人參果膠與半乳凝素

1、人參果膠與半乳凝素 -8 相互作用的構(gòu)效關(guān)系研究果膠是一類存在于植物細(xì)胞壁中的酸性雜多糖 , 具有抗腫瘤、抗病毒、免疫 調(diào)節(jié)等生物活性 , 但其活性機(jī)理并不十分明確。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)果膠能夠結(jié)合 半乳凝素 , 為果膠活性機(jī)理的研究開辟了新的領(lǐng)域。半乳凝素是一類具有高度保守的糖基識(shí)別結(jié)構(gòu)域 (CRD)、并且能特異性結(jié)合B -半乳糖苷的凝集素。半乳凝素家族中的半乳凝素-8(GAL8),作為一種調(diào)節(jié)細(xì)胞 粘附性的因子參與多種生理和病理過(guò)程。GAL8的過(guò)量表達(dá)會(huì)引起一些疾病。例如,在某些癌癥中高表達(dá)的GAL8可以 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和血管的生成。但目前關(guān)于GAL8的抑制劑/調(diào)節(jié)劑的研究較少，果膠是否具

2、有抑制或調(diào)節(jié)GAL8的功能至今未見報(bào)道。因此,本論文以人參果膠為研究對(duì)象,探究了果膠與GAL8的相互作用及其構(gòu)效關(guān)系。具體研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下 : 一、不同結(jié)構(gòu)的人參果膠級(jí)分及其片段的制備和 結(jié)構(gòu)分析。 (1) 人參果膠經(jīng)過(guò)離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、果膠酶酶解等方法 處理,得到了 4個(gè)RG-I型果膠級(jí)分和4個(gè)HG型果膠級(jí)分。對(duì)RG-I型果膠級(jí)分2A-Dp進(jìn)行部分酸水解,制備了含有不同側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的3個(gè)RG-I果膠片段。(3)采用高效液相和二維核磁等技術(shù)分析了 2A-Dp及其片段 的結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，2A-Dp中的Ara主要以a -1,5糖苷鍵連接，部分Ara的C3位帶 有分支,Gal以B -1,4糖

3、苷鍵連接。結(jié)構(gòu)片段2A-Dp-4和2A-Dp-12只含有B -1,4-Gal側(cè)鏈。二、果膠類寡糖的制備和結(jié)構(gòu)分析。(1)為了獲得寡聚的B -1,4-Gal側(cè)鏈結(jié)構(gòu),以富含B -1,4-Gal的土豆半乳聚 糖為原料 ,通過(guò)部分酸水解和凝膠過(guò)濾層析 ,制備了聚合度從 2 到 15 的高純度系 列寡聚半乳糖 , 并利用質(zhì)譜和二維核磁鑒定了其結(jié)構(gòu)。 根據(jù)二維核磁結(jié)果 , 總結(jié)了 峰面積隨聚合度變化的規(guī)律。為了獲得同聚半乳糖醛酸片段,以富含a -1,4-GalA的向日葵果膠為原 料,通過(guò)酶解和凝膠過(guò)濾層析 ,制備了聚合度從 2到6的系列寡聚半乳糖醛酸。 三、 不同結(jié)構(gòu)的人參果膠與 GAL8的相互作用的比

4、較。利用紅細(xì)胞凝集阻抑方法分析了各種果膠級(jí)分與GAL8的相互作用，發(fā)現(xiàn)人參果膠級(jí)分可以抑制GAL8與紅細(xì)胞間的作用。并利用生物膜干涉技術(shù)測(cè)定了其 結(jié)合的親合力,發(fā)現(xiàn)果膠能與GAL8結(jié)合,且RG-I型果膠級(jí)分與GAL8作用較強(qiáng)。四、RG-I型果膠與GAL8互作的構(gòu)效關(guān)系。本論文分別從果膠結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié) 構(gòu)的角度分別進(jìn)行了研究。從果膠結(jié)構(gòu)的角度：(1)RG-I型果膠級(jí)分2A-Dp及其三個(gè)結(jié)構(gòu)片段與GAL8的相互作用的研究結(jié)果顯示,Ara在RG-I與GAL8相互作用中幾乎不發(fā)揮作用,Gal 側(cè)鏈?zhǔn)荝G-I與GAL8結(jié)合所必須的結(jié)構(gòu)。分析了 RG-I果膠的側(cè)鏈一一系列寡 聚半乳糖與GAL8的親和力,結(jié)果

5、表明寡聚半乳糖結(jié)合 GAL8的親和力與LacNAc 相當(dāng),RG-I型果膠與GAL8的高親和力是多條寡聚半乳糖側(cè)鏈共同作用的結(jié)果。(3)研究了 RG-I主鏈在互作中的作用，發(fā)現(xiàn)RG-I的主鏈不能與GAL8直接結(jié) 合,主鏈起骨架支撐的作用。從蛋白結(jié)構(gòu)的角度,對(duì)GAL8的截短蛋白和突變體分 別與RG-I果膠級(jí)分2A-Dp的相互作用進(jìn)行了比較研究。(1)乳糖抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,乳糖能夠抑制RG-I果膠與全長(zhǎng)GAL8的結(jié)合,說(shuō) 明二者結(jié)合利用經(jīng)典的 CRD吉構(gòu)域。(2)2A-Dp與GAL8的兩個(gè)截短蛋白(N-CRD C-CRD和兩個(gè)突變體(R69H R233H)的結(jié)合親和力分析結(jié)果顯示，RG-I型果膠既可

6、以結(jié)合在GAL8的N-CRD也可以結(jié)合在C-CRD且結(jié)合在N-CRD勺親和力稍強(qiáng)。乳糖抑制結(jié)果表明,RG-I果膠結(jié)合在GAL8兩端CRD中乳糖結(jié)合位點(diǎn)。五、 RG-I型果膠側(cè)鏈結(jié)構(gòu)與GAL8互作的晶體學(xué)研究。本論文通過(guò)對(duì)共結(jié)晶條件的篩選和優(yōu)化,成功獲得了 GAL8與寡聚半乳糖的 共晶體。利用 X 射線衍射晶體衍射技術(shù)對(duì)共晶體結(jié)構(gòu)解析 , 發(fā)現(xiàn)寡聚半乳糖穩(wěn)定 地結(jié)合在經(jīng)典的乳糖結(jié)合位點(diǎn)。寡聚半乳糖的非還原端 Gal和非還原端第二個(gè)Gal與GAL8的45位Arg,69 位Arg和89位Glu形成了穩(wěn)定的氫鍵。此外,本論文還發(fā)現(xiàn)GAL8的N端結(jié)構(gòu) (GAL8N,1-186aa)在結(jié)合半乳4糖時(shí),N端前導(dǎo)序列形成了新的B折疊結(jié)構(gòu),被命 名為 F-1 。綜上所述 , 本論文以人參果膠作為研究對(duì)象 , 研究了果膠與半乳凝素 -8 相互 作用及其構(gòu)效關(guān)系。首次報(bào)道果膠能結(jié)合并且抑制GAL8;RG-I(而非HG)吉構(gòu)域是 果膠的活性成分 ,RG