zhuǎn)錄情況。每對(duì)探針中，包含一個(gè)與所要監(jiān)測(cè)的 mRNA 完全吻

40、合和一個(gè)不完全吻合的探針（圖 2 ），這兩個(gè)探針的差別在于其中間位置的核苷酸不同。這種成對(duì)的探針可以將非特異性雜交和背景訊號(hào)減小到最低的水平，由此我們就可以確定那些低強(qiáng)度的 mRNA 。目前， Affymetrix 公司已經(jīng)生產(chǎn)出 HugeneFL 、 Mu6500 （含有小鼠 6500 個(gè)基因）、 Ye6100 （含有酵母 6100 個(gè)基因）等基因芯片成品。1、分析基因表達(dá)時(shí)空特征。英國劍橋大學(xué) Whitehead 研究所的 Frank C.P. Holstege 等人，應(yīng)用含有酵母基因組的基因芯片，深入研究了真核細(xì)胞基因組的調(diào)節(jié)周期。應(yīng)用基因組水平的表達(dá)分析，監(jiān)測(cè)那些表達(dá)受轉(zhuǎn)錄起始機(jī)制的關(guān)

41、鍵成分控制的基因，發(fā)現(xiàn) RNA 聚合酶 II 、主要的轉(zhuǎn)錄因子 TFIID 和 SAGA 染色體修飾復(fù)合物等均在基因的表達(dá)中有自己特定的作用位點(diǎn) 15 。通過本試驗(yàn)，研究人員揭示了：（1）基因特異性的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)表達(dá)的調(diào)控作用。（2）細(xì)胞在缺乏營養(yǎng)的環(huán)境中，基因不同位點(diǎn)的協(xié)同調(diào)節(jié)作用的全新機(jī)制。（3）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的最終作用位點(diǎn)，在最初的幾步中就可以確定。以此試驗(yàn)為基礎(chǔ)，研究人員進(jìn)一步繪制出了酵母基因組控制圖，并由此分析出了各種調(diào)節(jié)因子在基因上不同的作用位點(diǎn)和其作用的分子機(jī)制。 美國 Stanford 大學(xué)的 V.R.Iyer 等人 16 ，對(duì)成纖維細(xì)胞中與細(xì)胞增生和損傷修復(fù)有關(guān)的基因進(jìn)行了分析。

42、首先，他們用成纖維細(xì)胞中的 8600 個(gè)基因片斷制成基因芯片的探針陣列，通過與 mRNA 反轉(zhuǎn)錄形成的 cDNA 的雜交反應(yīng)，可以判斷出該基因的活性。在試驗(yàn)中，成纖維細(xì)胞被置于無營養(yǎng)的環(huán)境中，使絕大部分基因的活性關(guān)閉，兩天后，加入 10% 的血清， 24 小時(shí)內(nèi)，分 6 個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)，觀察基因的活化情況。試驗(yàn)結(jié)果表明，在所有被監(jiān)測(cè)的基因中，約有 500 個(gè)基因最為活躍，而使細(xì)胞保持不分裂狀態(tài)的基因活性被抑制。其中，最早被活化的是那些轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因。在活化的基因中，有 28 個(gè)基因共同作用，控制細(xì)胞的增殖； 8 個(gè)與免疫反應(yīng)的激活有關(guān)； 19 個(gè)與血管重建有關(guān)；另有許多基因，與血管新生密切相關(guān)。

43、在腫瘤細(xì)胞中，基因的表達(dá)與正常的細(xì)胞存在著明顯的差異。通過基因芯片繪出基因表達(dá)的時(shí)空?qǐng)D譜，有助于人類認(rèn)識(shí)生命活動(dòng)過程和特征。2、基因差異表達(dá)檢測(cè) 17生命活動(dòng)中基因表達(dá)的改變是生物學(xué)研究的核心問題。理解人類基因組中 10 萬個(gè)不同的基因功能，監(jiān)測(cè)某些組織、細(xì)胞不同分化階段的差異基因表達(dá)（ differential gene expression ， DGE ）十分重要。對(duì)差異表達(dá)的研究，可以推斷基因與基因的相互關(guān)系，細(xì)胞分化中基因“開啟”或“關(guān)閉”的機(jī)制；揭示基因與疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸的內(nèi)在聯(lián)系。目前 DGE 研究方法主要有表達(dá)序列標(biāo)簽（ ESTs ）測(cè)序、差減克?。?subtractive

