MTT法進行活菌計數(shù)的方法學探討

1、MTT 法進行活菌計數(shù)的方法學探討王 栩 , 鄔于川 , 夏世平 , 高 燕 , 李程旭(瀘州醫(yī)學院微生物學與免疫學教研室 , 四川瀘州 646000 摘 要 目的 :建立一種快速 、 穩(wěn)定 、 靈敏并可反映細菌活性的細菌計數(shù)方法 。方法 :以大腸桿菌為研究對象 , 探討 MTT 法用于細菌計數(shù)的可行性及反應時間 、 測量細菌數(shù)量的范圍 、 MTT 的用量 、 是否加入溶解劑等實驗條件 。結果 :細菌數(shù)在 3. 8×1071. 2×109ml 范圍內(nèi)測出的 OD 值與細菌濃度呈良好的正相關 , 反應時間為 20分鐘 ,MTT10l 、 20l 均可 ,20l 效果更佳 。

2、可不用溶解劑 。 結論 :MTT比色分析法可用于檢測活菌數(shù)量 。關鍵詞 MTT 比色法 ; 活菌計數(shù) ; 方法學中圖分類號 R372 文獻標識碼 A 文章編號 1000-2669(2002 04-0291-03 在微生物學 、 免疫學以及其他學科的實驗中 , 常 用一定濃度的活菌作為實驗材料 , 這就涉及到一個 活菌計數(shù)的問題 。 法有比濁法 、 分光光度計測定法 、 涂布法等 。 前兩種操作方法簡單 , 數(shù)量 , 不能判斷細菌的活性 ; 菌數(shù) , 但方法繁瑣 , 重復性較差 , 比色分析法由 M osmann 1(的四甲基偶氮唑鹽 , 而且形成的 量與活細胞數(shù)量成正比關系 。此方法具有簡單

3、、 快 速 、 靈敏 、 穩(wěn)定之特點 , 克服了常規(guī)方法的不足之處 。 MTT 法目前大多用于免疫細胞及其他細胞的活性檢測2, 未見用于細菌等微生物的活性檢測的報道 。本實驗以大腸桿菌為研究對象 , 對 MTT 法用于測量活菌數(shù)的可行性及實驗條件進行了探討 。 1 材料和方法 1. 1 細菌將大腸桿菌的標準菌株 (埃希氏菌 44664, 購于 中國藥品生物制品鑒定所 培養(yǎng)于肉湯管 , 放 37 恒溫箱孵育 1824小時 , 用比濁法定量后 , 倍比稀 釋成 8種濃度 。1. 2 試劑MTT (sigma 溶于 pH7. 4P BS , 濃度 5mg ml , 過濾 除菌 ,4 冰箱避光保存 。

4、 二甲基亞砜 (DMS O 。 1. 3 MTT 比色法測定取不同濃度的大腸桿菌肉湯培養(yǎng)物 , 加入 96孔平底培養(yǎng)板 (美國 Nunc , 每孔 100l , 各做 5個復孔 ,作者簡介 :王 栩 (1974- , 女 , 助教 。按 10l 孔或 20l 孔加入 MTT 溶液 , 放 37 恒溫箱10分鐘 ,20分鐘 ,40分鐘后取出 , 加或不加 DMS O , 570nm 下 , 其生成 量隨活菌數(shù)的增多而增加 , 細菌數(shù)在 3. 8×1071. 2×109ml 范圍內(nèi)與 OD 值成正相關 , 線性良好 , 其相關系數(shù) r =0. 9998, P <0. 01

5、。圖 1 OD 值與細菌數(shù)的關系2. 2 MTT 的量對結果的影響 (圖 2 分別在細菌數(shù)相同的孔中加入 MTT (5mg ml 10l 或 20l , 反應后測 OD 值 , 結果如圖 2所示 , 各孔 OD 值隨 MTT 的量增加而有所增加 , 在測量范圍內(nèi) ,細菌數(shù)與 OD 值均呈正相關 , 但加入的 MTT 量為 20l 時 , 相關性更好 。 MTT 量為 10l , r =0. 9749, P <0. 01;MTT 量為 20l , r =0. 9998, P <0. 01。 2. 3 反應時間對結果的影響 (圖 3在孔中加入 MTT 后 , 用肉眼可觀察到濃度高的兩孔

6、 (1. 2×109ml 和 6×108ml 幾乎立即出現(xiàn)均勻192瀘州醫(yī)學院學報 2002年 第 25卷 第 4期Journal of Luzhou Medical C ollege V ol. 25 N o. 4 2002本頁已使用福昕閱讀器進行編輯。福昕軟件(C2005-2008,版權所有, 僅供試用。的藍紫色 , 放 37 孵箱 10分鐘后取出 , 發(fā)現(xiàn)除前兩孔外 , 后幾孔無明顯變化 , 繼續(xù)放孵箱 20分鐘 、 40分鐘后取出測 OD 值 , 結果如圖 3所示 , 反應 20分 鐘 , 各孔的 OD 值已有明顯的梯度變化 ,OD 值與細 菌數(shù)之間的相關系數(shù) r

7、=0. 9998, P <0. 01; 反應 40分鐘后 , 測出的 OD 值稍有增加 ,OD 值與細菌數(shù)之 間的相關系數(shù)反而降低 (r =0. 9735 。實際測定中 , 反應 20分鐘即可 。圖 2 MTT 的量對 OD 值的影響 圖 3 反應時間對 OD 值的影響2. 4 溶解劑對結果的影響 (圖 4 反應時間終止時 , 肉眼觀察各孔中呈現(xiàn)深淺不同但很均勻的藍紫色 , 倒置顯微鏡 (40× 下觀察 , 有 大團分布均勻的藍紫色顆粒 , 加入 DMS O 后 , 觀察到 顆粒變小 、 變少 , 但 OD 值的測量結果如圖 4所示 , 加入 DMS O 前后 OD 值無顯著差

8、異 。圖 4 溶解劑對 OD 值的影響3 討 論活細胞體內(nèi)的線粒體脫氫酶將淡黃色的 MTT代謝后形成藍紫色的甲月替 , 該物質(zhì)在 560610nm 中 有一個較寬的最大吸收峰 , 用酶標儀可對其進行直接測量 , 其值與活細胞的數(shù)量有良好的線性關系 3。 本實驗對使用酶標儀測定活菌數(shù)量的 MTT 法進行了探索 , 實驗結果表明 : 細菌濃度在 3. 8×1071. 2×109ml 時 ,OD 值與活菌數(shù)呈良好的正相關 。此 測定范圍完全可滿足一般檢測的需要 。 MTT 的量用 10l 或 20l 均可 , 但 MTT 為 20l 時 ,OD 值與活 菌數(shù)間的相關性更好 。 反

9、應時間為 20分鐘時 ,OD 值與細菌濃度呈良好的正相關 , 延長反應時間 , OD 。 加入 MTT 后 , , 孔中呈現(xiàn)均勻的, O 前后 , 結果沒 , 。這點 MTT 比色法有所不 , 可能與原核細胞和真核細胞代謝特點的差異 以及反應時間不同有關 , 有待進一步探討 。綜上所 述 , 我們認為 MTT 比色分析法可用于測量活菌數(shù)量 , 較好的實驗條件為每孔加 MTT (5mg ml 20l ,37 孵育 20分鐘 , 可不加溶解劑 , 在 570nm 波長測 定 OD 值 。此法經(jīng)濟 、 簡便 、 快速 、 穩(wěn)定 、 靈敏度高 , 且測出的為活菌數(shù)量 , 具有傳統(tǒng)細菌計數(shù)法所無法 比擬

10、的優(yōu)點 , 可滿足一般臨床及基礎檢測的需要 。參 考 文 獻1. M osmaan T. C olorimetric assay cellular growth and survival :Application to proliferation and cytotoxityassays J.J Immu 2nolMethods , 1983; 65(1 :552. 李影林 . 中華醫(yī)學檢驗全書 (下卷 M.北京 :人民衛(wèi)生出版社 , 1997; 22123. 薛 彬 . Edeman A , Thorbecke G J. 介紹一種用顏色顯 示法測細胞的生長及增殖 J.北京醫(yī)科大學學報 ,19

11、87; 19(2 :1254. 林忠寧 , 董勝璋等 . MTT 法檢測 T 淋巴細胞增值功能的方法學探討與應用 J.中國衛(wèi)生檢雜志 , 2002; 10(1 :8(2002-02-28收稿 292瀘州醫(yī)學院學報 2002年 第 25卷 第 4期Journal of Luzhou Medical C ollege V ol. 25 N o. 4 2002INQUIRING INTO THE METH OD OF COUNTING LIVE GERM WITH MTTWang Xu , et alDepartment o f Microbiology and ImmunologyAbstract