44、 cloning ）、差異顯示（ differential display ）、基因表達(dá)系列分析 (serial analysis of gene expression, SAGE) 。而 cDNA 微陣列雜交技術(shù)可監(jiān)測(cè)大量 mRNA 的轉(zhuǎn)錄，直接快速地檢測(cè)出極其微量的 mRNA ，且易于同時(shí)監(jiān)測(cè)成千上萬的基因，是研究基因功能的重要手段之一。 Rihn BH 等利用基因芯片檢測(cè)胸膜間皮瘤與正常細(xì)胞間比較了 6500 個(gè)基因，發(fā)現(xiàn)了 300 多個(gè)差異基因的表達(dá)。其中幾個(gè)典型基因的表達(dá)經(jīng) RT-PCR 進(jìn)行定量后，可作為胸膜間皮瘤診斷的標(biāo)記物（ Markers ） 18 。 Sgroi 19 報(bào)告

45、 DNA 芯片結(jié)合激光捕獲顯微切割技術(shù)（ laser capture microdissection ）用于乳癌浸潤期和轉(zhuǎn)移期及正常細(xì)胞的基因表達(dá)譜（ gene expression profiles ）差異研究，結(jié)果被定量 PCR 和免疫組化所證實(shí)。差異表達(dá)有助于早期發(fā)現(xiàn)瘤細(xì)胞 3 萬個(gè)基因與正常細(xì)胞的區(qū)別，有助于了解瘤細(xì)胞的發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移和藥敏。最近，美國毒物化學(xué)研究所（ CIIT ） 和國家環(huán)境健康科學(xué)研究所（ NIEHS ）正計(jì)劃在一張玻片上建立 8 700 個(gè)小白鼠 cDNA 芯片，用于肝癌的研究。我國也已成功研制出能檢出 41000 種基因表達(dá)譜的芯片。美國 Stanford 大

46、學(xué)的 David Botstein 利用 cDNA 微陣列芯片，對(duì)乳腺癌細(xì)胞的基因表達(dá)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其基因表達(dá)水平明顯低于正常細(xì)胞。利用基因芯片對(duì)表達(dá)進(jìn)行分析，在一次試驗(yàn)中可以獲取相當(dāng)于在 60 余萬次傳統(tǒng)的 Northern 雜交中所獲得的關(guān)于基因表達(dá)的信息。通過這種實(shí)驗(yàn)方法，可以建立一種全新的腫瘤分類學(xué)方法，即依據(jù)每個(gè)腫瘤細(xì)胞中的基因表達(dá)情況對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分類?；蛐酒夹g(shù)在分析基因的表達(dá)中具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)。 3、發(fā)現(xiàn)新基因Moch 等利用腫瘤微陣列芯片（5184 個(gè) cDNA 片段）發(fā)現(xiàn)了腎細(xì)胞癌的腫瘤標(biāo)志物基因，并于正常細(xì)胞進(jìn)行比較。在532份標(biāo)本中檢測(cè)到胞漿纖維Vimentin

47、的表達(dá)基因，陽性率為 51% 61% 20 。追蹤觀察，有Vimentin 表達(dá)的患者，預(yù)后極差。人類大量 ESTs 給 cDNA 微陣列提供了豐富的資源，數(shù)據(jù)庫中 400000 個(gè) ESTs 代表了所有人類基因，成千上萬的 ESTs 微陣列將為人類基因表達(dá)研究提供強(qiáng)有力的分析工具。這將大大地加速人類基因組的功能分析 21 。定量檢測(cè)大量基因表達(dá)水平在闡述基因功能、探索疾病原因及機(jī)理、發(fā)現(xiàn)可能的診斷及治療靶等方面是很有價(jià)值的。如該技術(shù)在炎癥性疾病類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（ RA ）和炎癥性腸?。?IBD ）的基因表達(dá)研究中，由 RA 或 IBD 組織制備探針，用 Cy3 和 Cy5 熒光素標(biāo)記，然后與靶