12、 Objective :To establish a rapid ,steady and sensitive germ counting method that could reflect the germ s activity. Methods :E. coil was em ployed to determine the conditions of assay ,which include the feasibility ,reaction peri 2 ods ,germ s number concentration of MTT and s o on. Re sults :The OD

13、 has a direct relativity with the concentration of germ when the number of the germ is in the period of 3. 8×1071. 2×109ml by reacting with 10or 20l MTT , (20l is better ,without diss olvent matter. Conclusion :MTTcolorimetry could be used to measure the am ount of live germ. K ey w ords M

14、TT colorimetry ; Live germ counting ;Methods重型病毒性肝炎 90例死因分析李葉輝 ,(, 重型病毒性肝炎 (簡稱重肝 , 其病死率在各型肝炎中居首位治各型肝炎 3799例 0. %, 死亡 90例 (占 90% ,1 臨床資料1. 1 一般資料本組 90例死亡患者中 :急性重肝炎 (急重肝 4例 ; 亞急 性重肝肝炎 (亞重肝 60例 ; 慢性重型肝炎 (慢重肝 26例 。 男性 68例 (占 75. 5% , 女性 22例 (占 24. 4% 。男女比例 3. 08:1, 年齡最小 5歲 , 最大 70歲 。診斷 標 準 :1990年 至 1994

15、年 , 按 1990年上海全國病毒性肝炎診斷治療方案 ;1995年至 1998年按 1995年北京病毒性肝炎防治方案確診 。 1. 2 免疫學檢查90例患者凝血酶原時間 (PT 明顯延長 。 H AVIgM 陽性 2例 ;HE VIgM 陽性 2例 ; HC VIgM 陽性 10例 ; 其余 H BsAg 均陽 性 。 其中 4例甲 、 戊肝均重疊感染了乙型肝炎病毒 。肝功 能 :T B1170um ol L 900um ol L (正 常 值 021um ol L , A LT 100U L50例 , 300U L20例 , 其它均異常 (A LT 正常值 0 40U L 。1. 3 并發(fā)癥

16、1種并發(fā)癥者 30例 ;2種并發(fā)癥者 34例 ;3種并發(fā)癥者 26例 。 多數(shù)患者病程中不同程序合并肝性腦病 , 消化道出 血 , 肝腎綜合征 , 腦水腫 , 急性胰腺炎 , 自發(fā)性腹膜炎 , 膽道感 染等 。1. 4 死亡原因直接死于肝性腦病 36例 (占 40% , 死于消化道大出血 9例 (占 10% , 死于腎功衰竭 10例 (占 20% , 死于多種并發(fā) 癥者包括感染 , 自發(fā)性腹膜炎 , 膽道感染 、 腦疝等 27例 (占 30% 。 論重肝最主要死亡原因為肝性腦病 , 肝腎綜合征 , 消化道 出血 , 其次為感染 , 腦疝等 。 并發(fā)肝性腦病 35級及肝腎綜 合征者病死率為 10

17、0%。病原學分析 ,90例死亡重肝中 , 甲 、 戊型肝炎各 2例 (占 2. 22% , 但均重疊感染乙肝病毒 ; 丙肝 10例 (占 11. 1% , 其 中 5例重疊感染乙肝病毒 ; 無重疊感染的乙型炎死亡 78列 。 表明重肝多見于乙型肝炎病毒感染 。肝性腦病是重肝死亡的主要原因 。昏迷程度均為 35級 , 提示昏迷程度越深病死率越高 。 及早給予抗昏迷預防感 染 , 糾正電解質(zhì)紊亂 。 積極防治誘因是重肝治療的重點 。 重肝病人常發(fā)生消化道出血 , 除因門脈高壓為主外 , 亦 有因廣泛胃粘膜糜爛或者因肝性潰瘍出血者 。 對策 :內(nèi)科保 守治療效果有限 , 對大量出血 , 反復出血 , 一般情況尚可者 , 宜盡早外科手術止血 , 否則可配合胃粘膜保護劑及 2受體 阻滯劑等治療 。肝緊綜合征是重肝獨特的綜合征 , 是重肝病人危及生命 的并發(fā)癥之一 。 但治療無理想的方法 。擴血管藥物無明顯 效果 , 透折療法僅適用于某些選擇性病員 , 早期可用甘露醇 , 速尿