48、 cDNA 微陣列雜交，可檢測(cè)出炎癥疾病誘導(dǎo)的基因如 TNF- 、 IL 或粒細(xì)胞集落刺激因子，同時(shí)發(fā)現(xiàn)一些以前未發(fā)現(xiàn)的基因如 HME 基因和黑色素瘤生長刺激因子。 Schena 等人 22 報(bào)道了 cDNA 的微陣列在人類基因表達(dá)監(jiān)測(cè)、生物學(xué)功能研究和基因發(fā)現(xiàn)方面的應(yīng)用。采用含 1,046 個(gè)已知序列的 cDNA 微陣列，用高速機(jī)器人噴印在玻片上，用雙色雜交法定量監(jiān)測(cè)不同基因表達(dá)，在一定的實(shí)驗(yàn)條件下，不同表達(dá)模式的陣列成分通過序列分析鑒定其特征。該方法較以往常用的方法敏感 10 倍以上，檢測(cè)限度為 1:500,000(wt/wt) 總?cè)梭w mRNA 。在培養(yǎng) T 細(xì)胞熱休克反應(yīng)的測(cè)定中，發(fā)現(xiàn)

49、 17 個(gè)陣列成分的熒光比較明顯改變，其中 11 個(gè)受熱休克處理的誘導(dǎo)， 6 個(gè)呈現(xiàn)中度抑制，對(duì)相應(yīng)于 17 個(gè)陣列成分的 cDNA 測(cè)序發(fā)現(xiàn) 5 個(gè)表達(dá)最高的成分是 5 種熱休克蛋白， 17 個(gè)克隆中發(fā)現(xiàn) 3 個(gè)新序列。另外，在佛波酯誘導(dǎo)檢測(cè)中 23 ，發(fā)現(xiàn)有 6 個(gè)陣列成分信號(hào)增強(qiáng)超過 2 倍，測(cè)序及數(shù)據(jù)庫比較揭示有 5 個(gè)已知的，誘導(dǎo)表達(dá)最高的兩個(gè)是 PCA-1 酪氨酸磷酸酶和核因子 - B1 ，有一個(gè)是未知的。這 4 個(gè)新基因的表達(dá)水平均相對(duì)較低，僅呈現(xiàn) 2 倍的誘導(dǎo)。 Northern 雜交結(jié)果證實(shí)了微陣列的結(jié)果。進(jìn)一步檢測(cè)了人的骨髓、腦、前列腺及心臟組織中熱休克和佛波酯調(diào)節(jié)基因的表

50、達(dá)， 4 種組織中檢測(cè)出 15 種熱休克和佛波酯調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，其表達(dá)水平與 Jurkat 細(xì)胞中相應(yīng)成分的表達(dá)水平密切相關(guān)如在四種組織中表達(dá)水平最高的兩個(gè)基因 -actin 和細(xì)胞色素 C 氧化酶在 Jurkat 細(xì)胞中的表達(dá)水平也很高。上述實(shí)驗(yàn)提示在缺乏任何序列信息的條件下，微陣列可用于基因發(fā)現(xiàn)和基因表達(dá)檢測(cè)。目前，大量人類 ESTs 給 cDNA 微陣列提供了豐富的資源，數(shù)據(jù)庫中 400,000 個(gè) ESTs 代表了所有人類基因，成千上萬的 ESTs 微陣列將為人類基因表達(dá)研究提供強(qiáng)有力的分析工具。這將大大地加速人類基因組的功能分析。4、大規(guī)模 DNA 測(cè)序人類基因組計(jì)劃的實(shí)施促進(jìn)了高效

51、的、自動(dòng)化操作的測(cè)序方法的發(fā)展。芯片技術(shù)中雜交測(cè)序（ sequencing by hybridization, SBH ）技術(shù)及鄰堆雜交（ contiguous stacking hybridization, CSH ）技術(shù)即是一種新的高效快速測(cè)序方法 24-26 。用含 65 536 個(gè) 8 聚寡核苷酸的微陣列，采用 SBH 技術(shù)，可測(cè)定 200 bp 長 DNA 序列，采用 67 108 864 個(gè) 13 聚寡核苷酸的微陣列，可對(duì)數(shù)千個(gè)堿基長的 DNA 測(cè)序。 SBH 技術(shù)的效率隨著微陣列中寡核苷酸數(shù)量與長度的增加而提高，但微陣列中寡核苷酸數(shù)量與長度的增加則提高了微陣列的復(fù)雜性，降低了雜交

52、準(zhǔn)確性。 CSH 技術(shù)彌補(bǔ)了 SBH 技術(shù)存在的弊端， CSH 技術(shù)的應(yīng)用增加了微陣列中寡核苷酸的有效長度，加強(qiáng)了序列準(zhǔn)確性，可進(jìn)行較長的 DNA 測(cè)序。計(jì)算機(jī)模擬論證了 8 聚寡核苷酸微陣列與 5 聚寡核苷酸鄰堆雜交，相當(dāng)于 13 聚寡核苷酸微陣列的作用，可測(cè)定數(shù)千個(gè)核苷酸長的 DNA 序列 26 。 Dubiley 等人 26 將合成的 10 聚寡核苷酸固定于排列在載片表面的 0.1 × 0.1 × 0.02mm 或 1 × 1 × 0.02mm 聚丙酰胺凝膠墊上制備聚寡核苷酸微陣列，先用分離微陣列（ fractionation chips ）進(jìn)行單

53、鏈 DNA 分離，再用測(cè)序微陣列（ sequencing chips ）分析序列，后者聯(lián)合采用了 10 聚寡核苷酸微陣列的酶促磷酸化、 DNA 雜交及與鄰堆的 5 聚寡核苷酸連接等技術(shù)。該方法可用于含重復(fù)序列及較長序列的 DNA 序列測(cè)定及不同基因組同源區(qū)域的序列比較。利用基因芯片測(cè)序的準(zhǔn)確率達(dá) 99% 以上。正如 NIH 首腦 Harold Varmus 在美國細(xì)胞生物學(xué) 1998 年年會(huì)上所說： “ 在基因芯片的幫助下，我們將能夠監(jiān)測(cè)一個(gè)細(xì)胞乃至整個(gè)組織中所有基因的行為。 ”（二）基因型、基因突變和多態(tài)性分析在同一物種不同種群和個(gè)體之間，有著多種不同的基因型，而這種不同，往往與個(gè)體的不同性

54、狀和多種遺傳性疾病有著密切的關(guān)系。通過對(duì)大量具有不同性狀的個(gè)體的基因型進(jìn)行比較，就可以得出基因與性狀的關(guān)系。但是，由于大多數(shù)性狀和遺傳性疾病是由多個(gè)基因同時(shí)決定的，因此分析起來就十分困難，然而基因芯片技術(shù)恰恰解決了這一問題，利用其可以同時(shí)反應(yīng)數(shù)千甚至更多個(gè)基因的特性，我們就可以分析基因組中不同基因與性狀或疾病的關(guān)系。美國 Stanford 大學(xué)的 E.A.Winzeler 等 27 ，以兩種不同菌株的酵母（ S96 和 YJM789 ）作為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)控制酵母對(duì)放線菌酮的抗藥性的基因進(jìn)行分析。將含有酵母 150 000 個(gè) DNA 片斷的基因芯片分別與這兩株酵母活化轉(zhuǎn)錄的 mRNA 分子雜交，

55、 S96 幾乎全部吻合，而 YJM789 與芯片上的探針組存在較大的差異，約有 3000 個(gè)位點(diǎn)沒有雜交顯色。由于 S96 對(duì)放線菌酮有抗藥性而 YJM789 的抗藥性則弱的多，因此可以判定控制這一抗藥性的基因的所在。而后，通過對(duì) S96 和 YJM789 雜交后產(chǎn)生的抗藥子代的遺傳標(biāo)記的分析，進(jìn)一步確定，控制該抗藥性的基因位于 15 號(hào)染色體，是一長約 57 000 個(gè)堿基的片斷。美國國家人類基因組研究室的 J.G.Hacia 等在 Fodor 研究小組的協(xié)助下 28 ，將基因芯片應(yīng)用于雙色突變分析。他們的分析對(duì)象是與人類遺傳性乳腺癌和卵巢癌密切相關(guān)的 BRCA1 基因的外顯子 11 。在擴(kuò)

56、增后，將 BRCA1 基因的外顯子 11 置于含有熒光素 -12-UTP 的環(huán)境中進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，而后將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的 mRNA 與 BRCA1 外顯子 11 芯片雜交， 4 小時(shí)后，用藻紅蛋白染色。在觀察時(shí)，用 488nm 的氬離子激光進(jìn)行掃描，熒光染色位點(diǎn)呈現(xiàn)綠色，而藻紅蛋白染色的位點(diǎn)呈現(xiàn)紅色。應(yīng)用雙色分析，可以更為清楚的監(jiān)測(cè)未知樣品與標(biāo)準(zhǔn)鏈之間的競(jìng)爭(zhēng)性雜交情況，進(jìn)而分析該基因中的不同突變。通過對(duì) 15 名患者 BRCA1 基因的觀察，有 14 名患者在外顯子 11 位點(diǎn)存在不同的突變。 Hacia 等 29 在 1.28 cm×1.28 cm 的芯片上固定了 9.66×

57、104 個(gè)長度為 20 nt 的寡核苷酸探針，用于檢測(cè)乳腺癌基因 BRCA1 的 exon11 (3.45 kb) 中所有可能的堿基置換、插入和缺失 (1 5 bp) 突變。針對(duì)每一個(gè)位點(diǎn)，共有 28 個(gè)獨(dú)立的探針， 14 個(gè)針對(duì)有義鏈， 14 個(gè)針對(duì)反義鏈。 14 個(gè)探針包括 2 個(gè)野生型， 3 個(gè)堿基置換、 4 個(gè)插入突變、 5 個(gè)堿基缺失。在 15 例患者樣品中，發(fā)現(xiàn)有 14 例有基因突變，類型包括點(diǎn)突變、插入及缺失等；在 20 例對(duì)照樣品中均未檢出假陽性結(jié)果，結(jié)果表明 DNA 芯片技術(shù)可快速、準(zhǔn)確地研究大量患者樣品中特定基因所有可能的雜合變。 Cronin 等 30 分別用兩種 DNA

58、 芯片檢測(cè)囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié) (CFTR) 的突變，其中一個(gè)芯片包含 1 480 個(gè)探針，檢測(cè)了 CFTR 基因的第 10 和 11 外顯子的已知突變，包括缺失、插入和單堿基置換，并分析了 10 個(gè)未知樣品的 CFTR 基因，其結(jié)果與 PCR-RELP 的分析結(jié)果完全一致。Guo 等人 31 利用結(jié)合在玻璃支持物上的等位基因特異性寡核苷酸（ ASOs ）微陣列建立了簡(jiǎn)單快速的基因多態(tài)性分析方法。將 ASOs 共價(jià)固定于玻璃載片上，采用 PCR 擴(kuò)增基因組 DNA ，其一條引物用熒光素標(biāo)記，另一條引物用生物素標(biāo)記，分離兩條互補(bǔ)的 DNA 鏈，將熒光素標(biāo)記 DNA 鏈與微陣列雜交，通過熒光掃描檢測(cè)雜交模式，即可測(cè)定 PCR 產(chǎn)物存在的多種多態(tài)性，該方法對(duì)人的酪氨酸酶基因等 4 個(gè)外顯子內(nèi)含有的 5 個(gè)單堿基突變進(jìn)行分析，結(jié)果顯示單堿基錯(cuò)配與完全匹配的雜交模式非常易于區(qū)別。這種方法可快速、